Name: a "dual-addition" calcium fluorescence assay for the high-throughput screening of recombinant g protein-coupled receptors
Uploaded: 2022-12-02T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av USDA-NIFA-AFRI Animal Health and Well-Being Award (Prisnummer 2022-67015-36336, PVP [Prosjektdirektør]) og fra konkurransedyktige midler fra Texas A&M AgriLife Research Insect Vector Diseases Grant Program (FY'22-23) til P.V.P. A.W.E.S.O.M.E. fakultetsgruppen ved College of Agriculture and Life Sciences, TAMU, er anerkjent for hjelp til å redigere manuskriptet. Supplerende tabell S2 inneholder data fra et internt, tilfeldig, lite molekylbibliotek hentet fra Dr. James Sacchettinis laboratorium ved Texas A&M University og Texas A&M AgriLife Research.

1. Cell vedlikehold
MERK: EN CHO-K1-cellelinje som stabilt uttrykker kininreseptoren fra R. microplus, kalt BMLK3, ble utviklet av Holmes et al.16. Detaljene om utviklingen av cellelinjen presenteres andre steder14. Alle følgende trinn utføres under sterile forhold i et biosikkerhetsskap i klasse II.
<ol><li>Dyrk den rekombinante cellelinjen i selektive medier (F-12K-medium som inneholder 10% føtalt bovin...

<ol>
	<li>Hanlon, C. D., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outside-in+signaling+-+A+brief+review+of+GPCR+signaling+with+a+focus+on+the+Drosophila+GPCR+family.">Outside-in signaling - A brief review of GPCR signaling with a focus on the Drosophila GPCR family.</a> Journal of Cell Science. 128 (19), 3533-3542 (2015).</li><li>Liu, N., Li, T., Wang, Y., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein+coupled+receptors+(GPCRs)+in+insects-A+potential+target+for+new+insecticide+development.">G-protein coupled receptors (GPCRs) in insects-A potential target for new insecticide development.</a> Molecules. 26 (10), 2993 (2021).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 639-650 (2002).</li><li>Pietrantonio, P. V., Xiong, C., Nachman, R. J., Shen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptors+in+arthropod+vectors:+Omics+and+pharmacological+approaches+to+elucidate+ligand-receptor+interactions+and+novel+organismal+functions.">G protein-coupled receptors in arthropod vectors: Omics and pharmacological approaches to elucidate ligand-receptor interactions and novel organismal functions.</a> Current Opinion in Insect Science. 29, 12-20 (2018).</li><li>Hilger, D., Masureel, M., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+GPCR+signaling+complexes.">Structure and dynamics of GPCR signaling complexes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (1), 4-12 (2018).</li><li>Liu, N., Wang, Y., Li, T., Feng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein+coupled+receptors+(GPCRs):+Signaling+pathways,+characterization,+and+functions+in+insect+physiology+and+toxicology.">G-protein coupled receptors (GPCRs): Signaling pathways, characterization, and functions in insect physiology and toxicology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (10), 5260 (2021).</li><li>Hansen, K. B., Br&#228;uner-Osborne, H., Leifert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIPR&#174;+assays+of+intracellular+calcium+in+GPCR+drug+discovery.">FLIPR&#174; assays of intracellular calcium in GPCR drug discovery.</a> G Protein-Coupled Receptors in Drug Discovery. , (2009).</li><li>Bauknecht, P., Jekely, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+combinatorial+deorphanization+of+Platynereis+neuropeptide+GPCRs.">Large-scale combinatorial deorphanization of Platynereis neuropeptide GPCRs.</a> Cell Reports. 12 (4), 684-693 (2015).</li><li>Frooninckx, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+GPCRs+in+C.+elegans.">Neuropeptide GPCRs in C. elegans.</a> Frontiers in Endocrinology. 3, 167 (2012).</li><li>Caers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+two+decades+of+research+on+insect+neuropeptide+GPCRs:+An+overview.">More than two decades of research on insect neuropeptide GPCRs: An overview.</a> Frontiers in Endocrinology. 3, 151 (2012).</li><li>&#352;imo, L., Ko&#269;i, J., Park, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptors+for+the+neuropeptides,+myoinhibitory+peptide+and+SIFamide,+in+control+of+the+salivary+glands+of+the+blacklegged+tick+Ixodes+scapularis.">Receptors for the neuropeptides, myoinhibitory peptide and SIFamide, in control of the salivary glands of the blacklegged tick Ixodes scapularis.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (4), 376-387 (2013).</li><li>&#352;imo, L., Park, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptidergic+control+of+the+hindgut+in+the+black-legged+tick+Ixodes+scapularis.">Neuropeptidergic control of the hindgut in the black-legged tick Ixodes scapularis.</a> International Journal for Parasitology. 44 (11), 819-826 (2014).</li><li>Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+genetic+characterization+of+neuropeptide+Y-like+receptors+in+Aedes+aegypti.">Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 2486 (2013).</li><li>Lu, H. L., Kersch, C. N., Taneja-Bageshwar, S., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+calcium+bioluminescence+assay+for+functional+analysis+of+mosquito+(Aedes+aegypti)+and+tick+(Rhipicephalus+microplus)+G+protein-coupled+receptors.">A calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (Aedes aegypti) and tick (Rhipicephalus microplus) G protein-coupled receptors.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2732 (2011).</li><li>Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cattle+fever+tick,+Rhipicephalus+microplus,+as+a+model+for+forward+pharmacology+to+elucidate+kinin+GPCR+function+in+the+Acari.">The cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, as a model for forward pharmacology to elucidate kinin GPCR function in the Acari.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1008 (2019).</li><li>Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+a+G+protein-coupled+receptor+from+the+Southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+(Acari:+Ixodidae)+identifies+it+as+the+first+arthropod+myokinin+receptor.">Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor.</a> Insect Molecular Biology. 12 (1), 27-38 (2003).</li><li>Cox, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning,+characterization,+and+expression+of+a+G-protein-coupled+receptor+from+Lymnaea+stagnalis+and+identification+of+a+leucokinin-like+peptide,+PSFHSWSamide,+as+its+endogenous+ligand.">Cloning, characterization, and expression of a G-protein-coupled receptor from Lymnaea stagnalis and identification of a leucokinin-like peptide, PSFHSWSamide, as its endogenous ligand.</a> Journal of Neuroscience. 17 (4), 1197-1205 (1997).</li><li>Dircksen, H., Kastin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+32+-+Crustacean+bioactive+peptides.">Chapter 32 - Crustacean bioactive peptides.</a> Handbook of Biologically Active Peptides (Second Edition). , 209-221 (2013).</li><li>Halberg, K. A., Terhzaz, S., Cabrero, P., Davies, S. A., Dow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+the+evolutionary+origins+of+insect+renal+function.">Tracing the evolutionary origins of insect renal function.</a> Nature Communications. 6, 6800 (2015).</li><li>Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+leucokinin+receptor+is+a+multiligand+receptor+for+the+three+Aedes+kinins.">The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins.</a> Insect Molecular Biology. 14 (1), 55-67 (2005).</li><li>Radford, J. C., Davies, S. A., Dow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+G-protein-coupled+receptor+analysis+in+Drosophila+melanogaster+identifies+a+leucokinin+receptor+with+novel+roles.">Systematic G-protein-coupled receptor analysis in Drosophila melanogaster identifies a leucokinin receptor with novel roles.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38810-38817 (2002).</li><li>Brock, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+leucokinin-like+peptide+receptor+from+the+cattle+fever+tick,+Rhipicephalus+microplus,+is+localized+in+the+midgut+periphery+and+receptor+silencing+with+validated+double-stranded+RNAs+causes+a+reproductive+fitness+cost.">The leucokinin-like peptide receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, is localized in the midgut periphery and receptor silencing with validated double-stranded RNAs causes a reproductive fitness cost.</a> International Journal for Parasitology. 49 (3-4), 287-299 (2019).</li><li>N&#228;ssel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucokinin+and+associated+neuropeptides+regulate+multiple+aspects+of+physiology+and+behavior+in+Drosophila.">Leucokinin and associated neuropeptides regulate multiple aspects of physiology and behavior in Drosophila.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1940 (2021).</li><li>Kim, Y. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+peptidergic+ensembles+associated+with+organization+of+an+innate+behavior.">Central peptidergic ensembles associated with organization of an innate behavior.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14211-14216 (2006).</li><li>Al-Anzi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+leucokinin+pathway+and+its+neurons+regulate+meal+size+in+Drosophila.">The leucokinin pathway and its neurons regulate meal size in Drosophila.</a> Current Biology. 20 (11), 969-978 (2010).</li><li>Yurgel, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+pair+of+leucokinin+neurons+are+modulated+by+feeding+state+and+regulate+sleep-metabolism+interactions.">A single pair of leucokinin neurons are modulated by feeding state and regulate sleep-metabolism interactions.</a> PLoS Biology. 17 (2), 2006409 (2019).</li><li>N&#228;ssel, D. R., Zandawala, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+neuropeptide+signaling+in+Drosophila,+from+genes+to+physiology+and+behavior.">Recent advances in neuropeptide signaling in Drosophila, from genes to physiology and behavior.</a> Progress in Neurobiology. 179, 101607 (2019).</li><li>Okusawa, S., Kohsaka, H., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+and+downstream+leucokinin+neurons+modulate+larval+turning+behavior+in+Drosophila.">Serotonin and downstream leucokinin neurons modulate larval turning behavior in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 34 (7), 2544-2558 (2014).</li><li>Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+leucokinin+receptor+is+critical+for+in+vivo+fluid+excretion+post+blood+feeding.">Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding.</a> FEBS letters. 585 (22), 3507-3512 (2011).</li><li>Kwon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucokinin+mimetic+elicits+aversive+behavior+in+mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+and+inhibits+the+sugar+taste+neuron.">Leucokinin mimetic elicits aversive behavior in mosquito Aedes aegypti (L.) and inhibits the sugar taste neuron.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 6880-6885 (2016).</li><li>Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+random+small+molecule+library+screen+identifies+novel+antagonists+of+the+kinin+receptor+from+the+cattle+fever+tick,+Rhipicephalus+microplus+(Acari:+Ixodidae).">A random small molecule library screen identifies novel antagonists of the kinin receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae).</a> Pest Management Science. 77 (5), 2238-2251 (2021).</li><li>Torfs, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinin+peptide+family+in+invertebrates.">The kinin peptide family in invertebrates.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 897 (1), 361-373 (1999).</li><li>Ma, Q., Ye, L., Liu, H., Shi, Y., Zhou, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+Ca2++mobilization+assays+in+GPCR+drug+discovery.">An overview of Ca2+ mobilization assays in GPCR drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (5), 511-523 (2017).</li><li>Zhang, J. -. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).</li><li>Offermanns, S., Simon, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&#945;15+and+G&#945;16+couple+a+wide+variety+of+receptors+to+phospholipase+C.">G&#945;15 and G&#945;16 couple a wide variety of receptors to phospholipase C.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (25), 15175-15180 (1995).</li><li>Murgia, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+phenotypic+screening+identifies+novel+chemistries+that+disrupt+mosquito+activity+and+development.">High-content phenotypic screening identifies novel chemistries that disrupt mosquito activity and development.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 182, 105037 (2022).</li><li>Lismont, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+BRET-based+biosensors+be+used+to+characterize+G-protein+mediated+signaling+pathways+of+an+insect+GPCR,+the+Schistocerca+gregaria+CRF-related+diuretic+hormone+receptor.">Can BRET-based biosensors be used to characterize G-protein mediated signaling pathways of an insect GPCR, the Schistocerca gregaria CRF-related diuretic hormone receptor.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 122, 103392 (2020).</li></ol>

Målet med HTS er å identifisere treffmolekyler gjennom screening av et stort antall små molekyler. Derfor representerer resultatene fra dette eksemplet bare en liten del av et konvensjonelt HTS-eksperiment. Videre må de identifiserte treffmolekylene valideres i nedstrømsanalyser, for eksempel en doseavhengig analyse på samme rekombinante cellelinje og på en CHO-K1-cellelinje som bare bærer den tomme vektoren, som kan utføres samtidig for å redde små molekyler. Cytotoksisitetsanalyser vil bidra til å demonstre...

G-proteinkoblede reseptorer (GPCR), som er tilstede fra gjær til mennesker, representerer den største superfamilien av reseptorer i mange organismer1. De spiller kritiske roller i å regulere nesten alle biologiske prosesser hos dyr. Det er 50-200 GPCR-er i genomet til leddyr, noe som betyr at de representerer den største membranreseptor-superfamilien2. De er klassifisert i seks hovedklasser, A-F, basert på deres sekvenslikhet og funksjoner3. GPCR transduserer forskjellige ekstracellulære signaler, for eksempel hormoner, neuropeptider, biogene aminer, glutamat, proton, lipoglykoproteiner og fotoner4. GPCRs kobles til heterotrimer G-proteiner (Gα, Gβ og Gγ) for å overføre nedstrøms signaler. GPCR koblet til Gαs- eller Gαi/o-proteiner øker eller reduserer henholdsvis de intracellulære 3', 5'-sykliske adenosinmonofosfatnivåene (cAMP) ved å aktivere eller hemme adenylylsyklase. GPCR koblet til Gαq / 11 induserer kalsiumfrigivelse fra endoplasmatiske retikulumkalsiumlagre ved å aktivere fosfolipase C (PLC) -inositol-1,4,5-trifosfat (IP3) -banen. GPCRs koblet til Gα12/13 aktiverer RhoGTPase nukleotidutvekslingsfaktorer 5,6. GPCR er målet for mer enn 50% av humane legemidler og et akaricid, amitraz4. Som GPCRs transduserer så forskjellige signaler, er de lovende mål for å utvikle nye plantevernmidler som forstyrrer hvirvelløse spesifikke fysiologiske funksjoner.
Målet med HTS er å identifisere treffmolekyler som kan modulere reseptorfunksjoner. HTS innebærer analyseutvikling, miniatyrisering og automatisering7. Leddyr neuropeptid GPCR er involvert i de fleste fysiologiske funksjoner, som utvikling, smelting og ecdysis, utskillelse, energimobilisering og reproduksjon4. De fleste neuropeptid GPCRs av leddyr og metazoer signaliserer gjennom kalsiumsignalkaskaden 2,6,8,9,10, slik som i myoinhibitorisk peptid og SIFamidreseptorer av blacklegged tick Ixodes scapularis; deres ligander er antagonistiske i hindgut motilitetsanalyser, med SIF som fremkaller sammentrekning og MIP hemmer det11,12. En NPY-lignende reseptor av gulfebermyggen, Aedes aegypti, regulerer kvinnelig vert som søker13. Sammenlignet med andre alternative kalsiummobiliseringsanalyser som aequorin kalsiumbioluminescensanalyse14, er kalsiumfluorescensanalysen enkel å utføre, krever ikke transfeksjon av andre rekombinante kalsiumdetekterende proteiner, og er kostnadseffektiv. Kalsiumfluorescensanalysen gir et langvarig signal sammenlignet med det raske kinetiske signalet oppnådd i aequorin kalsiumbioluminescensanalysen14,15.
I eksemplet her ble kininreseptoren fra storfefeberflåtten, Rhipicephalus microplus, rekombinant uttrykt i CHO-K1-cellelinjen og brukt til kalsiumfluorescensanalysen. Det er bare ett kininreseptorgen som finnes i R. microplus; reseptoren signaliserer gjennom en Gq-proteinavhengig signalvei og utløser utstrømningen av Ca2+ fra kalsiumlagre inn i det intracellulære rommet16. Denne prosessen kan detekteres og kvantifiseres av en fluorofor, som fremkaller et fluorescenssignal ved binding av kalsiumioner (figur 1).
Kininreseptoren er en virvelløse spesifikk GPCR, som tilhører klasse A Rhodopsin-lignende reseptorer. Kinin er et gammelt signalnevropeptid som er tilstede i Mollusca, Crustacea, Insecta og Acari 4,17,18. Coleopterans (biller) mangler kinin signalsystemet; i myggen Aedes aegypti er det bare en kininreseptor som binder tre aedeskininer, mens Drosophila melanogaster har en kininreseptor med drosokinin som en unik ligand 19,20,21. Det er ingen homologe kininer eller kininreseptorer hos vertebrater. Selv om den eksakte funksjonen til kinin er ukjent i flått, viser kininreseptoren RNAi-stille kvinner av R. microplus betydelig redusert reproduktiv kondisjon22. Kininer er pleotropiske peptider i insekter. I Drosophila melanogaster er de involvert i både sentrale og perifere nervereguleringssystemer23, pre-ecdysis24, fôring 25, metabolisme 26 og søvnaktivitetsmønstre26,27, samt larvebevegelse 28. Kinins regulerer hindgut sammentrekning, diurese og fôring i mygg A. aegypti 29,30,31. Kininpeptidene har et konservert C-terminalt pentapeptid Phe-X1-X2-Trp-Gly-NH2, som er den minste nødvendige sekvensen for biologisk aktivitet32. Leddyrspesifisiteten, den lille størrelsen på den endogene liganden, som gjør dem mottagelige for småmolekylær interferens, og de pleiotropiske funksjonene i insekter, gjør kininreseptoren til et lovende mål for skadedyrsbekjempelse4.
Analysen "dual-addition" (figur 2) gjør det mulig å identifisere agonister eller antagonister i samme HTS-analyse15. Den er tilpasset fra en "dual-addisjon" analyse som ofte brukes i farmasøytisk industri for narkotikaforskning33. Kort sagt, den første tilsetningen av legemidler i celleplaten tillater identifisering av potensielle agonister i det kjemiske biblioteket når et høyere fluorescenssignal oppdages sammenlignet med anvendelsen av løsningsmiddelkontrollen. Etter 5 minutters inkubasjon med disse små molekylene påføres en kjent agonist (kininpeptid) på alle brønnene. De brønnene som tilfeldig mottok en antagonist fra legemiddelplaten, viser et lavere fluorescenssignal ved agonisttilsetning sammenlignet med kontrollbrønnene som mottok løsningsmidlet i det første tillegget. Denne analysen tillater deretter identifisering av potensielle agonister og antagonister med de samme cellene. I et standard HTS-prosjekt vil disse treffmolekylene bli ytterligere validert gjennom dose-respons-analyser og ved ytterligere biologiske aktivitetsanalyser, som ikke er vist her.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64505/64505fig01.jpg"> Figur 1: Illustrasjon av kalsiumfluorescensanalysemekanismen. Gq-proteinet utløser den intracellulære kalsiumsignalveien. Kininreseptoren (G-proteinkoblet reseptor) ble rekombinant uttrykt i CHO-K1-celler. Når agonistliganden binder seg til reseptoren, aktiverer Gq-proteinet assosiert med kininreseptoren PLC, som katalyserer omdannelsen av et PIP2-molekyl til IP3 og DAG. IP 3 binder seg deretter til IP3R på overflaten av endoplasmatisk retikulum, noe som fører til frigjøring av Ca 2+ i cytoplasma, hvor Ca2+ ioner binder seg til fluoroforene og fremkaller et fluorescenssignal. Fluorescenssignalet kan oppnås ved eksitasjon ved 490 nm og detekteres ved 514 nm. Forkortelser: GPCR = G proteinkoblet reseptor; PLC = fosfolipase C; PIP2 = fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat; IP3 = inositoltrisfosfat; DAG = diacylglycerol; IP 3 R = IP3-reseptor. Laget med BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64505/64505fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64505/64505fig02.jpg"> Figur 2: Arbeidsflyten for høy gjennomstrømningsscreening av små molekyler på en G-proteinkoblet reseptor uttrykt i CHO-K1-celler. (A) Rekombinante CHO-K1-celler som stabilt uttrykker kininreseptoren ble tilsatt platen med 384 brønner (10 000 celler/brønn) ved hjelp av et væskehåndteringssystem (25 μL/brønn) og inkubert i en fuktet CO 2-inkubator i 12-16 timer. (B ) Analysebufferen som inneholder det fluorescerende fargestoffet (25 μL / brønn) ble tilsatt i celleplaten ved hjelp av et væskehåndteringssystem. Platen ble inkubert i 30 minutter ved 37 °C i 30 minutter og likevektet ved RT i ytterligere 30 minutter. (C) Bakgrunnsfluorescenssignalet til cellene i hver brønn ble målt med en plateleser. (D) Legemiddelløsninger fra en bibliotekplate med 384 brønner og blankt løsningsmiddel (alle ved 0,5 μL / brønn) ble tilsatt i den cellulære analyseplaten ved hjelp av et væskehåndteringssystem. (E) Cellulære kalsiumfluorescensresponser ble målt med plateleseren umiddelbart etter tilsetning av legemiddelløsningene; Forbindelse(r) som fremkalte høyere enn gjennomsnittlige fluorescenssignaler ble plukket ut som agonisttreff(er). Antagonisttreff som blokkerer GPCR (ikonet nedenfor) ble avslørt etter tilsetning av peptidagonisten under trinn G. (F) I samme analyseplate, etter 5 minutters inkubasjon av cellene med screeningforbindelser, ble et endogent agonistpeptid Rhimi-K-1 (QFSPWGamid) av flåttkininreseptoren tilsatt hver brønn (1 μM). (G) Cellulære fluorescensresponser etter agonistpeptidtilsetning ble målt av plateleseren umiddelbart. Forbindelse(r) som hemmer fluorescenssignalet ble valgt som antagonisttreff(er). Forkortelser: GPCR = G proteinkoblet reseptor; RT = romtemperatur; RFU = relative fluorescensenheter. Laget med BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64505/64505fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>15050-065</td>
			<td>with phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% trypan blue</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td>liquid, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM12400</td>
			<td>RNase-free Microfuge Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-045</td>
			<td>Corning Costar Stripette individually wrapped&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-047</td>
			<td>Corning Costar Stripette individually wrapped&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L filter tips</td>
			<td>USA Scientifc Inc.</td>
			<td>P1121</td>
			<td>sterile, barrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-049</td>
			<td>Corning Costar Stripette individually wrapped&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>graduated, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL auto-friendly reservior</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>6317</td>
			<td>sterile, individually wrapped for cell seeding in day 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL auto-friendly reservior</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>6318</td>
			<td>sterile, stacked, for loading dye in day 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384/ 12.5 &#181;L low retention tips</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>6405</td>
			<td>long, sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384/ 12.5 &#181;L tips</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>6404</td>
			<td>long, sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781091</td>
			<td>CELLSTAR, clear polystyrene, &#181;Clear, Black/Flat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum plate seals</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>PCR-AS-200</td>
			<td>polyester-based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil wrap</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafty cabinet II</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-540-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>AutoT4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell counting slides</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>SD-100</td>
			<td>20 &#181;L chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 humidified incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Forma Series II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desk Lamp</td>
			<td>SunvaleeyTEK</td>
			<td>RS1000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>276855</td>
			<td>anhydous, &#62;99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>DPBS, 1x without calcium amd magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12K Nutrient Mixture&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-354</td>
			<td>(Kaighn&#39;s Mod.) with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>SFBU30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent calcium assay kit</td>
			<td>ENZO Lifescience</td>
			<td>ENZ-51017</td>
			<td>10x96 tests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 sulfate</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>10131-027</td>
			<td>Geneticin selective antibiotic 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s buffer</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>55037C</td>
			<td>HBSS modified, with calcium, with magnesium, without phenol read</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>1 Molar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTS data storage plateform</td>
			<td>CDD vault&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://www.collaborativedrug.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid handling system</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>Viaflo</td>
			<td>384/12.5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Sorvall ST8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BMG technology</td>
			<td>Clariostar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhimi-K-1 agonist peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>custom order</td>
			<td>QFSPWGamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a "dual-addition" calcium fluorescence assay for the high-throughput screening of recombinant g protein-coupled receptors

G-proteinkoblede reseptorer (GPCR) representerer den største superfamilien av reseptorer og er målene for mange humane legemidler. High-throughput screening (HTS) av tilfeldige småmolekylbiblioteker mot GPCR brukes av farmasøytisk industri for målspesifikk legemiddeloppdagelse. I denne studien ble en HTS ansatt for å identifisere nye småmolekylære ligander av virvelløse spesifikke neuropeptid GPCRs som prober for fysiologiske studier av vektorer av dødelige humane og veterinære patogener.
Den virvelløse spesifikke kininreseptoren ble valgt som et mål fordi den regulerer mange viktige fysiologiske prosesser hos virvelløse dyr, inkludert diurese, fôring og fordøyelse. Videre er farmakologien til mange virvelløse GPCR-er dårlig karakterisert eller ikke karakterisert i det hele tatt; Derfor gir differensiell farmakologi av disse gruppene av reseptorer med hensyn til de relaterte GPCR-ene i andre metazoer, spesielt mennesker, kunnskap til struktur-aktivitetsforholdene til GPCR som en superfamilie. En HTS-analyse ble utviklet for celler i 384-brønnplater for påvisning av ligander av kininreseptoren fra storfefeberflåtten, eller sørlig storfeflått, Rhipicephalus microplus. Tick kinin-reseptoren ble stabilt uttrykt i CHO-K1-celler.
Kininreseptoren, når den aktiveres av endogene kininneuropeptider eller andre småmolekylære agonister, utløser Ca2+ frigjøring fra kalsiumlagre i cytoplasma. Denne kalsiumfluorescensanalysen kombinert med en "dual-addisjon" -tilnærming kan oppdage funksjonelle agonist- og antagonist "hit" -molekyler i samme analyseplate. Hver analyse ble utført ved hjelp av stoffplater som bærer en rekke 320 tilfeldige små molekyler. En pålitelig Z-faktor på 0,7 ble oppnådd, og tre agonist- og to antagonisttreffmolekyler ble identifisert når HTS var ved en 2 μM endelig konsentrasjon. Kalsiumfluorescensanalysen som er rapportert her, kan tilpasses for å skjerme andre GPCR-er som aktiverer Ca2+ -signalkaskaden.

En intern stoffplate (SAC2-34-6170) sammensatt av 320 tilfeldige små molekyler ble brukt til å demonstrere denne HTS-analysen som et eksempel. HTS hadde utmerket analysekvalitet med en Z-faktor på 0,7 (tabell 1). Denne Z-faktoren gjenspeiler analysekvaliteten uavhengig av de testede forbindelsene34. En Z′-faktor på 0,5 eller høyere indikerer et godt dynamisk område for analysesignal mellom RFU-ene til de positive kontrollene og de negative kontrollene...

Watch this Scientific Journal Video about A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors at JoVE.com

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

I dette arbeidet beskrives en intracellulær kalsiumfluorescensanalyse med høy gjennomstrømning for 384-brønnplater for å skjerme små molekylbiblioteker på rekombinante G-proteinkoblede reseptorer (GPCR). Målet, kininreseptoren fra storfefeberflåtten, Rhipicephalus microplus, uttrykkes i CHO-K1-celler. Denne analysen identifiserer agonister og antagonister som bruker de samme cellene i en "dual-addisjon" -analyse.

En "dual-addisjon" kalsiumfluorescensanalyse for høy gjennomstrømningsscreening av rekombinante G-proteinkoblede reseptorer

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

High-Throughput screening kalsiumfluorescens dual addisjonsanalyse tillater identifisering av nye små molekylligander av en G-proteinkoblet reseptor som signalerer gjennom den intracellulære kalsiumkaskaden. Den største fordelen med den doble addisjonsanalysen er påvisning av agonist og antagonist HTS i en enkelt analyse med de samme cellene, forutsatt at fluorescenssignalet varer to minutter. Denne metoden kan brukes på hvilken som helst GPCR som signaliserer gjennom kalsiumkaskaden, som inkluderer det meste av leddyrneuronpeptidfamilien, en GPCR.For reproduserbarhet av analyser er det viktig å optimalisere celletettheten, injeksjonshastigheten og konsentrasjonen av den kjente agonisten for den andre utgaven. Demonstrere prosedyren vil være Bianca Henriques-Santos, Post-doktorgradsstipendiat i laboratoriet mitt. Begynn kalsiumfluorescensanalysen ved å fjerne det brukte mediet fra T-75-kolben som inneholder 70 til 90% sammenflytende BMLK tre celler.Vask cellene med 10 milliliter Dulbeccos fosfatbufrede saltvann eller DPBS. Etter å ha fjernet DPBS, løsne cellene ved hjelp av to milliliter 0,25% trypsin etylendiamintetraeddiksyre eller EDTA og inkuber i tre til fem minutter ved 37 grader Celsius. Tilsett åtte milliliter selektivt medium og overfør cellesuspensjonen til et 15 milliliter konisk rør.Før sentrifugering av cellesuspensjonen ved 1000 x g i tre minutter. Kast supernatanten og resuspendere cellepelleten i 10 milliliter F-12K-medium som inneholder 1% føtalt bovint serum eller FBS og 400 mikrogram per milliliter G418-sulfat. For å bestemme celletettheten til suspensjonen for ytterligere fortynning, bland 20 mikroliter cellesuspensjon i 20 mikroliter 0,4% trypanblå, og last deretter 20 mikroliterblanding inn i et celletellingskammer som skal leses av en celleteller for celletetthet.Fortynn cellesuspensjonen ved bruk av samme F-12K-medium og utgjør det endelige volumet til 15 milliliter ved en tetthet på fire ganger 10 til de femte cellene per milliliter. For å så cellene i Poly-D lysin eller PDL kodet 384 brønnplate. Tilsett 25 mikroliter av den fortynnede cellesuspensjonen i 384 brønner på platen ved hjelp av et væskehåndteringssystem.Inkuber platen over natten ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i den fuktede inkubatoren. Neste dag inverterer du raskt den 90% konfluente 384-brønnplaten. For å fjerne det brukte mediet og forsiktig blottet på sterile papirhåndklær to til tre ganger for å fjerne all væske fra platen.Utfør de neste trinnene i det myke, svake lyset inne i biosikkerhetsskapet. Deretter tilsettes 25 mikroliter av lastefargestoffet i hver brønn ved hjelp av et væskehåndteringssystem ved å dispensere 12,5 mikroliter i hver brønn med en aspirasjons- og dispenseringshastighet på 3,8 mikroliter per sekund. Gjenta dette pipetteringstrinnet for å nå et endelig volum på 25 mikroliter i hver brønn.Når du er ferdig, dekk platen med aluminiumsfolie for å beskytte den mot omgivelseslys og inkuber ved 37 grader Celsius i den karbondioksidfuktede inkubatoren i 30 minutter. Etter å ha likestilt den dekkede platen i ytterligere 30 minutter, er cellene klare for høy gjennomstrømningsscreening eller HTS. Sentrifuger deretter stoffplaten ved 1200 x g i en platesentrifuge i ett minutt.Overfør 10x agonistpeptidløsningen av Rhimi-K-1 til et 150 milliliter automatisk vennlig reservoar. I plateleseren klikker du på administrer protokoller. I endepunktprotokollen for fluorescerende intensitet velger du Flow Forte forhåndsavlesning, klikker på startmåling for å måle bakgrunnssignalet for hele HTS-analysen.Sett celleplaten inn i plateleseren. I instrumentpanelet klikker du på en tilfeldig brønn på platen og klikker deretter på ny fokushøyde. Klikk på fokusjustering.Klikk på gevinstjustering. Tilordne den som 5% til 10% av den maksimale målbare fluorescensverdien. Klikk startjustering.Klikk startmåling for å lese hele platen for bakgrunnsfluorescenssignalet i relative fluorescensenheter eller RFU. Mens platen leser, klikker du på gjeldende tilstand for å se leseverdien i sanntid. For dual-addisjonsanalysen, pipette 10 mikroliter av legemiddeloppløsningen opp og ned tre ganger ved bruk av væskehåndteringssystemet og aspirere 1,5 mikroliter fra hver brønn på legemiddelplaten med en aspirasjonshastighet på 1,0 mikroliter per sekund.Dispenser 0,5 mikroliter av forbindelsene i celleanalysen for å nå en endelig konsentrasjon av to mikromolar i 0,2% dimetylsulfoksid eller DMSO. Etter å ha tilsatt screeningforbindelsene, plasser analyseplaten umiddelbart i plateleseren. Klikk det forhåndsinnstilte leseprogrammet, og les platen i leseretningen forover og bakover.Kast en mikroliter medikamentoppløsning som er igjen i spissene ved å nedsenke spissene i et 150 milliliter avfallsreservoar som inneholder ca. 50 ml DPBS. Inkuber screeningforbindelsene med cellene i totalt fem minutter, inkludert tiden inne i plateleseren i biosikkerhetsskapet med lysene av. Deretter legger du tre mikroliter av agonistpeptidet Rhimi-K-1 fra reservoaret inn i analyseplaten ved hjelp av væskehåndteringssystemet ved hjelp av 384 12,5 mikroliter spisser.Plasser platen i plateleseren umiddelbart. Klikk det forhåndsinnstilte leseprogrammet, og les platen i leseretningen forover og bakover. Når det er gjort manuelt, beregner du Z'faktoren for kvalitetskontroll av hver plateanalyse.Velg treffmolekylene manuelt fra varmekartene på den elektroniske HTS-dataplattformen og beregn normalisert prosentaktivering eller NPA og hemmende aktivitet, eller I0 for agonisttreff og antagonisttreff. En intern stoffplate SAC2-34-6170 sammensatt av 320 tilfeldige små molekyler ble brukt til å demonstrere denne HTS-analysen. HTS hadde utmerket analysekvalitet med en Z'faktor på 0,7, noe som gjenspeiler analysekvaliteten uavhengig av de testede forbindelsene.Det er viktig å lese platen umiddelbart etter tilsetning av agonisten fordi fluorescenssignalet er kortvarig. Etter denne prosedyren bør det identifiserte treffmolekylet valideres gjennom doseresponsanalyser og testes i celler som ikke uttrykker mål-GPCR for å utelukke treff utenfor målet.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Høy throughput screening av karbohydrat-nedbrytende enzymer Bruke Novel Uløselig kromogen substratmetode Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metode for å identifisere lavmolekylære inhibitorer av protein-protein samhandling mellom HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Måling av G-proteinkoblet reseptor-signalering via radiomerket GTP-binding

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metode for høy gjennomstrømning kjemiske Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

En høy gjennomstrømming Luciferase analysen vurdere proteolyse av Single-omsetning Protease-PCSK9

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

A semi-High-gjennomstrømning tilpasning av NADH-koblet ATPase analysen for screening små molekyl hemmere

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Høy-gjennomstrømning total intern refleksjon fluorescens og direkte Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi bruke en fotoniske chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Fullt behandlet rekombinant KRAS4b: isolere og karakteriserer Farnesylated og denaturert protein

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Strategisk screening og karakterisering av Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for vellykket krystallisering

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Klikkkjemibasert fluorometrisk analyse for apolipoprotein N-acyltransferase fra enzymkarakterisering til høy gjennomstrømningsscreening

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...