Name: a "dual-addition" calcium fluorescence assay for the high-throughput screening of recombinant g protein-coupled receptors
Uploaded: 2022-12-02T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de USDA-NIFA-AFRI Animal Health and Well-Being Award (Award nummer 2022-67015-36336, PVP [Project Director]) en van concurrerende fondsen van het Texas A &M AgriLife Research Insect Vector Diseases Grant Program (FY'22-23) aan P.V.P. De A.W.E.S.O.M.E. faculteitsgroep van het College of Agriculture and Life Sciences, TAMU, wordt erkend voor hulp bij het bewerken van het manuscript. Aanvullende tabel S2 bevat gegevens van een interne, willekeurige bibliotheek met kleine moleculen, verkregen uit het laboratorium van Dr. James Sacchettini aan de Texas A &M University en Texas A &M AgriLife Research.

1. Cel onderhoud
OPMERKING: Een CHO-K1 cellijn die stabiel de kininereceptor van R. microplus tot expressie brengt, genaamd BMLK3, werd ontwikkeld door Holmes et al.16. De details van de ontwikkeling van de cellijn worden elders gepresenteerd14. Alle volgende stappen worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een klasse II bioveiligheidskast.
<ol><li>Kweek de recombinante cellijn in selectieve media ...

<ol>
	<li>Hanlon, C. D., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outside-in+signaling+-+A+brief+review+of+GPCR+signaling+with+a+focus+on+the+Drosophila+GPCR+family.">Outside-in signaling - A brief review of GPCR signaling with a focus on the Drosophila GPCR family.</a> Journal of Cell Science. 128 (19), 3533-3542 (2015).</li><li>Liu, N., Li, T., Wang, Y., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein+coupled+receptors+(GPCRs)+in+insects-A+potential+target+for+new+insecticide+development.">G-protein coupled receptors (GPCRs) in insects-A potential target for new insecticide development.</a> Molecules. 26 (10), 2993 (2021).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 639-650 (2002).</li><li>Pietrantonio, P. V., Xiong, C., Nachman, R. J., Shen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptors+in+arthropod+vectors:+Omics+and+pharmacological+approaches+to+elucidate+ligand-receptor+interactions+and+novel+organismal+functions.">G protein-coupled receptors in arthropod vectors: Omics and pharmacological approaches to elucidate ligand-receptor interactions and novel organismal functions.</a> Current Opinion in Insect Science. 29, 12-20 (2018).</li><li>Hilger, D., Masureel, M., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+GPCR+signaling+complexes.">Structure and dynamics of GPCR signaling complexes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (1), 4-12 (2018).</li><li>Liu, N., Wang, Y., Li, T., Feng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein+coupled+receptors+(GPCRs):+Signaling+pathways,+characterization,+and+functions+in+insect+physiology+and+toxicology.">G-protein coupled receptors (GPCRs): Signaling pathways, characterization, and functions in insect physiology and toxicology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (10), 5260 (2021).</li><li>Hansen, K. B., Br&#228;uner-Osborne, H., Leifert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIPR&#174;+assays+of+intracellular+calcium+in+GPCR+drug+discovery.">FLIPR&#174; assays of intracellular calcium in GPCR drug discovery.</a> G Protein-Coupled Receptors in Drug Discovery. , (2009).</li><li>Bauknecht, P., Jekely, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+combinatorial+deorphanization+of+Platynereis+neuropeptide+GPCRs.">Large-scale combinatorial deorphanization of Platynereis neuropeptide GPCRs.</a> Cell Reports. 12 (4), 684-693 (2015).</li><li>Frooninckx, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+GPCRs+in+C.+elegans.">Neuropeptide GPCRs in C. elegans.</a> Frontiers in Endocrinology. 3, 167 (2012).</li><li>Caers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+two+decades+of+research+on+insect+neuropeptide+GPCRs:+An+overview.">More than two decades of research on insect neuropeptide GPCRs: An overview.</a> Frontiers in Endocrinology. 3, 151 (2012).</li><li>&#352;imo, L., Ko&#269;i, J., Park, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptors+for+the+neuropeptides,+myoinhibitory+peptide+and+SIFamide,+in+control+of+the+salivary+glands+of+the+blacklegged+tick+Ixodes+scapularis.">Receptors for the neuropeptides, myoinhibitory peptide and SIFamide, in control of the salivary glands of the blacklegged tick Ixodes scapularis.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (4), 376-387 (2013).</li><li>&#352;imo, L., Park, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptidergic+control+of+the+hindgut+in+the+black-legged+tick+Ixodes+scapularis.">Neuropeptidergic control of the hindgut in the black-legged tick Ixodes scapularis.</a> International Journal for Parasitology. 44 (11), 819-826 (2014).</li><li>Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+genetic+characterization+of+neuropeptide+Y-like+receptors+in+Aedes+aegypti.">Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 2486 (2013).</li><li>Lu, H. L., Kersch, C. N., Taneja-Bageshwar, S., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+calcium+bioluminescence+assay+for+functional+analysis+of+mosquito+(Aedes+aegypti)+and+tick+(Rhipicephalus+microplus)+G+protein-coupled+receptors.">A calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (Aedes aegypti) and tick (Rhipicephalus microplus) G protein-coupled receptors.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2732 (2011).</li><li>Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cattle+fever+tick,+Rhipicephalus+microplus,+as+a+model+for+forward+pharmacology+to+elucidate+kinin+GPCR+function+in+the+Acari.">The cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, as a model for forward pharmacology to elucidate kinin GPCR function in the Acari.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1008 (2019).</li><li>Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+a+G+protein-coupled+receptor+from+the+Southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+(Acari:+Ixodidae)+identifies+it+as+the+first+arthropod+myokinin+receptor.">Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor.</a> Insect Molecular Biology. 12 (1), 27-38 (2003).</li><li>Cox, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning,+characterization,+and+expression+of+a+G-protein-coupled+receptor+from+Lymnaea+stagnalis+and+identification+of+a+leucokinin-like+peptide,+PSFHSWSamide,+as+its+endogenous+ligand.">Cloning, characterization, and expression of a G-protein-coupled receptor from Lymnaea stagnalis and identification of a leucokinin-like peptide, PSFHSWSamide, as its endogenous ligand.</a> Journal of Neuroscience. 17 (4), 1197-1205 (1997).</li><li>Dircksen, H., Kastin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+32+-+Crustacean+bioactive+peptides.">Chapter 32 - Crustacean bioactive peptides.</a> Handbook of Biologically Active Peptides (Second Edition). , 209-221 (2013).</li><li>Halberg, K. A., Terhzaz, S., Cabrero, P., Davies, S. A., Dow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+the+evolutionary+origins+of+insect+renal+function.">Tracing the evolutionary origins of insect renal function.</a> Nature Communications. 6, 6800 (2015).</li><li>Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+leucokinin+receptor+is+a+multiligand+receptor+for+the+three+Aedes+kinins.">The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins.</a> Insect Molecular Biology. 14 (1), 55-67 (2005).</li><li>Radford, J. C., Davies, S. A., Dow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+G-protein-coupled+receptor+analysis+in+Drosophila+melanogaster+identifies+a+leucokinin+receptor+with+novel+roles.">Systematic G-protein-coupled receptor analysis in Drosophila melanogaster identifies a leucokinin receptor with novel roles.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38810-38817 (2002).</li><li>Brock, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+leucokinin-like+peptide+receptor+from+the+cattle+fever+tick,+Rhipicephalus+microplus,+is+localized+in+the+midgut+periphery+and+receptor+silencing+with+validated+double-stranded+RNAs+causes+a+reproductive+fitness+cost.">The leucokinin-like peptide receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, is localized in the midgut periphery and receptor silencing with validated double-stranded RNAs causes a reproductive fitness cost.</a> International Journal for Parasitology. 49 (3-4), 287-299 (2019).</li><li>N&#228;ssel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucokinin+and+associated+neuropeptides+regulate+multiple+aspects+of+physiology+and+behavior+in+Drosophila.">Leucokinin and associated neuropeptides regulate multiple aspects of physiology and behavior in Drosophila.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1940 (2021).</li><li>Kim, Y. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+peptidergic+ensembles+associated+with+organization+of+an+innate+behavior.">Central peptidergic ensembles associated with organization of an innate behavior.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14211-14216 (2006).</li><li>Al-Anzi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+leucokinin+pathway+and+its+neurons+regulate+meal+size+in+Drosophila.">The leucokinin pathway and its neurons regulate meal size in Drosophila.</a> Current Biology. 20 (11), 969-978 (2010).</li><li>Yurgel, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+pair+of+leucokinin+neurons+are+modulated+by+feeding+state+and+regulate+sleep-metabolism+interactions.">A single pair of leucokinin neurons are modulated by feeding state and regulate sleep-metabolism interactions.</a> PLoS Biology. 17 (2), 2006409 (2019).</li><li>N&#228;ssel, D. R., Zandawala, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+neuropeptide+signaling+in+Drosophila,+from+genes+to+physiology+and+behavior.">Recent advances in neuropeptide signaling in Drosophila, from genes to physiology and behavior.</a> Progress in Neurobiology. 179, 101607 (2019).</li><li>Okusawa, S., Kohsaka, H., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+and+downstream+leucokinin+neurons+modulate+larval+turning+behavior+in+Drosophila.">Serotonin and downstream leucokinin neurons modulate larval turning behavior in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 34 (7), 2544-2558 (2014).</li><li>Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+leucokinin+receptor+is+critical+for+in+vivo+fluid+excretion+post+blood+feeding.">Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding.</a> FEBS letters. 585 (22), 3507-3512 (2011).</li><li>Kwon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucokinin+mimetic+elicits+aversive+behavior+in+mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+and+inhibits+the+sugar+taste+neuron.">Leucokinin mimetic elicits aversive behavior in mosquito Aedes aegypti (L.) and inhibits the sugar taste neuron.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 6880-6885 (2016).</li><li>Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+random+small+molecule+library+screen+identifies+novel+antagonists+of+the+kinin+receptor+from+the+cattle+fever+tick,+Rhipicephalus+microplus+(Acari:+Ixodidae).">A random small molecule library screen identifies novel antagonists of the kinin receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae).</a> Pest Management Science. 77 (5), 2238-2251 (2021).</li><li>Torfs, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinin+peptide+family+in+invertebrates.">The kinin peptide family in invertebrates.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 897 (1), 361-373 (1999).</li><li>Ma, Q., Ye, L., Liu, H., Shi, Y., Zhou, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+Ca2++mobilization+assays+in+GPCR+drug+discovery.">An overview of Ca2+ mobilization assays in GPCR drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (5), 511-523 (2017).</li><li>Zhang, J. -. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).</li><li>Offermanns, S., Simon, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&#945;15+and+G&#945;16+couple+a+wide+variety+of+receptors+to+phospholipase+C.">G&#945;15 and G&#945;16 couple a wide variety of receptors to phospholipase C.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (25), 15175-15180 (1995).</li><li>Murgia, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+phenotypic+screening+identifies+novel+chemistries+that+disrupt+mosquito+activity+and+development.">High-content phenotypic screening identifies novel chemistries that disrupt mosquito activity and development.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 182, 105037 (2022).</li><li>Lismont, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+BRET-based+biosensors+be+used+to+characterize+G-protein+mediated+signaling+pathways+of+an+insect+GPCR,+the+Schistocerca+gregaria+CRF-related+diuretic+hormone+receptor.">Can BRET-based biosensors be used to characterize G-protein mediated signaling pathways of an insect GPCR, the Schistocerca gregaria CRF-related diuretic hormone receptor.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 122, 103392 (2020).</li></ol>

Het doel van HTS is om hitmoleculen te identificeren door enorme aantallen kleine moleculen te screenen. Daarom vertegenwoordigen de resultaten van dit voorbeeld slechts een klein deel van een conventioneel HTS-experiment. Bovendien moeten de geïdentificeerde hitmoleculen worden gevalideerd in downstream-assays, zoals een dosisafhankelijke test op dezelfde recombinante cellijn en op een CHO-K1-cellijn die alleen de lege vector draagt, die tegelijkertijd kan worden uitgevoerd om kleine moleculen te redden. Cytotoxiciteit...

G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's), die aanwezig zijn van gist tot mens, vertegenwoordigen de grootste superfamilie van receptoren in veel organismen1. Ze spelen een cruciale rol bij het reguleren van bijna alle biologische processen bij dieren. Er zijn 50-200 GPCR's in het genoom van geleedpotigen, wat betekent dat ze de grootste membraanreceptor superfamilie2 vertegenwoordigen. Ze worden ingedeeld in zes hoofdklassen, A-F, op basis van hun volgordeovereenkomst en functies3. GPCR's transduceren verschillende extracellulaire signalen, zoals die van hormonen, neuropeptiden, biogene amines, glutamaat, proton, lipoglycoproteïnen en fotonen4. GPCR's koppelen aan heterotrimeer G-eiwitten (Gα, Gβ en Gγ) om stroomafwaartse signalen te verzenden. GPCR's gekoppeld aan Gαs- of Gαi/o-eiwitten verhogen of verlagen respectievelijk de intracellulaire 3', 5'-cyclische adenosinemonofosfaat (cAMP) niveaus door adenylylcyclase te activeren of te remmen. GPCR's gekoppeld aan Gαq/11 induceren calciumafgifte uit de endoplasmatische reticulumcalciumvoorraden door de fosfolipase C (PLC)-inositol-1,4,5-trifosfaat (IP3) route te activeren. GPCR's gekoppeld aan Gα12/13 activeren RhoGTPase nucleotide-uitwisselingsfactoren 5,6. GPCR's zijn het doelwit van meer dan 50% van de menselijke geneesmiddelen en een acaricide, amitraz4. Omdat GPCR's zulke uiteenlopende signalen transduceren, zijn ze veelbelovende doelen voor het ontwikkelen van nieuwe pesticiden die ongewervelde fysiologische functies verstoren.
Het doel van HTS is om hitmoleculen te identificeren die receptorfuncties kunnen moduleren. HTS omvat assay-ontwikkeling, miniaturisatie en automatisering7. Geleedpotige neuropeptide GPCRRs zijn betrokken bij de meeste fysiologische functies, zoals ontwikkeling, rui en ecdysis, uitscheiding, energiemobilisatie en reproductie4. De meeste neuropeptide GPCRRs van geleedpotigen en metazoën signaleren via de calciumsignaleringscascade 2,6,8,9,10, zoals in de myoinhibitory peptide en SIFamide receptoren van de zwartpootteek Ixodes scapularis; hun liganden zijn antagonistisch in hindgutmotiliteitstests, waarbij SIF contractie uitlokt en MIP hetremt 11,12. Een NPY-achtige receptor van de gelekoortsmug, Aedes aegypti, reguleert de vrouwelijke gastheer op zoek naar13. In vergelijking met andere alternatieve calciummobilisatietests zoals de aequorinecalciumbioluminescentietest14, is de calciumfluorescentietest gemakkelijk uit te voeren, vereist geen transfectie van andere recombinante calciumdetectie-eiwitten en is het kosteneffectief. De calciumfluorescentietest produceert een langdurig signaal in vergelijking met het snelle kinetische signaal dat wordt verkregen in de aequorinecalciumbioluminescentietest14,15.
In het voorbeeld hier werd de kininereceptor van de runderkoortsteek, Rhipicephalus microplus, recombinant tot expressie gebracht in de CHO-K1-cellijn en gebruikt voor de calciumfluorescentietest. Er is slechts één kininereceptorgen gevonden in R. microplus; de receptor signaleert via een Gq-eiwitafhankelijke signaalroute en activeert de efflux van Ca2+ uit calciumvoorraden naar de intracellulaire ruimte16. Dit proces kan worden gedetecteerd en gekwantificeerd door een fluorofoor, die een fluorescentiesignaal opwekt bij het binden van calciumionen (figuur 1).
De kininereceptor is een ongewervelde GPCR, die behoort tot de klasse A Rhodopsine-achtige receptoren. Kinine is een oud signaal neuropeptide dat aanwezig is in Mollusca, Crustacea, Insecta en Acari 4,17,18. Coleopteranen (kevers) missen het kininesignaleringssysteem; in de mug Aedes aegypti is er slechts één kininereceptor die drie aedeskinines bindt, terwijl Drosophila melanogaster één kininereceptor heeft met drosokinine als een uniek ligand 19,20,21. Er zijn geen homologe kininen of kininereceptoren in gewervelde dieren. Hoewel de exacte functie van kinine onbekend is bij teken, vertonen de kininereceptor RNAi-gedempte vrouwtjes van R. microplus een significant verminderde reproductieve fitheid22. Kininen zijn pleotrope peptiden in insecten. Bij Drosophila melanogaster zijn ze betrokken bij zowel het centrale als het perifere zenuwstelsel23, pre-ecdysis24, voeding25, metabolisme26 en slaapactiviteitspatronen26,27, evenals larvale voortbeweging28. Kinins reguleren hindgut contractie, diurese en voeding in de mug A. aegypti 29,30,31. De kininepeptiden hebben een geconserveerd C-terminal pentapeptide Phe-X1-X2-Trp-Gly-NH2, wat de minimaal vereiste sequentie is voor biologische activiteit32. De geleedpotige specificiteit, de kleine omvang van het endogene ligand, waardoor ze vatbaar zijn voor interferentie met kleine moleculen, en de pleiotrope functies bij insecten maken de kininereceptor een veelbelovend doelwit voor ongediertebestrijding4.
De "dual-addition" assay (Figuur 2) maakt de identificatie van agonisten of antagonisten in dezelfde HTS assay15 mogelijk. Het is aangepast van een "dual-addition" assay die vaak wordt gebruikt in de farmaceutische industrie voor het ontdekken van geneesmiddelen33. Kortom, de eerste toevoeging van geneesmiddelen aan de celplaat maakt de identificatie van potentiële agonisten in de chemische bibliotheek mogelijk wanneer een hoger fluorescentiesignaal wordt gedetecteerd in vergelijking met de toepassing van de oplosmiddelcontrole. Na 5 minuten incubatie met deze kleine moleculen wordt een bekende agonist (kininepeptide) op alle putten aangebracht. Die putten die willekeurig een antagonist van de medicijnplaat ontvingen, vertonen een lager fluorescentiesignaal bij agonisttoevoeging in vergelijking met de controleputten die het oplosmiddel in de eerste toevoeging ontvingen. Deze test maakt het vervolgens mogelijk om potentiële agonisten en antagonisten met dezelfde cellen te identificeren. In een standaard HTS-project zouden deze hitmoleculen verder worden gevalideerd door middel van dosis-responstests en door aanvullende biologische activiteitstests, die hier niet worden getoond.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64505/64505fig01.jpg"> Figuur 1: Illustratie van het calciumfluorescentietestmechanisme. Het Gq-eiwit activeert de intracellulaire calciumsignaleringsroute. De kininereceptor (G-eiwit-gekoppelde receptor) werd recombinant tot expressie gebracht in CHO-K1-cellen. Wanneer de agonistligand zich aan de receptor bindt, activeert het Gq-eiwit geassocieerd met de kininereceptor PLC, dat de omzetting van een PIP 2-molecuul in IP3 en DAG katalyseert. IP3 bindt vervolgens aan de IP3R op het oppervlak van het endoplasmatisch reticulum, wat leidt tot de afgifte van Ca2+ in het cytoplasma, waar Ca2+ ionen binden aan de fluoroforen en een fluorescentiesignaal opwekken. Het fluorescentiesignaal kan worden verkregen door excitatie bij 490 nm en gedetecteerd bij 514 nm. Afkortingen: GPCR = G eiwit-gekoppelde receptor; PLC = fosfolipase C; PIP2 = fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat; IP3 = inositol trisfosfaat; DAG = diacylglycerol; IP3R = IP3 receptor. Gemaakt met BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64505/64505fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64505/64505fig02.jpg"> Figuur 2: De workflow voor de high-throughput screening van kleine moleculen op een G-eiwit gekoppelde receptor tot expressie gebracht in CHO-K1 cellen. (A) Recombinante CHO-K1 cellen die stabiel de kininereceptor tot expressie brengen, werden toegevoegd aan de 384-well plaat (10.000 cellen / put) met behulp van een vloeistofbehandelingssysteem (25 μL / put) en geïncubeerd in een bevochtigde CO2-incubator gedurende 12-16 uur. (B ) De testbuffer met de fluorescerende kleurstof (25 μL/put) werd met behulp van een vloeistofbehandelingssysteem aan de celplaat toegevoegd. De plaat werd gedurende 30 minuten geïncubeerd bij 37 °C gedurende 30 minuten en bij RT gedurende nog eens 30 minuten in evenwicht gebracht. (C) Het achtergrondfluorescentiesignaal van de cellen in elke put werd gemeten met een platenlezer. (D) Geneesmiddeloplossingen van een 384-well bibliotheekplaat en blanco oplosmiddel (allemaal bij 0,5 μL / put) werden toegevoegd aan de cellulaire testplaat met behulp van een vloeistofbehandelingssysteem. (E) Cellulaire calciumfluorescentieresponsen werden gemeten met de platenlezer onmiddellijk na de toevoeging van de geneesmiddeloplossingen; verbinding(en) die hoger dan gemiddelde fluorescentiesignalen uitlokken, werden uitgezocht als agonistische hit(s). Antagonist-hits die de GPCR blokkeren (pictogram hieronder) werden onthuld na de toevoeging van de peptide-agonist tijdens stap G. (F) In dezelfde testplaat werd na 5 minuten incubatie van de cellen met screeningverbindingen een endogene agonist peptide Rhimi-K-1 (QFSPWGamide) van de tekenkininereceptor aan elke put toegevoegd (1 μM). (G) Cellulaire fluorescentiereacties na de toevoeging van het agonistpeptide werden onmiddellijk door de plaatlezer gemeten. Verbinding(en) die het fluorescentiesignaal remmen werden geselecteerd als antagonist hit(s). Afkortingen: GPCR = G eiwit-gekoppelde receptor; RT = kamertemperatuur; RFU = relatieve fluorescentie-eenheden. Gemaakt met BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64505/64505fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>15050-065</td>
			<td>with phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% trypan blue</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td>liquid, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM12400</td>
			<td>RNase-free Microfuge Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-045</td>
			<td>Corning Costar Stripette individually wrapped&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-047</td>
			<td>Corning Costar Stripette individually wrapped&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L filter tips</td>
			<td>USA Scientifc Inc.</td>
			<td>P1121</td>
			<td>sterile, barrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-049</td>
			<td>Corning Costar Stripette individually wrapped&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>graduated, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL auto-friendly reservior</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>6317</td>
			<td>sterile, individually wrapped for cell seeding in day 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL auto-friendly reservior</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>6318</td>
			<td>sterile, stacked, for loading dye in day 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384/ 12.5 &#181;L low retention tips</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>6405</td>
			<td>long, sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384/ 12.5 &#181;L tips</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>6404</td>
			<td>long, sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781091</td>
			<td>CELLSTAR, clear polystyrene, &#181;Clear, Black/Flat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum plate seals</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>PCR-AS-200</td>
			<td>polyester-based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil wrap</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafty cabinet II</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-540-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>AutoT4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell counting slides</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>SD-100</td>
			<td>20 &#181;L chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 humidified incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Forma Series II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desk Lamp</td>
			<td>SunvaleeyTEK</td>
			<td>RS1000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>276855</td>
			<td>anhydous, &#62;99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>DPBS, 1x without calcium amd magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12K Nutrient Mixture&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-354</td>
			<td>(Kaighn&#39;s Mod.) with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>SFBU30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent calcium assay kit</td>
			<td>ENZO Lifescience</td>
			<td>ENZ-51017</td>
			<td>10x96 tests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 sulfate</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>10131-027</td>
			<td>Geneticin selective antibiotic 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s buffer</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>55037C</td>
			<td>HBSS modified, with calcium, with magnesium, without phenol read</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>1 Molar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTS data storage plateform</td>
			<td>CDD vault&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://www.collaborativedrug.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid handling system</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>Viaflo</td>
			<td>384/12.5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Sorvall ST8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BMG technology</td>
			<td>Clariostar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhimi-K-1 agonist peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>custom order</td>
			<td>QFSPWGamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a "dual-addition" calcium fluorescence assay for the high-throughput screening of recombinant g protein-coupled receptors

G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) vertegenwoordigen de grootste superfamilie van receptoren en zijn het doelwit van tal van menselijke geneesmiddelen. High-throughput screening (HTS) van willekeurige kleine molecuulbibliotheken tegen GPCR's wordt door de farmaceutische industrie gebruikt voor het ontdekken van doelwitspecifieke geneesmiddelen. In deze studie werd een HTS gebruikt om nieuwe liganden met kleine moleculen van ongewervelde neuropeptide GPCRRs te identificeren als sondes voor fysiologische studies van vectoren van dodelijke menselijke en veterinaire pathogenen.
De ongewervelde-specifieke kininereceptor werd gekozen als doelwit omdat het veel belangrijke fysiologische processen bij ongewervelde dieren reguleert, waaronder diurese, voeding en spijsvertering. Bovendien is de farmacologie van veel ongewervelde GPCR's slecht of helemaal niet gekarakteriseerd; daarom voegt de differentiële farmacologie van deze groepen receptoren met betrekking tot de gerelateerde GPCR's in andere metazoën, met name mensen, kennis toe aan de structuur-activiteitsrelaties van GPCR's als een superfamilie. Een HTS-test werd ontwikkeld voor cellen in 384-well-platen voor de ontdekking van liganden van de kininereceptor van de runderkoortsteek, of zuidelijke runderteek, Rhipicephalus microplus. De tekenkininereceptor kwam stabiel tot expressie in CHO-K1-cellen.
De kininereceptor, wanneer geactiveerd door endogene kinine-neuropeptiden of andere agonisten met kleine moleculen, veroorzaakt Ca2+ afgifte uit calciumvoorraden in het cytoplasma. Deze calciumfluorescentietest in combinatie met een "dual-addition" -benadering kan functionele agonist en antagonist "hit" -moleculen in dezelfde testplaat detecteren. Elke test werd uitgevoerd met behulp van medicijnplaten met een array van 320 willekeurige kleine moleculen. Een betrouwbare Z'-factor van 0,7 werd verkregen en drie agonisten en twee antagonist-hitmoleculen werden geïdentificeerd wanneer de HTS zich op een eindconcentratie van 2 μM bevond. De hier gerapporteerde calciumfluorescentietest kan worden aangepast om andere GPCR's te screenen die de Ca2+ signaleringscascade activeren.

Een interne medicijnplaat (SAC2-34-6170) bestaande uit 320 willekeurige kleine moleculen werd gebruikt om deze HTS-test als voorbeeld te demonstreren. De HTS had een uitstekende testkwaliteit met een Z'-factor van 0,7 (tabel 1). Deze Z'-factor weerspiegelt de testkwaliteit onafhankelijk van de geteste verbindingen34. Een Z′-factor van 0,5 of hoger duidt op een goed dynamisch bereik van het testsignaal tussen de RFRA's van de positieve controles en de negati...

Watch this Scientific Journal Video about A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors at JoVE.com

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

In dit werk wordt een high-throughput, intracellulaire calciumfluorescentietest voor 384-well platen beschreven om kleine molecuulbibliotheken te screenen op recombinante G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCR's). Het doelwit, de kininereceptor van de runderkoortsteek, Rhipicephalus microplus, komt tot expressie in CHO-K1-cellen. Deze test identificeert agonisten en antagonisten die dezelfde cellen gebruiken in één "dual-addition" assay.

Een "Dual-Addition" Calcium Fluorescentie Assay voor de High-Throughput Screening van Recombinant G Protein-Coupled Receptors

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

De High-Throughput screening calciumfluorescentie dubbele additietest maakt identificatie mogelijk van nieuwe liganden met kleine moleculen van een G-eiwitgekoppelde receptor die door de intracellulaire calciumcascade signaleert. Het belangrijkste voordeel van de dual addition assay is de detectie van agonist en antagonist HTS in een enkele assay met dezelfde cellen mits het fluorescentiesignaal twee minuten duurt. Deze methode kan worden toegepast op elke GPCR die signaleert via de calciumcascade, die het grootste deel van de geleedpotige neuronpeptidefamilie, een GPCR, omvat.Voor de reproduceerbaarheid van de test is het belangrijk om de celdichtheid, injectiesnelheid en concentratie van de bekende agonist voor de tweede editie te optimaliseren. De procedure wordt gedemonstreerd door Bianca Henriques-Santos, postdoctoraal onderzoeksmedewerker in mijn laboratorium. Begin de calciumfluorescentietest door het gebruikte medium te verwijderen uit de T-75 kolf met 70 tot 90% confluente BMLK drie cellen.Was de cellen met 10 milliliter Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing of DPBS. Na het verwijderen van de DPBS, maak de cellen los met behulp van twee milliliter van 0,25% trypsine ethyleendiaminetetra-azijnzuur of EDTA en incubeer gedurende drie tot vijf minuten bij 37 graden Celsius. Voeg acht milliliter selectief medium toe en breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 milliliter.Voordat de celsuspensie gedurende drie minuten op 1000 x g wordt gecentrifugeerd. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de celpellet in 10 milliliter F-12K-medium met 1% foetaal runderserum of FBS en 400 microgram per milliliter G418-sulfaat. Om de celdichtheid van de suspensie voor verdere verdunning te bepalen, mengt u 20 microliter celsuspensie in 20 microliter van 0,4% trypanblauw en laadt u vervolgens 20 microlitermengsel in een celtelkamer om door een celteller te worden afgelezen voor celdichtheid.Verdun de celsuspensie met hetzelfde F-12K-medium en maak het uiteindelijke volume tot 15 milliliter bij een dichtheid van vier keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter. Om de cellen in de Poly-D lysine of PDL gecodeerde 384 putplaat te zaaien. Voeg 25 microliter van de verdunde celsuspensie toe aan 384 putjes van de plaat met behulp van een vloeistofbehandelingssysteem.Incubeer de plaat 's nachts bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide in de bevochtigde incubator. Keer de volgende dag snel de 90% confluent 384 putplaat om. Om het gebruikte medium te verwijderen en voorzichtig twee tot drie keer op steriele papieren handdoeken te vegen om alle vloeistof van de plaat te verwijderen.Voer de volgende stappen uit in het zachte dimlicht in de bioveiligheidskast. Voeg vervolgens 25 microliter van de ladingskleurstof toe aan elke put met behulp van een vloeistofbehandelingssysteem door 12,5 microliter in elke put te doseren met een aspiratie- en doseersnelheid van 3,8 microliter per seconde. Herhaal deze pipetteerstap om een eindvolume van 25 microliter in elke put te bereiken.Als u klaar bent, bedekt u de plaat met aluminiumfolie om deze te beschermen tegen omgevingslicht en incubeert u gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius in de bevochtigde incubator met koolstofdioxide. Na nog eens 30 minuten de afgedekte plaat in evenwicht te hebben gehouden, zijn de cellen klaar voor screening met hoge doorvoer of HTS. Centrifugeer vervolgens de medicijnplaat bij 1200 x g in een plaatcentrifuge gedurende één minuut.Breng de 10x agonist peptide oplossing van Rhimi-K-1 over in een 150 milliliter autovriendelijk reservoir. Klik in de plaatlezer op Protocollen beheren. Selecteer vervolgens in het eindpunt fluorescerende intensiteitsprotocol Flow Forte vooraf gelezen, klik op meting starten om het achtergrondsignaal voor de gehele HTS-test te meten.Plaats de celplaat in de plaatlezer. Klik in het instrumentenpaneel op een willekeurige put op de plaat en klik vervolgens op nieuwe scherpstelhoogte. Klik op focusaanpassing.Klik op versterkingsaanpassing. Wijs het toe als 5% tot 10% van de maximaal meetbare fluorescentiewaarde. Klik op Aanpassing starten.Klik op meet starten om de hele plaat af te lezen voor het achtergrondfluorescentiesignaal in relatieve fluorescentie-eenheden of RFU. Terwijl de plaat leest, klikt u op de huidige status om de realtime leeswaarde te zien. Voor de test met dubbele toevoeging pipet u 10 microliter van de geneesmiddeloplossing drie keer op en neer met behulp van het vloeistofbehandelingssysteem en aspirateert u 1,5 microliter uit elke put van de medicijnplaat met een aspiratiesnelheid van 1,0 microliter per seconde.Doseer 0,5 microliter van de verbindingen in de celtest om een uiteindelijke concentratie van twee micromolar in 0,2% dimethylsulfoxide of DMSO te bereiken. Nadat u de screeningsverbindingen hebt toegevoegd, plaatst u de testplaat onmiddellijk in de plaatlezer. Klik op het vooraf ingestelde leesprogramma en lees de plaat in de voorwaartse en omgekeerde leesrichting.Gooi één microliter geneesmiddeloplossing die in de uiteinden achterblijft weg door de uiteinden onder te dompelen in een afvalreservoir van 150 milliliter met ongeveer 50 milliliter DPBS. Incubeer de screeningsverbindingen met de cellen gedurende in totaal vijf minuten, inclusief de tijd in de plaatlezer in de bioveiligheidskast met de lichten uit. Voeg vervolgens drie microliter van het agonistpeptide Rhimi-K-1 uit het reservoir toe aan de testplaat met behulp van het vloeistofbehandelingssysteem met behulp van 384 12,5 microliterpunten.Plaats de plaat direct in de plaatlezer. Klik op het vooraf ingestelde leesprogramma en lees de plaat in de voorwaartse en omgekeerde leesrichting. Eenmaal gedaan, berekent u handmatig de Z'factor voor de kwaliteitscontrole van elke plaattest.Selecteer handmatig de hitmoleculen uit de heatmaps op het online HTS-dataplatform en bereken de genormaliseerde procentactivering of NPA en remmende activiteit, of I0 voor de agonisthits en antagonistische hits. Een interne medicijnplaat SAC2-34-6170 bestaande uit 320 willekeurige kleine moleculen werd gebruikt voor het demonstreren van deze HTS-test. De HTS had een uitstekende testkwaliteit met een Z'factor van 0,7, wat aangeeft dat de testkwaliteit onafhankelijk is van de geteste verbindingen.Het is essentieel om de plaat onmiddellijk na het toevoegen van de agonist te lezen, omdat het fluorescentiesignaal van korte duur is. Na deze procedure moet het geïdentificeerde hitmolecuul worden gevalideerd door middel van dosisresponstests en worden getest in cellen die de doel-GPCR niet tot expressie brengen om off-target hits uit te sluiten.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

High-throughput screening van Carbohydrate-afbrekende enzymen via innovatieve Onoplosbare chromogeen substraat Assay Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van het eiwit-eiwit interactie tussen HCN1 en TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Het meten van G-eiwit-gekoppelde Receptor Signaling via Radio-gelabeld GTP Binding

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Een eenvoudige methode voor High Throughput chemische Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Een High-Throughput Luciferase Assay te evalueren proteolyse van de Single-omzet Protease-PCSK9

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Een semi-High-throughput adaptatie van de NADH-gekoppelde ATPase-assay voor het screenen van kleine molecuul remmers

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

High-throughput totale interne reflectie fluorescentie en directe stochastische optische reconstructie microscopie met behulp van een Photonic chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Volledig verwerkte recombinant KRAS4b: isoleren en karakteriseren van het Farnesylated en gemethyleerd eiwit

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Strategische screening en karakterisering van de Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex voor succesvolle kristallisatie

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Op klikchemie gebaseerde fluorometrische test voor Apolipoproteïne N-acyltransferase van enzymkarakterisering naar screening met hoge doorvoer

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...