Denne protokollen viser en rullende sirkelforsterkningsmetode for å oppdage topoisomerase 1-aktivitet i råprøver på en rask og enkel måte. De viktigste fordelene med denne metoden er at den er lett å følge også av ikke-erfarne forskere, og den er mer følsom sammenlignet med de andre gelbaserte analysene når råekstrakter brukes. Anvendelsen av denne protokollen strekker seg fra måling av responsen på narkotikabehandling, til screening av små molekylforbindelser med potensiell anti-kreft eller anti-smittsomme sykdommer effekt.
Demonstrere prosedyren vil være Karol Mizielinski utviklingsspesialist fra vårt laboratorium. For å begynne, fest et spesialdesignet silikonisolatorgitter til et funksjonalisert lysbilde, og derved lage brønnmakeren. Trykk ned på silikongitteret for å unngå dannelse av luftbobler mellom overflaten av glasset og silikonet.
Deretter klargjør du primerblandingen ved å legge til fem mikromolar, fem prime amino primer i en gangs utskriftsbuffer. Tilsett deretter fire mikroliter av denne blandingen til hver brønn og inkuber brønnmakeren i et hybridiseringskammer med mettet natriumklorid. For å generere lukkede sirkulære substrater, tilsett to mikroliter av fem mikromolar topoisomerase 1 spesifikt substrat og to mikroliter av det rekombinante topoisomerase 1-enzymet eller et fremstilt celleekstrakt til 16 mikroliter engangs topoisomerase-reaksjonsbuffer.
Inkuber denne sirkelblandingen ved 37 grader Celsius i 30 minutter, og stopp enzymreaksjonen ved å tilsette to mikroliter 1% sds. Senk brønnmakeren i et brett fylt med buffer 1, forvarmet ved 50 grader Celsius. Pipetter bufferen inn i brønnene for å sikre at ingen luftbobler forblir inne i brønnmakeren, og inkuber deretter brettet i 30 minutter ved 50 grader Celsius.
Etter inkubasjon, fjern bufferen 1 og vask to ganger med destillert vann med kraftig risting i ett minutt mellom vaskene. Fjern vannet, tilsett deretter buffer 2, forvarmet ved 50 grader Celsius i brettet, og inkuber og vask brønnmakeren som vist tidligere for buffer 1. Vask deretter brønnmakeren med 70% etanol, med kraftig risting i ett minutt og bruk trykkluft for å la oppsettet tørke.
For å utføre hybridisering, tilsett fire mikroliter av den forberedte sirkelblandingen til hver tilsvarende brønn og plasser brønnmakeren i et fuktighetskammer med destillert vann ved 37 grader Celsius i en time. På slutten av inkubasjonen, vask brønnmakeren i ett minutt hver og buffer 3, buffer 4 og 70% etanol, og la den lufttørke. Forbered og tilsett fire mikroliter av RCA-blandingen til hver brønn i brønnmakeren, og inkuber ved 37 grader Celsius i to timer i fuktighetskammeret.
For å mikroskopisk visualisere de forsterkede fluorescerende rullesirkelproduktene, vask først lysbildet med buffer 3, buffer 4 og 70% etanol. Tørk lysbildet med trykkluft og lim det på et mikroskopglass. Merk plasseringen av brønnene med en markør og fjern deretter silikongitteret ved hjelp av pinsett.
For å tillate visualisering i kameraet, monter lysbildet med to mikroliter monteringsmedium uten dapi og legg til et dekselglass. Analyser lysbildet ved hjelp av et fluorescensmikroskop, med en 60x olje nedsenking objektivlinse og et kamera. Etter avbildning, importer bildene til bilde J og stable bildene ved å klikke på Bilde, deretter Stabler og bilder til stakk, og endre deretter bildetypen til 8 bit.
For å stille inn terskelen, klikk på Bilde, Juster og deretter Terskel. Sett den nedre linjen til 255 og juster den øvre linjen slik at bare de riktige signalene er røde og bakgrunnen er svart. Bla gjennom de enkelte bildene og sørg for at de samsvarer med bildene før du justerer terskelen.
Sørg for at terskelen er satt så lavt som mulig før de reelle signalene begynner å forsvinne. For å telle signalene, klikk Analyser, etterfulgt av Analyser partikler og sørg for at det summerte feltet i bildet J-innstillingene er merket av. Tilsett fire mikroliter fortynnet heste reddik peroksidase-konjugert anti-biotin antistoff til hver brønn og inkubere ved 15 til 25 grader Celsius i 50 minutter i fuktighetskammeret.
På slutten av inkubasjonen, vask brønnmakeren tre ganger med buffer 5 i tre minutter hver og la den tørke. For å visualisere kjemiluminescensen, tilsett to mikroliter nytilberedt ECL-luminol og hydrogenperoksidblanding til brønnene og visualiser lysbildet ved hjelp av et CCD-kamera eller på røntgenfilmer. Alternativt, for å visualisere med TMB, fjern silikongitteret etter buffer 5-vasken og legg til 400 mikroliter TMB på toppen av hele lysbildet.
Hold lysbildet i et fuktighetskammer og vent i fem til 10 minutter for fargeutvikling. Etter en fargeutvikling, vask lysbildet med 70% tetanol og fotografer lysbildet med et kamera eller mobiltelefon for analyse med bilde J-programvare. Importer bildet til bilde J og endre bildetypen til 8 bit ved å klikke på Image Type og deretter 8 bit.
Begrens det målte området ved å bruke rektangeltegningsverktøyet fra verktøylinjen til å måle båndene separat og tegne ønsket område. Mål intensiteten ved å klikke, analysere og deretter måle. Deretter flytter du det opprinnelig tegnede området til neste bånd og måler.
Etter å ha målt intensiteten for alle båndene, plott dataene i ønsket programvare. Topoisomerase 1-aktiviteten som bestemt av en fluorescerende skanneravlesning er avbildet her, som det fremgår av kvantifiseringen. Denne avlesningen har en deteksjonsgrense på 12, 5 nanogram, representative bilder og den resulterende kvantifiseringen oppnådd ved hjelp av fluorescerende mikroskopavlesning, er vist her.
Denne avlesningsmetoden har en deteksjonsgrense på 0,1 nanogram, deteksjonsterskelen for den forbedrede kjemiluminescensen og farge-o'metriske avlesningsmetoder var 6 nanogram. Ved å bruke de samme avlesningene var deteksjonsgrensen 1.250 celler for ECL og 312 celler for TMB. Når topoisomerase 1 aktivitet ble målt fra ekstrakter av kolorektale adenokarsinomavledede celler.
Som et eksempel på en narkotikascreeningsapplikasjon ble topoisomerase 1-aktiviteten målt i nærvær av camptothecin eller dimetylsulfat. Kvantifiseringsresultatene viste at camptothecin hemmer topoisomerase 1 en mediert sirkulærisering av substratet som forventet. Dette er en enkel protokoll som bare krever spesiell oppmerksomhet til vasketrinnene og reaksjonsinkubasjonstidene.
Det er også mulig å undersøke hvordan legemidler hemmer topoisomerase 1-aktivitet, bruk av Reid er svært følsom og enkel å utføre, det tillater rask screening av potensielle topoisomerase 1-hemmere, og bruk av topoisomerase 1-aktivitet som biomarkør for legemiddelrespons i kreft.