이 프로토콜은 빠르고 간단한 방법으로 원유 샘플에서 토포이소머라제 1 활성을 검출하는 롤링 서클 증폭 방법을 보여줍니다. 이 방법의 주요 장점은 경험이 없는 연구자도 쉽게 따를 수 있고 조 추출물을 사용할 때 다른 겔 기반 분석에 비해 더 민감하다는 것입니다. 이 프로토콜의 적용은 약물 치료에 대한 반응 측정에서 잠재적 인 항암 또는 항 감염 질환 효과가있는 소분자 화합물의 스크리닝으로 확장됩니다.
절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 Karol Mizielinski 개발 전문가가 될 것입니다. 시작하려면 맞춤 설계된 실리콘 아이솔레이터 그리드를 기능화된 슬라이드에 부착하여 웰 메이커를 만듭니다. 유리 표면과 실리콘 사이에 기포가 형성되지 않도록 실리콘 그리드를 아래로 누릅니다.
다음으로, 1회 인쇄 완충액에 5개의 마이크로몰, 5개의 프라임 아미노 프라이머를 첨가하여 프라이머 믹스를 준비한다. 그런 다음 이 혼합물 4마이크로리터를 각 웰에 추가하고 웰 메이커를 포화 염화나트륨이 있는 혼성화 챔버에서 배양합니다. 폐쇄 원형 기질을 생성하려면 2 마이크로리터의 5 마이크로몰 토포이소머라제 1 특이적 기질과 2마이크로리터의 재조합 토포이소머라제 1 효소 또는 제조된 세포 추출물을 16마이크로리터의 1회 토포이소머라제 반응 완충액에 첨가합니다.
이 원형 혼합물을 섭씨 37도에서 30 분 동안 배양하고 1 % sds의 2 마이크로 리터를 추가하여 효소 반응을 중지합니다. 웰 메이커를 섭씨 1도에서 예열 된 버퍼 50로 채워진 트레이에 담그십시오. 버퍼를 웰에 피펫팅하여 웰 메이커 내부에 기포가 남아 있지 않은지 확인한 다음 트레이를 섭씨 50도에서 30분 동안 배양합니다.
배양 후, 완충액 1을 제거하고 세척 사이에 1분 동안 격렬하게 흔들면서 증류수로 2회 세척한다. 물을 제거하고 다음으로 섭씨 50도로 예열된 버퍼 2를 트레이에 추가한 다음 버퍼 1에 대해 이전에 설명한 대로 웰 메이커를 배양하고 세척합니다. 그런 다음 웰 메이커를 70 % 에탄올로 1 분 동안 격렬하게 흔들어 씻고 압축 공기를 사용하여 설정을 건조시킵니다.
혼성화를 수행하려면 준비된 원형 혼합물 4마이크로리터를 각 해당 웰에 추가하고 웰 메이커를 섭씨 37도의 증류수가 있는 습도 챔버에 1시간 동안 놓습니다. 배양이 끝나면 웰 메이커를 각각 1분 동안 세척하고 완충액 3, 완충액 4 및 70% 에탄올을 세척한 다음 자연 건조시킵니다. 4 마이크로 리터의 RCA 혼합물을 준비하고 웰 메이커의 각 웰에 첨가하고 습도 챔버에서 섭씨 37도에서 2 시간 동안 배양합니다.
증폭된 형광 롤링 서클 생성물을 현미경으로 시각화하려면 먼저 버퍼 3, 버퍼 4 및 70% 에탄올로 슬라이드를 세척합니다. 압축 공기로 슬라이드를 건조시키고 현미경 슬라이드에 붙입니다. 마커로 우물의 위치를 표시 한 다음 핀셋을 사용하여 실리콘 격자를 제거하십시오.
카메라에서 시각화할 수 있도록 dapi 없이 2마이크로리터의 장착 매체로 슬라이드를 장착하고 커버 유리를 추가합니다. 60x 오일 액침 대물 렌즈와 카메라가 있는 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 분석합니다. 이미징 후 사진을 이미지 J로 가져오고 이미지, 스택 및 스택을 클릭하여 이미지를 스택 한 다음 이미지 유형을 8 비트로 변경하십시오.
임계값을 설정하려면 이미지, 조정, 임계값을 차례로 클릭합니다. 아래쪽 막대를 255로 설정하고 오른쪽 신호만 빨간색이고 배경이 검은색이 되도록 위쪽 막대를 조정합니다. 임계값을 조정하기 전에 개별 이미지를 살펴보고 이미지와 일치하는지 확인합니다.
실제 신호가 사라지기 전에 임계값이 가능한 한 낮게 설정되어 있는지 확인하십시오. 신호를 카운트하려면 분석, 입자 분석을 차례로 클릭하고 이미지 J 설정에서 요약된 필드가 선택되어 있는지 확인합니다. 희석된 4마이크로리터의 말무 퍼옥시다아제-접합된 항-비오틴 항체를 각 웰에 첨가하고 습도 챔버에서 섭씨 15 내지 25도에서 50분 동안 배양한다.
배양이 끝나면 웰 메이커를 버퍼 5로 각각 3 분 동안 3 회 세척하고 건조시킵니다. 화학 발광을 시각화하려면 새로 준비된 ECL 루미놀과 과산화수소 혼합물 2 마이크로 리터를 웰에 추가하고 CCD 카메라 또는 X 선 필름을 사용하여 슬라이드를 시각화합니다. 대안적으로, TMB로 시각화하기 위해, 완충액 5 세척 후에 실리콘 그리드를 제거하고 전체 슬라이드의 상부에 400 마이크로리터의 TMB를 첨가한다.
슬라이드를 습도 챔버에 보관하고 발색을 위해 5-10 분 동안 기다리십시오. 발색 후 슬라이드를 70%tethanol로 세척하고 이미지 J 소프트웨어로 분석을 위해 카메라나 휴대폰으로 슬라이드를 촬영합니다. 사진을 이미지 J로 가져오고 이미지 유형을 클릭 한 다음 8 비트를 클릭하여 이미지 유형을 8 비트로 변경합니다.
도구 모음에서 사각형 그리기 도구를 사용하여 측정 영역을 제한하여 밴드를 개별적으로 측정하고 원하는 영역을 그립니다. 클릭하고 분석을 클릭한 다음 측정을 클릭하여 강도를 측정합니다. 그런 다음 원래 그려진 영역을 다음 밴드로 이동하고 측정합니다.
모든 대역의 강도를 측정한 후 원하는 소프트웨어에 데이터를 플로팅합니다. 형광 스캐너 판독에 의해 결정된 Topoisomerase 1 활성은 정량화로부터 명백한 바와 같이 여기에 묘사되어 있다. 이 판독값은 12.5나노그램의 검출 한계를 가지며, 대표 이미지 및 형광 현미경 판독을 사용하여 얻은 정량화가 여기에 표시됩니다.
이 판독 방법은 0.1 나노그램의 검출 한계를 가지며, 향상된 화학발광 및 컬러 o'metric 판독 방법의 검출 임계값은 6 나노그램이었다. 동일한 판독값을 사용하여 검출 한계는 ECL의 경우 1, 250개 셀, TMB의 경우 312개 셀이었습니다. 토포이소머라제 1의 활성은 대장 선암 유래 세포의 추출물로부터 측정하였다.
약물 스크리닝 적용의 예로서, 토포이소머라제 1 활성을 캄프토테신 또는 디메틸 설폭사이드의 존재 하에 측정하였다. 정량화 결과는 캄프토테신이 예상대로 토포이소머라제 1 매개 기질의 순환화를 억제한다는 것을 보여주었다. 이것은 세척 단계와 반응 배양 시간에만 특별한 주의를 기울이면 되는 간단한 프로토콜입니다.
또한 약물이 토포이소머라제 1 활성을 억제하는 방법을 조사할 수 있으며, Reid를 사용하면 매우 민감하고 수행하기 쉽고, 잠재적인 토포이소머라제 1 억제제를 빠르게 스크리닝할 수 있으며, 토포이소머라제 1 활성을 암에서 약물 반응에 대한 바이오마커로 사용할 수 있습니다.
