Bu protokol, ham numunelerdeki topoizomeraz 1 aktivitesini hızlı ve basit bir şekilde tespit etmek için bir yuvarlanma çemberi amplifikasyon yöntemi gösterir. Bu yöntemin temel avantajları, deneyimli olmayan araştırmacılar tarafından da takip edilmesinin kolay olması ve ham ekstraktlar kullanıldığında diğer jel bazlı testlere kıyasla daha hassas olmasıdır. Bu protokolün uygulanması, ilaç tedavisine yanıtın ölçülmesinden, potansiyel anti-kanser veya anti-enfeksiyöz hastalıklar etkisi olan küçük moleküllü bileşiklerin taranmasına kadar uzanmaktadır.
Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan Karol Mizielinski geliştirme uzmanı olacaktır. Başlamak için, özel olarak tasarlanmış bir silikon izolatör ızgarasını işlevselleştirilmiş bir slayda takın, böylece kuyu oluşturucuyu yapın. Camın yüzeyi ile silikon arasında hava kabarcıkları oluşmasını önlemek için silikon ızgaraya bastırın.
Daha sonra, bir kerelik baskı tamponuna beş mikromolar, beş asal amino astar ekleyerek astar karışımını hazırlayın. Daha sonra bu karışımın dört mikrolitresini her bir oyuğa ekleyin ve kuyu yapıcıyı doymuş sodyum klorür içeren bir hibridizasyon odasında inkübe edin. Kapalı dairesel substratlar üretmek için, iki mikrolitre beş mikromolar topoizomeraz 1 spesifik substrat ve iki mikrolitre rekombinant topoizomeraz 1 enzimi veya hazırlanmış bir hücre ekstraktını 16 mikrolitre bir kerelik topoizomeraz reaksiyon tamponuna ekleyin.
Bu daire karışımını 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin ve iki mikrolitre% 1 sds ekleyerek enzim reaksiyonunu durdurun. Kuyu yapıcıyı, 50 santigrat derecede önceden ısıtılmış, tampon 1 ile doldurulmuş bir tepsiye batırın. Kuyu oluşturucunun içinde hava kabarcığı kalmamasını sağlamak için tamponu kuyucuklara pipetleyin ve ardından tepsiyi 50 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin.
Kuluçkadan sonra, tampon 1'i çıkarın ve yıkamalar arasında bir dakika boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalayarak damıtılmış suyla iki kez yıkayın. Suyu çıkarın, ardından tepsiye 50 santigrat derecede önceden ısıtılmış tampon 2'yi ekleyin, ardından tampon 1 için daha önce gösterildiği gibi kuyu yapıcıyı inkübe edin ve yıkayın. Daha sonra, kuyu yapıcıyı %70 etanol ile, bir dakika boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalayarak yıkayın ve kurulumun kurumasını sağlamak için basınçlı hava kullanın.
Hibridizasyon yapmak için, hazırlanan daire karışımının dört mikrolitresini karşılık gelen her bir kuyuya ekleyin ve kuyu yapıcıyı bir saat boyunca 37 santigrat derecede damıtılmış su içeren bir nem odasına yerleştirin. Kuluçka sonunda, kuyu yapıcıyı her biri bir dakika boyunca yıkayın ve tampon 3, tampon 4 ve% 70 etanol, ardından hava kurumasını bekleyin. Kuyu üreticisinin her bir kuyucuğuna dört mikrolitre RCA karışımı hazırlayın ve ekleyin ve nem odasında iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Güçlendirilmiş floresan yuvarlanma çemberi ürünlerini mikroskobik olarak görselleştirmek için, önce slaytı tampon 3, tampon 4 ve% 70 etanol ile yıkayın. Slaytı basınçlı hava ile kurutun ve mikroskop slaytına yapıştırın. kuyucukların konumunu bir işaretleyici ile işaretleyin ve ardından cımbız kullanarak silikon ızgarayı çıkarın.
Kamerada görselleştirmeye izin vermek için, slaytı dapi olmadan iki mikrolitre montaj ortamıyla monte edin ve bir kapak camı ekleyin. Slaytı bir floresan mikroskobu, 60x yağ daldırma objektif lensi ve bir kamera ile analiz edin. Görüntülemeden sonra, resimleri J resmine aktarın ve Görüntü'ye, ardından Yığınlar ve Görüntüler'e tıklayarak görüntüleri yığınlayın, ardından görüntü türünü 8 bit olarak değiştirin.
Eşiği ayarlamak için Resim, Ayarla ve ardından Eşik'e tıklayın. Alt çubuğu 255 olarak ayarlayın ve üst çubuğu yalnızca doğru sinyaller kırmızı, arka plan siyah olacak şekilde ayarlayın. Tek tek görüntüleri süpürün ve eşiği ayarlamadan önce görüntülere karşılık geldiklerinden emin olun.
Gerçek sinyaller kaybolmaya başlamadan önce eşiğin mümkün olduğunca düşük ayarlandığından emin olun. Sinyalleri saymak için Analiz Et'e tıklayın, ardından Parçacıkları Analiz Et'e tıklayın ve görüntü J ayarlarındaki özetlenmiş alanın işaretli olduğundan emin olun. Her bir kuyucuğa dört mikrolitre seyreltilmiş at turpu peroksidaz konjuge anti-biyotin anti-biyotin antikoru ekleyin ve nem odasında 50 dakika boyunca 15 ila 25 santigrat derecede inkübe edin.
Kuluçka sonunda, kuyu yapıcıyı her biri üç dakika boyunca tampon 5 ile üç kez yıkayın ve kurumaya bırakın. Kemilüminesansı görselleştirmek için, kuyucuklara iki mikrolitre taze hazırlanmış ECL luminol ve hidrojen peroksit karışımı ekleyin ve slaytı bir CCD kamera veya x-ışını filmleri kullanarak görselleştirin. Alternatif olarak, TMB ile görselleştirmek için, tampon 5 yıkamadan sonra silikon ızgarayı çıkarın ve tüm kızağın üzerine 400 mikrolitre TMB ekleyin.
Slaytı bir nem odasında tutun ve renk gelişimi için beş ila 10 dakika bekleyin. Renk geliştirmeden sonra, slaytı% 70 tetanol ile yıkayın ve görüntü J yazılımı ile analiz için slaytı bir kamera veya cep telefonu ile fotoğraflayın. Resmi J resmine aktarın ve Görüntü Türü'ne ve ardından 8 bit'e tıklayarak görüntü türünü 8 bit olarak değiştirin.
Bantları ayrı ayrı ölçmek ve istenen alanı çizmek için araç çubuğundaki dikdörtgen çizim aracını kullanarak ölçülen alanı sınırlayın. Yoğunluğu tıklayarak ölçün, Analiz Et ve ardından Ölç. Ardından, orijinal olarak çizilen alanı bir sonraki banda taşıyın ve ölçün.
Tüm bantların yoğunluğunu ölçtükten sonra, verileri istediğiniz yazılımda çizin. Bir floresan tarayıcı okuması tarafından belirlenen Topoizomeraz 1 aktivitesi, nicelemeden de anlaşılacağı gibi, burada tasvir edilmiştir. Bu okumanın 12.5 nanogramlık bir algılama sınırı vardır, temsili görüntüler ve floresan mikroskop okuması kullanılarak elde edilen sonuç niceliği burada gösterilmiştir.
Bu okuma yönteminin 0.1 nanogramlık bir algılama sınırı vardır, gelişmiş kemilüminesansın algılama eşiği ve renkli o'metrik okuma yöntemleri 6 nanogram idi. Aynı okumaları kullanarak, tespit sınırı ECL için 1.250 hücre ve TMB için 312 hücreydi. Topoizomeraz 1 aktivitesi kolorektal adenokarsinom türevi hücrelerin ekstraktlarından ölçülmüştür.
Bir ilaç tarama uygulamasına örnek olarak, topoizomeraz 1 aktivitesi kamptotesin veya dimetil sülfoksit varlığında ölçülmüştür. Niceleme sonuçları, kamptothecin'in topoizomeraz 1'i inhibe ettiğini ve substratın beklendiği gibi daireselleşmesine aracılık ettiğini göstermiştir. Bu, yalnızca yıkama adımlarına ve reaksiyon inkübasyon sürelerine özel dikkat gerektiren basit bir protokoldür.
İlaçların topoizomeraz 1 aktivitesini nasıl inhibe ettiğini araştırmak da mümkündür, Reid kullanımı oldukça hassas ve gerçekleştirilmesi kolaydır, potansiyel topoizomeraz 1 inhibitörlerinin hızlı bir şekilde taranmasına ve topoizomeraz 1 aktivitesinin kanserlerde ilaç yanıtı için bir biyobelirteç olarak kullanılmasına izin verir.
