Name: a "dual-addition" calcium fluorescence assay for the high-throughput screening of recombinant g protein-coupled receptors
Uploaded: 2022-12-02T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch den USDA-NIFA-AFRI Animal Health and Well-Being Award (Preisnummer 2022-67015-36336, PVP [Projektleiter]) und aus wettbewerbsfähigen Mitteln des Texas A&M AgriLife Research Insect Vector Diseases Grant Program (FY'22-23) an P.V.P. unterstützt. Die A.W.E.S.O.M.E.-Fakultätsgruppe des College of Agriculture and Life Sciences, TAMU, wird für die Hilfe bei der Bearbeitung des Manuskripts gedankt. Die Zusatztabelle S2 enthält Daten aus einer internen, zufälligen, kleinmolekularen Bibliothek, die aus dem Labor von Dr. James Sacchettini an der Texas A&M University und Texas A&M AgriLife Research stammt.

1. Zellerhaltung
HINWEIS: EINE CHO-K1-Zelllinie, die den Kinin-Rezeptor von R. microplus stabil exprimiert, genannt BMLK3, wurde von Holmes et al. entwickelt.16 Die Einzelheiten der Entwicklung der Zelllinie werden an anderer Stelle14 dargestellt. Alle folgenden Schritte werden unter sterilen Bedingungen in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II durchgeführt.
<ol><li>Züchten Sie die rekombinante Zellli...

<ol>
	<li>Hanlon, C. D., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outside-in+signaling+-+A+brief+review+of+GPCR+signaling+with+a+focus+on+the+Drosophila+GPCR+family.">Outside-in signaling - A brief review of GPCR signaling with a focus on the Drosophila GPCR family.</a> Journal of Cell Science. 128 (19), 3533-3542 (2015).</li><li>Liu, N., Li, T., Wang, Y., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein+coupled+receptors+(GPCRs)+in+insects-A+potential+target+for+new+insecticide+development.">G-protein coupled receptors (GPCRs) in insects-A potential target for new insecticide development.</a> Molecules. 26 (10), 2993 (2021).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. 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L., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+genetic+characterization+of+neuropeptide+Y-like+receptors+in+Aedes+aegypti.">Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 2486 (2013).</li><li>Lu, H. L., Kersch, C. N., Taneja-Bageshwar, S., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+calcium+bioluminescence+assay+for+functional+analysis+of+mosquito+(Aedes+aegypti)+and+tick+(Rhipicephalus+microplus)+G+protein-coupled+receptors.">A calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (Aedes aegypti) and tick (Rhipicephalus microplus) G protein-coupled receptors.</a> Journal of Visualized Experiments. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+leucokinin-like+peptide+receptor+from+the+cattle+fever+tick,+Rhipicephalus+microplus,+is+localized+in+the+midgut+periphery+and+receptor+silencing+with+validated+double-stranded+RNAs+causes+a+reproductive+fitness+cost.">The leucokinin-like peptide receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, is localized in the midgut periphery and receptor silencing with validated double-stranded RNAs causes a reproductive fitness cost.</a> International Journal for Parasitology. 49 (3-4), 287-299 (2019).</li><li>N&#228;ssel, D. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+pair+of+leucokinin+neurons+are+modulated+by+feeding+state+and+regulate+sleep-metabolism+interactions.">A single pair of leucokinin neurons are modulated by feeding state and regulate sleep-metabolism interactions.</a> PLoS Biology. 17 (2), 2006409 (2019).</li><li>N&#228;ssel, D. R., Zandawala, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+neuropeptide+signaling+in+Drosophila,+from+genes+to+physiology+and+behavior.">Recent advances in neuropeptide signaling in Drosophila, from genes to physiology and behavior.</a> Progress in Neurobiology. 179, 101607 (2019).</li><li>Okusawa, S., Kohsaka, H., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+and+downstream+leucokinin+neurons+modulate+larval+turning+behavior+in+Drosophila.">Serotonin and downstream leucokinin neurons modulate larval turning behavior in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 34 (7), 2544-2558 (2014).</li><li>Kersch, C. N., Pietrantonio, P. 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H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).</li><li>Offermanns, S., Simon, M. 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Das Ziel von HTS ist es, Treffermoleküle durch das Screening einer großen Anzahl kleiner Moleküle zu identifizieren. Daher stellen die Ergebnisse dieses Beispiels nur einen kleinen Teil eines konventionellen HTS-Experiments dar. Darüber hinaus müssen die identifizierten Treffermoleküle in nachgeschalteten Assays validiert werden, wie z. B. einem dosisabhängigen Assay an derselben rekombinanten Zelllinie und an einer CHO-K1-Zelllinie, die nur den leeren Vektor trägt, was gleichzeitig durchgeführt werden kann, um ...

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), die von der Hefe bis zum Menschen vorhanden sind, stellen die größte Superfamilie von Rezeptoren in vielen Organismen dar1. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung fast aller biologischen Prozesse bei Tieren. Es gibt 50-200 GPCRs im Genom von Arthropoden, was bedeutet, dass sie die größte Membranrezeptor-Superfamilie2 darstellen. Sie werden in sechs Hauptklassen, A-F, eingeteilt, basierend auf ihrer Sequenzähnlichkeit und ihren Funktionen3. GPCRs transduzieren verschiedene extrazelluläre Signale, wie z.B. die von Hormonen, Neuropeptiden, biogenen Aminen, Glutamat, Protonen, Lipoglykoproteinen und Photonen4. GPCRs koppeln an heterotrimere G-Proteine (Gα, Gβ und Gγ), um nachgeschaltete Signale zu übertragen. GPCRs, die an Gαs oder Gαi/o-Proteine gekoppelt sind, erhöhen bzw. senken die intrazellulären 3', 5'-zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP)-Spiegel durch Aktivierung oder Hemmung der Adenylylcyclase. GPCRs, die an Gαq/11 gekoppelt sind, induzieren die Freisetzung von Kalzium aus den Kalziumspeichern des endoplasmatischen Retikulums, indem sie den Phospholipase C (PLC)-Inositol-1,4,5-triphosphat (IP3) -Weg aktivieren. GPCRs, die an Gα12/13 gekoppelt sind, aktivieren die RhoGTPase-Nukleotidaustauschfaktoren 5,6. GPCRs sind das Ziel von mehr als 50% der Humanarzneimittel und eines Akarizids, Amitraz4. Da GPCRs so unterschiedliche Signale übertragen, sind sie vielversprechende Ziele für die Entwicklung neuartiger Pestizide, die wirbellose physiologische Funktionen stören.
Das Ziel von HTS ist es, Hit-Moleküle zu identifizieren, die Rezeptorfunktionen modulieren können. HTS umfasst Assay-Entwicklung, Miniaturisierung und Automatisierung7. Arthropoden-Neuropeptid-GPCRs sind an den meisten physiologischen Funktionen wie Entwicklung, Häutung und Ekdysis, Ausscheidung, Energiemobilisierung und Fortpflanzungbeteiligt 4. Die meisten Neuropeptid-GPCRs von Arthropoden und Metazoen signalisieren durch die Calcium-Signalkaskade 2,6,8,9,10, wie z.B. in den myoinhibitorischen Peptid- und SIFamid-Rezeptoren der schwarzbeinigen Zecke Ixodes scapularis; Ihre Liganden sind in den Motilitätstests des Hinterdarms antagonistisch, wobei SIF eine Kontraktion auslöst und MIP sie hemmt11,12. Ein NPY-ähnlicher Rezeptor der Gelbfiebermücke, Aedes aegypti, reguliert die weibliche Wirtssuche13. Im Vergleich zu anderen alternativen Calcium-Mobilisierungsassays, wie dem Aequorin-Calcium-Biolumineszenz-Assay14, ist der Calcium-Fluoreszenz-Assay einfach durchzuführen, erfordert keine Transfektion anderer rekombinanter Calcium-Detektionsproteine und ist kostengünstig. Der Calcium-Fluoreszenz-Assay erzeugt ein verlängertes Signal im Vergleich zu dem schnellen kinetischen Signal, das im Aequorin-Calcium-Biolumineszenz-Assay14,15 erhalten wurde.
Im vorliegenden Beispiel wurde der Kinin-Rezeptor aus der Rinderpestzecke Rhipicephalus microplus rekombinant in der CHO-K1-Zelllinie exprimiert und für den Calciumfluoreszenz-Assay verwendet. Es gibt nur ein Kinin-Rezeptor-Gen in R. microplus; Der Rezeptor signalisiert über einen Gq-Protein-abhängigen Signalweg und löst den Ausfluss von Ca2+ aus Calciumspeichern in den intrazellulären Raum16 aus. Dieser Prozess kann durch ein Fluorophor nachgewiesen und quantifiziert werden, das bei der Bindung von Calciumionen ein Fluoreszenzsignal auslöst (Abbildung 1).
Der Kinin-Rezeptor ist ein wirbellosen-spezifischer GPCR, der zu den Klasse-A-Rhodopsin-ähnlichen Rezeptoren gehört. Kinin ist ein uraltes Signal-Neuropeptid, das in Mollusca, Crustacea, Insecta und Acari 4,17,18 vorkommt. Coleopteren (Käfer) fehlt das Kinin-Signalsystem; In der Mücke Aedes aegypti gibt es nur einen Kinin-Rezeptor, der drei Aedeskinine bindet, während Drosophila melanogaster einen Kinin-Rezeptor mit Drosokinin als einzigartigem Ligandenhat 19,20,21. Bei Wirbeltieren gibt es keine homologen Kinine oder Kininrezeptoren. Obwohl die genaue Funktion von Kinin bei Zecken unbekannt ist, zeigen die Kininrezeptor-RNAi-stillgelegten Weibchen von R. microplus eine signifikant reduzierte Fortpflanzungsfähigkeit22. Kinine sind pleotrope Peptide in Insekten. Bei Drosophila melanogaster sind sie sowohl am zentralen als auch am peripheren Nervensystembeteiligt 23, an der Präekdysis24, an der Nahrungsaufnahme25, am Stoffwechsel 26 und an den Schlafaktivitätsmustern 26,27 sowie an der Fortbewegung der Larven 28. Kinine regulieren die Kontraktion des Hinterdarms, die Diurese und die Fütterung der Mücke A. aegypti 29,30,31. Die Kininpeptide weisen ein konserviertes C-terminales Pentapeptid Phe-X1-X2-Trp-Gly-NH2 auf, das die minimal erforderliche Sequenz für die biologische Aktivität32 darstellt. Die Arthropodenspezifität, die geringe Größe des endogenen Liganden, die sie für kleinmolekulare Interferenzen empfänglich macht, und die pleiotropen Funktionen bei Insekten machen den Kininrezeptor zu einem vielversprechenden Ziel für die Schädlingsbekämpfung4.
Der "Dual-Addition"-Assay (Abbildung 2) ermöglicht die Identifizierung von Agonisten oder Antagonisten im selben HTS-Assay15. Es basiert auf einem "Dual-Addition"-Assay, der in der pharmazeutischen Industrie häufig für die Wirkstoffforschung verwendet wird33. Kurz gesagt, die erste Zugabe von Medikamenten in die Zellplatte ermöglicht die Identifizierung potenzieller Agonisten in der chemischen Bibliothek, wenn ein höheres Fluoreszenzsignal im Vergleich zur Anwendung der Lösungsmittelkontrolle detektiert wird. Nach 5 Minuten Inkubation mit diesen kleinen Molekülen wird ein bekannter Agonist (Kinin-Peptid) auf alle Vertiefungen aufgetragen. Diejenigen Vertiefungen, die zufällig einen Antagonisten von der Wirkstoffplatte erhielten, zeigen ein niedrigeres Fluoreszenzsignal bei der Agonistenzugabe im Vergleich zu den Kontrolltöpfen, die das Lösungsmittel bei der ersten Zugabe erhielten. Dieser Assay ermöglicht dann die Identifizierung potenzieller Agonisten und Antagonisten mit den gleichen Zellen. In einem Standard-HTS-Projekt würden diese Hit-Moleküle durch Dosis-Wirkungs-Assays und durch zusätzliche biologische Aktivitätsassays, die hier nicht gezeigt werden, weiter validiert.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64505/64505fig01.jpg"> Abbildung 1: Illustration des Calciumfluoreszenz-Assay-Mechanismus. Das Gq-Protein löst den intrazellulären Kalzium-Signalweg aus. Der Kinin-Rezeptor (G-Protein-gekoppelter Rezeptor) wurde in CHO-K1-Zellen rekombinant exprimiert. Wenn der Agonistenligand an den Rezeptor bindet, aktiviert das mit dem Kininrezeptor assoziierte Gq-Protein PLC, das die Umwandlung eines PIP-2-Moleküls in IP3 und DAG katalysiert. IP 3 bindet dann an die IP3R auf der Oberfläche des endoplasmatischen Retikulums, was zur Freisetzung von Ca 2 + in das Zytoplasma führt, wo Ca2 + -Ionen an die Fluorophore binden und ein Fluoreszenzsignal auslösen. Das Fluoreszenzsignal kann durch Anregung bei 490 nm erhalten und bei 514 nm detektiert werden. Abkürzungen: GPCR = G-Protein-gekoppelter Rezeptor; PLC = phospholipase C; PIP2 = Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat; IP3 = Inositoltrisphosphat; DAG = Diacylglycerin; IP 3 R =IP-3-Empfänger. Erstellt mit BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64505/64505fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64505/64505fig02.jpg"> Abbildung 2: Der Arbeitsablauf für das Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülen auf einem G-Protein-gekoppelten Rezeptor, der in CHO-K1-Zellen exprimiert wird. (A) Rekombinante CHO-K1-Zellen, die den Kinin-Rezeptor stabil exprimieren, wurden unter Verwendung eines Liquid-Handling-Systems (25 μL/Well) in die 384-Well-Platte (10.000 Zellen/Well) gegeben und in einem befeuchteten CO2 -Inkubator für 12-16 h inkubiert. ) Der Assay-Puffer, der den Fluoreszenzfarbstoff (25 μl/Well) enthielt, wurde unter Verwendung eines Liquid-Handling-Systems in die Zellplatte gegeben. Die Platte wurde für 30 min bei 37 °C für 30 min inkubiert und bei RT für weitere 30 min äquilibriert. (C) Das Hintergrundfluoreszenzsignal der Zellen in jeder Vertiefung wurde mit einem Plattenleser gemessen. (D) Arzneimittellösungen aus einer Bibliotheksplatte mit 384 Vertiefungen und ein Leerlösungsmittel (alle mit 0,5 μl/Well) wurden unter Verwendung eines Liquid-Handling-Systems in die zelluläre Assayplatte gegeben. (E) Die zellulären Calciumfluoreszenzreaktionen wurden unmittelbar nach der Zugabe der Arzneimittellösungen mit dem Plattenleser gemessen; Verbindung(en), die überdurchschnittliche Fluoreszenzsignale hervorruft, wurden als Agonisten-Treffer ausgewählt. Antagonisten-Treffer, die die GPCR blockieren (Symbol unten), wurden nach der Zugabe des Peptidagonisten während Schritt G aufgedeckt. (F) In der gleichen Testplatte wurde nach 5 min Inkubation der Zellen mit Screening-Verbindungen ein endogenes Agonistenpeptid Rhimi-K-1 (QFSPWGamid) des Zeckenkininrezeptors zu jeder Vertiefung (1 μM) gegeben. (G) Zelluläre Fluoreszenzreaktionen nach der Agonisten-Peptidaddition wurden vom Plattenleser sofort gemessen. Verbindung(en), die das Fluoreszenzsignal hemmen, wurden als Antagonisten-Treffer ausgewählt. Abkürzungen: GPCR = G-Protein-gekoppelter Rezeptor; RT = Raumtemperatur; RFU = relative Fluoreszenzeinheiten. Erstellt mit BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64505/64505fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>15050-065</td>
			<td>with phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% trypan blue</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td>liquid, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM12400</td>
			<td>RNase-free Microfuge Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-045</td>
			<td>Corning Costar Stripette individually wrapped&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-047</td>
			<td>Corning Costar Stripette individually wrapped&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L filter tips</td>
			<td>USA Scientifc Inc.</td>
			<td>P1121</td>
			<td>sterile, barrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-049</td>
			<td>Corning Costar Stripette individually wrapped&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>graduated, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL auto-friendly reservior</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>6317</td>
			<td>sterile, individually wrapped for cell seeding in day 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL auto-friendly reservior</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>6318</td>
			<td>sterile, stacked, for loading dye in day 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384/ 12.5 &#181;L low retention tips</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>6405</td>
			<td>long, sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384/ 12.5 &#181;L tips</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>6404</td>
			<td>long, sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781091</td>
			<td>CELLSTAR, clear polystyrene, &#181;Clear, Black/Flat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum plate seals</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>PCR-AS-200</td>
			<td>polyester-based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil wrap</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafty cabinet II</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-540-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>AutoT4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell counting slides</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>SD-100</td>
			<td>20 &#181;L chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 humidified incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Forma Series II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desk Lamp</td>
			<td>SunvaleeyTEK</td>
			<td>RS1000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>276855</td>
			<td>anhydous, &#62;99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>DPBS, 1x without calcium amd magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12K Nutrient Mixture&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-354</td>
			<td>(Kaighn&#39;s Mod.) with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>SFBU30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent calcium assay kit</td>
			<td>ENZO Lifescience</td>
			<td>ENZ-51017</td>
			<td>10x96 tests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 sulfate</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>10131-027</td>
			<td>Geneticin selective antibiotic 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s buffer</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>55037C</td>
			<td>HBSS modified, with calcium, with magnesium, without phenol read</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>1 Molar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTS data storage plateform</td>
			<td>CDD vault&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://www.collaborativedrug.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid handling system</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>Viaflo</td>
			<td>384/12.5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Sorvall ST8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BMG technology</td>
			<td>Clariostar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhimi-K-1 agonist peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>custom order</td>
			<td>QFSPWGamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a "dual-addition" calcium fluorescence assay for the high-throughput screening of recombinant g protein-coupled receptors

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) stellen die größte Superfamilie von Rezeptoren dar und sind das Ziel zahlreicher Humanmedikamente. Das Hochdurchsatz-Screening (HTS) von zufälligen niedermolekularen Bibliotheken gegen GPCRs wird von der pharmazeutischen Industrie für die zielgerichtete Wirkstoffforschung eingesetzt. In dieser Studie wurde ein HTS eingesetzt, um neuartige niedermolekulare Liganden von wirbellosen-spezifischen Neuropeptid-GPCRs als Sonden für physiologische Untersuchungen von Vektoren tödlicher human- und veterinärmedizinischer Krankheitserreger zu identifizieren.
Der wirbellose Kinin-Rezeptor wurde als Ziel gewählt, weil er viele wichtige physiologische Prozesse bei Wirbellosen reguliert, einschließlich Diurese, Fütterung und Verdauung. Darüber hinaus ist die Pharmakologie vieler wirbelloser GPCRs schlecht oder gar nicht charakterisiert; Daher fügt die differentielle Pharmakologie dieser Rezeptorgruppen in Bezug auf die verwandten GPCRs in anderen Metazoen, insbesondere beim Menschen, Erkenntnisse über die Struktur-Wirkungs-Beziehungen von GPCRs als Superfamilie hinzu. Ein HTS-Assay wurde für Zellen in 384-Well-Platten entwickelt, um Liganden des Kinin-Rezeptors aus der Rinderpestzecke oder der südlichen Rinderzecke Rhipicephalus microplus zu entdecken. Der Zecken-Kinin-Rezeptor wurde in CHO-K1-Zellen stabil exprimiert.
Der Kinin-Rezeptor löst, wenn er durch endogene Kinin-Neuropeptide oder andere niedermolekulare Agonisten aktiviert wird, die Freisetzung von Ca2+ aus den Kalziumspeichern in das Zytoplasma aus. Dieser Calciumfluoreszenz-Assay in Kombination mit einem "Dual-Addition"-Ansatz kann funktionelle Agonisten- und Antagonisten-"Hit"-Moleküle in derselben Assayplatte nachweisen. Jeder Assay wurde unter Verwendung von Wirkstoffplatten durchgeführt, die eine Anordnung von 320 zufälligen kleinen Molekülen enthielten. Es wurde ein zuverlässiger Z'-Faktor von 0,7 erhalten, und drei Agonisten- und zwei Antagonisten-Hit-Moleküle wurden identifiziert, wenn das HTS eine Endkonzentration von 2 μM aufwies. Der hier beschriebene Calciumfluoreszenz-Assay kann angepasst werden, um andere GPCRs zu screenen, die die Ca2+ -Signalkaskade aktivieren.

Eine hauseigene Wirkstoffplatte (SAC2-34-6170), die aus 320 zufälligen kleinen Molekülen besteht, wurde als Beispiel für die Demonstration dieses HTS-Assays verwendet. Das HTS hatte eine ausgezeichnete Assay-Qualität mit einem Z'-Faktor von 0,7 (Tabelle 1). Dieser Z'-Faktor spiegelt die Assay-Qualität unabhängig von den getesteten Verbindungenwider 34. Ein Z'-Faktor von 0,5 oder höher zeigt einen guten Assay-Signaldynamikbereich zwischen den RFUs der P...

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A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

In dieser Arbeit wird ein intrazellulärer Hochdurchsatz-Calciumfluoreszenz-Assay für 384-Well-Platten beschrieben, um kleine Molekülbibliotheken auf rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) zu screenen. Das Ziel, der Kinin-Rezeptor aus der Rinderpestzecke Rhipicephalus microplus, wird in CHO-K1-Zellen exprimiert. Dieser Assay identifiziert Agonisten und Antagonisten unter Verwendung der gleichen Zellen in einem "Dual-Addition"-Assay.

Ein "Dual-Addition"-Calciumfluoreszenz-Assay für das Hochdurchsatz-Screening von rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

Der Hochdurchsatz-Screening-Calciumfluoreszenz-Dual-Additions-Assay ermöglicht die Identifizierung neuartiger niedermolekularer Liganden eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors, der durch die intrazelluläre Calciumkaskade signalisiert. Der Hauptvorteil des Dual-Additions-Assays ist der Nachweis von Agonist und Antagonist HTS in einem einzigen Assay mit den gleichen Zellen, vorausgesetzt, das Fluoreszenzsignal dauert zwei Minuten. Diese Methode kann auf jeden GPCR angewendet werden, der durch die Calciumkaskade signalisiert, zu der der größte Teil der Arthropoden-Neuronen-Peptidfamilie, eines GPCRs, gehört.Für die Reproduzierbarkeit des Assays ist es wichtig, die Zelldichte, die Injektionsgeschwindigkeit und die Konzentration des bekannten Agonisten für die zweite Auflage zu optimieren. Das Verfahren wird von Bianca Henriques-Santos, Postdoktorandin in meinem Labor, demonstriert. Der Calciumfluoreszenztest wird eingeleitet, indem das verbrauchte Medium aus dem T-75-Kolben entnommen wird, der drei Zellen mit 70 bis 90 % konfluentem BMLK enthält.Waschen Sie die Zellen mit 10 Milliliter Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder DPBS. Nach dem Entfernen des DPBS die Zellen mit zwei Millilitern 0,25%igem Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure oder EDTA ablösen und drei bis fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Geben Sie acht Milliliter selektives Medium hinzu und überführen Sie die Zellsuspension in ein konisches Röhrchen mit einem Fassungsvermögen von 15 Milliliter.Vor dem Zentrifugieren der Zellsuspension bei 1000 x g für drei Minuten. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 Milliliter F-12K-Medium, das 1% fötales Rinderserum oder FBS und 400 Mikrogramm pro Milliliter G418-Sulfat enthält. Um die Zelldichte der Suspension für eine weitere Verdünnung zu bestimmen, mischen Sie 20 Mikroliter Zellsuspension in 20 Mikroliter 0,4% Trypanblau und laden Sie dann 20 Mikroliter Gemisch in eine Zellzählkammer, um von einem Zellzähler auf Zelldichte abgelesen zu werden.Verdünnen Sie die Zellsuspension mit dem gleichen F-12K-Medium und füllen Sie das Endvolumen auf 15 Milliliter bei einer Dichte von viermal 10 bis fünf Zellen pro Milliliter auf. Zur Aussaat der Zellen in der Poly-D-Lysin- oder PDL-kodierten 384-Well-Platte. Geben Sie 25 Mikroliter der verdünnten Zellsuspension mit einem Liquid-Handling-System in 384 Vertiefungen der Platte.Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid im befeuchteten Inkubator. Am nächsten Tag drehen Sie die 90%ige konfluente 384-Well-Platte schnell um. Um das verbrauchte Medium zu entfernen und zwei- bis dreimal vorsichtig auf sterile Papiertücher zu tupfen, um die gesamte Flüssigkeit von der Platte zu entfernen.Führen Sie die nächsten Schritte im weichen Dämmerlicht im Inneren der Biosicherheitswerkbank durch. Als nächstes fügen Sie 25 Mikroliter des Beladungsfarbstoffs in jede Vertiefung mit einem Liquid-Handling-System hinzu, indem Sie 12,5 Mikroliter in jede Vertiefung mit einer Aspirations- und Dosiergeschwindigkeit von 3,8 Mikrolitern pro Sekunde dosieren. Wiederholen Sie diesen Pipettierschritt, um ein Endvolumen von 25 Mikrolitern in jeder Vertiefung zu erreichen.Wenn Sie fertig sind, decken Sie die Platte mit Aluminiumfolie ab, um sie vor Umgebungslicht zu schützen, und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius im Kohlendioxid-befeuchteten Inkubator für 30 Minuten. Nach dem Äquilibrieren der abgedeckten Platte für weitere 30 Minuten sind die Zellen bereit für das Hochdurchsatz-Screening oder HTS. Als nächstes zentrifugieren Sie die Arzneimittelplatte bei 1200 x g in einer Plattenzentrifuge für eine Minute.Die 10-fache Agonisten-Peptidlösung von Rhimi-K-1 wird in ein autofreundliches 150-Milliliter-Reservoir überführt. Klicken Sie im Plattenleser auf Protokolle verwalten. Wählen Sie dann im Endpunkt-Fluoreszenzintensitätsprotokoll die Option Flow Forte pre-read aus, klicken Sie auf Messung starten, um das Hintergrundsignal für den gesamten HTS-Assay zu messen.Setzen Sie die Zellplatte in das Plattenlesegerät ein. Klicken Sie in der Instrumententafel auf eine zufällige Vertiefung auf der Platte und dann auf neue Fokushöhe. Klicken Sie auf Fokusanpassung.Klicken Sie auf Verstärkungseinstellung. Weisen Sie ihm 5 % bis 10 % des maximal messbaren Fluoreszenzwerts zu. Klicken Sie auf Anpassung starten.Klicken Sie auf Messung starten, um die gesamte Platte für das Hintergrundfluoreszenzsignal in relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) zu lesen. Klicken Sie während des Lesens der Platte auf den aktuellen Status, um den Messwert in Echtzeit anzuzeigen. Für den Dual-Addition-Assay pipettieren Sie 10 Mikroliter der Arzneimittellösung dreimal mit dem Liquid-Handling-System auf und ab und saugen 1,5 Mikroliter aus jeder Vertiefung der Arzneimittelplatte mit einer Aspirationsgeschwindigkeit von 1,0 Mikrolitern pro Sekunde ab.0,5 Mikroliter der Verbindungen werden in den Zellassay gegeben, um eine Endkonzentration von zwei Mikromolaren in 0,2%igem Dimethylsulfoxid oder DMSO zu erreichen. Nach Zugabe der Screening-Verbindungen wird die Assay-Platte sofort in den Plattenleser eingesetzt. Klicken Sie auf das voreingestellte Leseprogramm und lesen Sie die Platte in Vorwärts- und Rückwärtsleserichtung.Entsorgen Sie einen Mikroliter Arzneimittellösung, der in den Deponien verbleibt, indem Sie die Deponien in ein 150-Milliliter-Abfallreservoir mit etwa 50 Millilitern DPBS eintauchen. Inkubieren Sie die Screening-Verbindungen mit den Zellen für insgesamt fünf Minuten, einschließlich der Zeit im Plattenleser in der Biosicherheitswerkbank bei ausgeschaltetem Licht. Als nächstes werden drei Mikroliter des Agonistenpeptids Rhimi-K-1 aus dem Reservoir in die Testplatte gegeben, wobei das Liquid-Handling-System mit 384 12,5-Mikroliter-Spitzen verwendet wird.Legen Sie die Platte sofort in den Plattenleser. Klicken Sie auf das voreingestellte Leseprogramm und lesen Sie die Platte in Vorwärts- und Rückwärtsleserichtung. Berechnen Sie den Z'-Faktor für die Qualitätskontrolle jedes Plattenassays manuell.Wählen Sie die Treffermoleküle manuell aus den Heatmaps auf der Online-HTS-Datenplattform aus und berechnen Sie die normalisierte prozentuale Aktivierung oder NPA und inhibitorische Aktivität oder I0 für die Agonistentreffer und Antagonistentreffer. Zur Demonstration dieses HTS-Assays wurde eine hauseigene Wirkstoffplatte SAC2-34-6170 verwendet, die aus 320 zufälligen kleinen Molekülen besteht. Das HTS hatte eine ausgezeichnete Assay-Qualität mit einem Z'-Faktor von 0,7, was widerspiegelt, dass die Assay-Qualität unabhängig von den getesteten Verbindungen ist.Es ist wichtig, die Platte sofort nach der Zugabe des Agonisten zu lesen, da das Fluoreszenzsignal nur von kurzer Dauer ist. Nach diesem Verfahren sollte das identifizierte Treffermolekül durch Dosis-Wirkungs-Assays validiert und in Zellen getestet werden, die den Ziel-GPCR nicht exprimieren, um Off-Target-Treffer auszuschließen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Hochdurchsatz-Screening von Kohlenhydrat-abbauenden Enzymen Neuartige Unlöslich chromogenen Assays Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Forschung

Biochemie

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Verfahren zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren des Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen HCN1- und TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Messung der G-Protein-gekoppelten Rezeptorsignalisierung über radioaktiv markierte GTP-Bindung

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Ein High-Throughput Luciferase Assay Proteolyse von Single-Umsatz Protease PCSK9 bewerten

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Eine semi-High-Throughput-Anpassung des NADH-gekoppelten ATPase-Assays zum Screening kleiner Molekülinhibitoren

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Hochdurchsatz totale interne Reflexionfluoreszenz und direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie mit einem Photonischen Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Vollverarbeitetes rekombinantes KRAS4b: Isoliert und charakterisieren das farnesylierte und methylierte Protein

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Strategisches Screening und Charakterisierung des Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex für eine erfolgreiche Kristallisation

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Klickchemischer fluorometrischer Assay für Apolipoprotein-N-Acyltransferase von der Enzymcharakterisierung bis zum Hochdurchsatz-Screening

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...