Enkel och snabb rullande cirkelförstärkningsbaserad detektion av topoisomeras 1-aktivitet i råbiologiska prover

Detta protokoll visar en rullande cirkelförstärkningsmetod för att detektera topoisomeras 1-aktivitet i råprover på ett snabbt och enkelt sätt. De främsta fördelarna med denna metod är att det är lätt att följa även av icke-erfarna forskare, och det är känsligare jämfört med de andra gelbaserade analyserna när råextrakt används. Tillämpningen av detta protokoll sträcker sig från mätning av svaret på läkemedelsbehandling till screening av småmolekylära föreningar med potentiell effekt mot cancer eller infektionssjukdomar.

Demonstrerar proceduren kommer att vara Karol Mizielinski utvecklingsspecialist från vårt laboratorium. För att börja, fäst ett specialdesignat silikonisolatornät på en funktionaliserad bild, vilket gör brunnstillverkaren. Tryck ner silikongallret för att undvika bildandet av luftbubblor mellan glasets yta och silikonet.

Förbered sedan primerblandningen genom att tillsätta fem mikromolära, fem prima aminoprimer i en tidsutskriftsbuffert. Tillsätt sedan fyra mikroliter av denna blandning till varje brunn och inkubera brunnstillverkaren i en hybridiseringskammare med mättad natriumklorid. För att generera slutna cirkulära substrat, tillsätt två mikroliter av fem mikromolära topoisomeras 1 specifikt substrat och två mikroliter av det rekombinanta topoisomeras 1-enzymet eller ett framställt cellextrakt till 16 mikroliter engångstopoisomerasreaktionsbuffert.

Inkubera denna cirkelblandning vid 37 grader Celsius i 30 minuter och stoppa enzymreaktionen genom att tillsätta två mikroliter 1% sds. Sänk ner brunnstillverkaren i en bricka fylld med buffert 1, förvärmd vid 50 grader Celsius. Pipettera bufferten i brunnarna för att säkerställa att inga luftbubblor finns kvar inuti brunnstillverkaren och inkubera sedan brickan i 30 minuter vid 50 grader Celsius.

Efter inkubation, ta bort bufferten 1 och tvätta två gånger med destillerat vatten med kraftig skakning i en minut mellan tvättarna. Ta bort vattnet, tillsätt sedan buffert 2, förvärmd vid 50 grader Celsius till brickan, inkubera och tvätta sedan brunnstillverkaren som visats tidigare för buffert 1. Tvätta sedan brunnstillverkaren med 70% etanol, med kraftig skakning i en minut och använd tryckluft för att låta installationen torka.

För att utföra hybridisering, tillsätt fyra mikroliter av den beredda cirkelblandningen till varje motsvarande brunn och placera brunnstillverkaren i en fuktighetskammare med destillerat vatten vid 37 grader Celsius i en timme. I slutet av inkubationen, tvätta brunnstillverkaren i en minut vardera och buffra 3, buffra 4 och 70% etanol och låt den sedan lufttorka. Förbered och tillsätt fyra mikroliter RCA-blandningen till varje brunn i brunnstillverkaren och inkubera vid 37 grader Celsius i två timmar i fuktighetskammaren.

För att mikroskopiskt visualisera de förstärkta fluorescerande rullcirkelprodukterna, tvätta först bilden med buffert 3, buffert 4 och 70% etanol. Torka bilden med tryckluft och limma fast den på ett mikroskopglas. Markera brunnarnas position med en markör och ta sedan bort silikonnätet med pincett.

För att möjliggöra visualisering i kameran, montera bilden med två mikroliter monteringsmedium utan dapi och lägg till ett täckglas. Analysera bilden med hjälp av ett fluorescensmikroskop, med en 60x oljesänkningsobjektiv och en kamera. Efter avbildning importerar du bilderna till bild J och staplar bilderna genom att klicka på Bild, sedan Staplar och Bilder till Stapel och ändrar sedan bildtypen till 8 bitar.

För att ställa in tröskeln, klicka på Bild, Justera och sedan Tröskel. Ställ in den nedre stapeln på 255 och justera den övre stapeln så att endast de högra signalerna är röda och bakgrunden är svart. Svep igenom de enskilda bilderna och se till att de motsvarar bilderna innan du justerar tröskeln.

Se till att tröskeln är inställd så lågt som möjligt innan de verkliga signalerna börjar försvinna. Om du vill räkna signalerna klickar du på Analysera, följt av Analysera partiklar och ser till att det sammanfattade fältet i bilden J-inställningarna är markerat. Tillsätt fyra mikroliter utspädd hästrädisperoxidaskonjugerad anti-biotinantikropp till varje brunn och inkubera vid 15 till 25 grader Celsius i 50 minuter i fuktighetskammaren.

Vid slutet av inkubationen, tvätta brunnstillverkaren tre gånger med buffert 5 i tre minuter vardera och låt den torka. För att visualisera kemiluminescensen, tillsätt två mikroliter nyberedd ECL-luminol- och väteperoxidblandning till brunnarna och visualisera bilden med en CCD-kamera eller på röntgenfilmer. Alternativt, för att visualisera med TMB, ta bort silikonnätet efter buffert 5-tvätten och tillsätt 400 mikroliter TMB ovanpå hela bilden.

Håll bilden i en fuktighetskammare och vänta i fem till 10 minuter för färgutveckling. Efter en färgutveckling, tvätta bilden med 70% tetanol och fotografera bilden med en kamera eller mobiltelefon för analys med bild J-programvara. Importera bilden till bild J och ändra bildtypen till 8 bitar genom att klicka på Bildtyp och sedan 8 bitar.

Begränsa det uppmätta området genom att använda rektangelritverktyget från verktygsfältet för att mäta banden separat och rita önskat område. Mät intensiteten genom att klicka, Analysera och sedan Mät. Flytta sedan det ursprungligen ritade området till nästa band och mät.

Efter att ha mätt intensiteten för alla band, plotta data i önskad programvara. Topoisomeras 1-aktiviteten som bestäms av en fluorescerande skanneravläsning visas här, vilket framgår av kvantifieringen. Denna avläsning har en detektionsgräns på 12,5 nanogram, representativa bilder och den resulterande kvantifieringen erhållen med hjälp av den fluorescerande mikroskopavläsningen visas här.

Denna avläsningsmetod har en detektionsgräns på 0,1 nanogram, detektionströskeln för den förbättrade kemiluminescensen och färgo'metriska avläsningsmetoder var 6 nanogram. Med samma avläsningar var detektionsgränsen 1 250 celler för ECL och 312 celler för TMB. När topoisomeras 1 aktivitet mättes från extrakt av kolorektal adenokarcinom härledda celler.

Som ett exempel på en läkemedelsscreeningsapplikation mättes topoisomeras 1-aktiviteten i närvaro av camptothecin eller dimetylsulfoxid. Kvantifieringsresultaten visade att camptothecin hämmar topoisomeras 1 en medierad cirkularisering av substratet som förväntat. Detta är ett enkelt protokoll som endast kräver särskild uppmärksamhet åt tvättstegen och reaktionsinkubationstiderna.

Det är också möjligt att undersöka hur läkemedel hämmar topoisomeras 1-aktivitet, med Reid är mycket känsligt och lätt att utföra, det möjliggör snabb screening av potentiella topoisomeras 1-hämmare och användning av topoisomeras 1-aktivitet som en biomarkör för läkemedelssvar vid cancer.