Name: a "dual-addition" calcium fluorescence assay for the high-throughput screening of recombinant g protein-coupled receptors
Uploaded: 2022-12-02T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por el Premio de Salud y Bienestar Animal USDA-NIFA-AFRI (número de premio 2022-67015-36336, PVP [Director del proyecto]) y de fondos competitivos del Programa de Subvenciones para Enfermedades de Vectores de Insectos de Investigación de Texas A&M AgriLife (FY'22-23) a P.V.P. El grupo de profesores A.W.E.S.O.M.E. de la Facultad de Agricultura y Ciencias de la Vida, TAMU, es reconocido por su ayuda en la edición del manuscrito. La Tabla Suplementaria S2 contiene datos de una biblioteca interna, aleatoria y de moléculas pequeñas obtenida del laboratorio del Dr. James Sacchettini en la Universidad de Texas A&M y Texas A&M AgriLife Research.

1. Mantenimiento celular
NOTA: UNA LÍNEA CELULAR CHO-K1 que expresa de manera estable el receptor de cinina de R. microplus, llamada BMLK3, fue desarrollada por Holmes et al.16. Los detalles del desarrollo de la línea celular se presentan en otra parte14. Todos los pasos siguientes se realizan en condiciones estériles en un gabinete de bioseguridad de clase II.
<ol><li>Cultivar la línea celular recombina...

<ol>
	<li>Hanlon, C. D., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outside-in+signaling+-+A+brief+review+of+GPCR+signaling+with+a+focus+on+the+Drosophila+GPCR+family.">Outside-in signaling - A brief review of GPCR signaling with a focus on the Drosophila GPCR family.</a> Journal of Cell Science. 128 (19), 3533-3542 (2015).</li><li>Liu, N., Li, T., Wang, Y., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein+coupled+receptors+(GPCRs)+in+insects-A+potential+target+for+new+insecticide+development.">G-protein coupled receptors (GPCRs) in insects-A potential target for new insecticide development.</a> Molecules. 26 (10), 2993 (2021).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 639-650 (2002).</li><li>Pietrantonio, P. V., Xiong, C., Nachman, R. J., Shen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptors+in+arthropod+vectors:+Omics+and+pharmacological+approaches+to+elucidate+ligand-receptor+interactions+and+novel+organismal+functions.">G protein-coupled receptors in arthropod vectors: Omics and pharmacological approaches to elucidate ligand-receptor interactions and novel organismal functions.</a> Current Opinion in Insect Science. 29, 12-20 (2018).</li><li>Hilger, D., Masureel, M., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+GPCR+signaling+complexes.">Structure and dynamics of GPCR signaling complexes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (1), 4-12 (2018).</li><li>Liu, N., Wang, Y., Li, T., Feng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein+coupled+receptors+(GPCRs):+Signaling+pathways,+characterization,+and+functions+in+insect+physiology+and+toxicology.">G-protein coupled receptors (GPCRs): Signaling pathways, characterization, and functions in insect physiology and toxicology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (10), 5260 (2021).</li><li>Hansen, K. B., Br&#228;uner-Osborne, H., Leifert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIPR&#174;+assays+of+intracellular+calcium+in+GPCR+drug+discovery.">FLIPR&#174; assays of intracellular calcium in GPCR drug discovery.</a> G Protein-Coupled Receptors in Drug Discovery. , (2009).</li><li>Bauknecht, P., Jekely, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+combinatorial+deorphanization+of+Platynereis+neuropeptide+GPCRs.">Large-scale combinatorial deorphanization of Platynereis neuropeptide GPCRs.</a> Cell Reports. 12 (4), 684-693 (2015).</li><li>Frooninckx, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+GPCRs+in+C.+elegans.">Neuropeptide GPCRs in C. elegans.</a> Frontiers in Endocrinology. 3, 167 (2012).</li><li>Caers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+two+decades+of+research+on+insect+neuropeptide+GPCRs:+An+overview.">More than two decades of research on insect neuropeptide GPCRs: An overview.</a> Frontiers in Endocrinology. 3, 151 (2012).</li><li>&#352;imo, L., Ko&#269;i, J., Park, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptors+for+the+neuropeptides,+myoinhibitory+peptide+and+SIFamide,+in+control+of+the+salivary+glands+of+the+blacklegged+tick+Ixodes+scapularis.">Receptors for the neuropeptides, myoinhibitory peptide and SIFamide, in control of the salivary glands of the blacklegged tick Ixodes scapularis.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (4), 376-387 (2013).</li><li>&#352;imo, L., Park, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptidergic+control+of+the+hindgut+in+the+black-legged+tick+Ixodes+scapularis.">Neuropeptidergic control of the hindgut in the black-legged tick Ixodes scapularis.</a> International Journal for Parasitology. 44 (11), 819-826 (2014).</li><li>Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+genetic+characterization+of+neuropeptide+Y-like+receptors+in+Aedes+aegypti.">Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 2486 (2013).</li><li>Lu, H. L., Kersch, C. N., Taneja-Bageshwar, S., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+calcium+bioluminescence+assay+for+functional+analysis+of+mosquito+(Aedes+aegypti)+and+tick+(Rhipicephalus+microplus)+G+protein-coupled+receptors.">A calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (Aedes aegypti) and tick (Rhipicephalus microplus) G protein-coupled receptors.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2732 (2011).</li><li>Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cattle+fever+tick,+Rhipicephalus+microplus,+as+a+model+for+forward+pharmacology+to+elucidate+kinin+GPCR+function+in+the+Acari.">The cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, as a model for forward pharmacology to elucidate kinin GPCR function in the Acari.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1008 (2019).</li><li>Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+a+G+protein-coupled+receptor+from+the+Southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+(Acari:+Ixodidae)+identifies+it+as+the+first+arthropod+myokinin+receptor.">Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor.</a> Insect Molecular Biology. 12 (1), 27-38 (2003).</li><li>Cox, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning,+characterization,+and+expression+of+a+G-protein-coupled+receptor+from+Lymnaea+stagnalis+and+identification+of+a+leucokinin-like+peptide,+PSFHSWSamide,+as+its+endogenous+ligand.">Cloning, characterization, and expression of a G-protein-coupled receptor from Lymnaea stagnalis and identification of a leucokinin-like peptide, PSFHSWSamide, as its endogenous ligand.</a> Journal of Neuroscience. 17 (4), 1197-1205 (1997).</li><li>Dircksen, H., Kastin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+32+-+Crustacean+bioactive+peptides.">Chapter 32 - Crustacean bioactive peptides.</a> Handbook of Biologically Active Peptides (Second Edition). , 209-221 (2013).</li><li>Halberg, K. A., Terhzaz, S., Cabrero, P., Davies, S. A., Dow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+the+evolutionary+origins+of+insect+renal+function.">Tracing the evolutionary origins of insect renal function.</a> Nature Communications. 6, 6800 (2015).</li><li>Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+leucokinin+receptor+is+a+multiligand+receptor+for+the+three+Aedes+kinins.">The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins.</a> Insect Molecular Biology. 14 (1), 55-67 (2005).</li><li>Radford, J. C., Davies, S. A., Dow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+G-protein-coupled+receptor+analysis+in+Drosophila+melanogaster+identifies+a+leucokinin+receptor+with+novel+roles.">Systematic G-protein-coupled receptor analysis in Drosophila melanogaster identifies a leucokinin receptor with novel roles.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38810-38817 (2002).</li><li>Brock, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+leucokinin-like+peptide+receptor+from+the+cattle+fever+tick,+Rhipicephalus+microplus,+is+localized+in+the+midgut+periphery+and+receptor+silencing+with+validated+double-stranded+RNAs+causes+a+reproductive+fitness+cost.">The leucokinin-like peptide receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, is localized in the midgut periphery and receptor silencing with validated double-stranded RNAs causes a reproductive fitness cost.</a> International Journal for Parasitology. 49 (3-4), 287-299 (2019).</li><li>N&#228;ssel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucokinin+and+associated+neuropeptides+regulate+multiple+aspects+of+physiology+and+behavior+in+Drosophila.">Leucokinin and associated neuropeptides regulate multiple aspects of physiology and behavior in Drosophila.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1940 (2021).</li><li>Kim, Y. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+peptidergic+ensembles+associated+with+organization+of+an+innate+behavior.">Central peptidergic ensembles associated with organization of an innate behavior.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14211-14216 (2006).</li><li>Al-Anzi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+leucokinin+pathway+and+its+neurons+regulate+meal+size+in+Drosophila.">The leucokinin pathway and its neurons regulate meal size in Drosophila.</a> Current Biology. 20 (11), 969-978 (2010).</li><li>Yurgel, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+pair+of+leucokinin+neurons+are+modulated+by+feeding+state+and+regulate+sleep-metabolism+interactions.">A single pair of leucokinin neurons are modulated by feeding state and regulate sleep-metabolism interactions.</a> PLoS Biology. 17 (2), 2006409 (2019).</li><li>N&#228;ssel, D. R., Zandawala, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+neuropeptide+signaling+in+Drosophila,+from+genes+to+physiology+and+behavior.">Recent advances in neuropeptide signaling in Drosophila, from genes to physiology and behavior.</a> Progress in Neurobiology. 179, 101607 (2019).</li><li>Okusawa, S., Kohsaka, H., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+and+downstream+leucokinin+neurons+modulate+larval+turning+behavior+in+Drosophila.">Serotonin and downstream leucokinin neurons modulate larval turning behavior in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 34 (7), 2544-2558 (2014).</li><li>Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+leucokinin+receptor+is+critical+for+in+vivo+fluid+excretion+post+blood+feeding.">Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding.</a> FEBS letters. 585 (22), 3507-3512 (2011).</li><li>Kwon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucokinin+mimetic+elicits+aversive+behavior+in+mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+and+inhibits+the+sugar+taste+neuron.">Leucokinin mimetic elicits aversive behavior in mosquito Aedes aegypti (L.) and inhibits the sugar taste neuron.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 6880-6885 (2016).</li><li>Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+random+small+molecule+library+screen+identifies+novel+antagonists+of+the+kinin+receptor+from+the+cattle+fever+tick,+Rhipicephalus+microplus+(Acari:+Ixodidae).">A random small molecule library screen identifies novel antagonists of the kinin receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae).</a> Pest Management Science. 77 (5), 2238-2251 (2021).</li><li>Torfs, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinin+peptide+family+in+invertebrates.">The kinin peptide family in invertebrates.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 897 (1), 361-373 (1999).</li><li>Ma, Q., Ye, L., Liu, H., Shi, Y., Zhou, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+Ca2++mobilization+assays+in+GPCR+drug+discovery.">An overview of Ca2+ mobilization assays in GPCR drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (5), 511-523 (2017).</li><li>Zhang, J. -. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).</li><li>Offermanns, S., Simon, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&#945;15+and+G&#945;16+couple+a+wide+variety+of+receptors+to+phospholipase+C.">G&#945;15 and G&#945;16 couple a wide variety of receptors to phospholipase C.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (25), 15175-15180 (1995).</li><li>Murgia, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+phenotypic+screening+identifies+novel+chemistries+that+disrupt+mosquito+activity+and+development.">High-content phenotypic screening identifies novel chemistries that disrupt mosquito activity and development.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 182, 105037 (2022).</li><li>Lismont, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+BRET-based+biosensors+be+used+to+characterize+G-protein+mediated+signaling+pathways+of+an+insect+GPCR,+the+Schistocerca+gregaria+CRF-related+diuretic+hormone+receptor.">Can BRET-based biosensors be used to characterize G-protein mediated signaling pathways of an insect GPCR, the Schistocerca gregaria CRF-related diuretic hormone receptor.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 122, 103392 (2020).</li></ol>

El objetivo de HTS es identificar moléculas de impacto a través de la detección de un número masivo de moléculas pequeñas. Por lo tanto, los resultados de este ejemplo solo representan una pequeña parte de un experimento HTS convencional. Además, las moléculas de éxito identificadas deben validarse en ensayos posteriores, como un ensayo dependiente de la dosis en la misma línea celular recombinante y en una línea celular CHO-K1 que lleve solo el vector vacío, que se puede realizar simultáneamente para salva...

Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR), que están presentes desde la levadura hasta los humanos, representan la mayor superfamilia de receptores en muchos organismos1. Desempeñan un papel crítico en la regulación de casi todos los procesos biológicos en los animales. Hay 50-200 GPCR en el genoma de los artrópodos, lo que significa que representan la superfamilia de receptores de membrana más grande2. Se clasifican en seis clases principales, A-F, en función de su similitud de secuencia y funciones3. Los GPCR transducen diversas señales extracelulares, como las de hormonas, neuropéptidos, aminas biogénicas, glutamato, protones, lipoglicoproteínas y fotones4. Los GPCR se acoplan a las proteínas G heterotrímero (Gα, Gβ y Gγ) para transmitir señales aguas abajo. Los GPCR acoplados a las proteínas Gαs o Gαi/o aumentan o disminuyen, respectivamente, los niveles intracelulares de 3', 5' -monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) mediante la activación o inhibición de la adenilil ciclasa. Los GPCR acoplados a Gαq/11 inducen la liberación de calcio de las reservas de calcio del retículo endoplásmico mediante la activación de la vía de la fosfolipasa C (PLC)-inositol-1,4,5-trifosfato (IP3). Los GPCR acoplados a Gα12/13 activan los factores de intercambio de nucleótidos RhoGTPasa 5,6. Los GPCR son el objetivo de más del 50% de los medicamentos humanos y un acaricida, amitraz4. A medida que los GPCR transducen señales tan diversas, son objetivos prometedores para desarrollar nuevos pesticidas que interrumpen las funciones fisiológicas específicas de los invertebrados.
El objetivo de HTS es identificar moléculas de impacto que puedan modular las funciones del receptor. HTS implica el desarrollo de ensayos, miniaturización y automatización7. Los GPCR del neuropéptido artrópodo están involucrados en la mayoría de las funciones fisiológicas, como el desarrollo, la muda y la ecdisis, la excreción, la movilización de energía y la reproducción4. La mayoría de los GPCR neuropeptídicos de artrópodos y metazoos señalan a través de la cascada de señalización de calcio 2,6,8,9,10, como en el péptido mioinhibitorio y los receptores SIFamida de la garrapata de patas negras Ixodes scapularis; sus ligandos son antagónicos en los ensayos de motilidad del intestino posterior, con SIF provocando contracción y MIP inhibiéndola11,12. Un receptor similar al NPY del mosquito de la fiebre amarilla, Aedes aegypti, regula la búsqueda de huéspedes femeninos13. En comparación con otros ensayos alternativos de movilización de calcio, como el ensayo de bioluminiscencia cálcica aequorina14, el ensayo de fluorescencia de calcio es fácil de realizar, no requiere la transfección de otras proteínas detectoras de calcio recombinantes y es rentable. El ensayo de fluorescencia de calcio produce una señal prolongada en comparación con la señal cinética rápida obtenida en el ensayo de bioluminiscencia cálcica aequorina14,15.
En el ejemplo aquí, el receptor de cinina de la garrapata de la fiebre del ganado, Rhipicephalus microplus, se expresó recombinantemente en la línea celular CHO-K1 y se utilizó para el ensayo de fluorescencia de calcio. Solo hay un gen receptor de cinina que se encuentra en R. microplus; el receptor señala a través de una vía de señalización dependiente de la proteína Gq y desencadena el flujo de Ca2+ de las reservas de calcio al espacio intracelular16. Este proceso puede ser detectado y cuantificado por un fluoróforo, que provoca una señal de fluorescencia al unir iones de calcio (Figura 1).
El receptor de quinina es un GPCR específico de invertebrados, que pertenece a los receptores similares a la rodopsina de clase A. La quinina es un antiguo neuropéptido de señalización que está presente en moluscos, crustáceos, insectas y acari 4,17,18. Los coleópteros (escarabajos) carecen del sistema de señalización de cininas; en el mosquito Aedes aegypti, solo hay un receptor de quinina que se une a tres aedeskininas, mientras que Drosophila melanogaster tiene un receptor de cinina con drosokinina como ligando único 19,20,21. No hay cininas homólogas o receptores de cinina en vertebrados. Aunque la función exacta de la cinina es desconocida en las garrapatas, las hembras silenciadas por ARNi del receptor de cinina de R. microplus muestran una aptitud reproductiva significativamente reducida22. Las cininas son péptidos pleotrópicos en insectos. En Drosophila melanogaster, están involucrados en los sistemas reguladores nerviosos central y periférico 23, pre-ecdisis24, alimentación 25, metabolismo 26 y patrones de actividad del sueño26,27, así como locomoción larvaria 28. Las cininas regulan la contracción del intestino posterior, la diuresis y la alimentación en el mosquito A. aegypti 29,30,31. Los péptidos de cinina tienen un pentapéptido C-terminal conservado Phe-X1-X2-Trp-Gly-NH2, que es la secuencia mínima requerida para la actividad biológica32. La especificidad de los artrópodos, el pequeño tamaño del ligando endógeno, que los hace susceptibles a la interferencia de moléculas pequeñas, y las funciones pleiotrópicas en los insectos hacen del receptor de cinina un objetivo prometedor para el control de plagas4.
El ensayo de "doble adición" (Figura 2) permite la identificación de agonistas o antagonistas en el mismo ensayo HTS15. Está adaptado de un ensayo de "doble adición" que se utiliza comúnmente en la industria farmacéutica para el descubrimiento de fármacos33. En resumen, la primera adición de fármacos en la placa celular permite la identificación de posibles agonistas en la biblioteca química cuando se detecta una señal de fluorescencia más alta en comparación con la aplicación del control de disolvente. Después de 5 minutos de incubación con estas moléculas pequeñas, se aplica un agonista conocido (péptido de cinina) a todos los pocillos. Aquellos pocillos que recibieron al azar un antagonista de la placa de fármaco muestran una señal de fluorescencia más baja tras la adición de agonistas en comparación con los pocillos de control que recibieron el solvente en la primera adición. Este ensayo permite la identificación de posibles agonistas y antagonistas con las mismas células. En un proyecto estándar de HTS, estas moléculas de éxito se validarían aún más a través de ensayos de dosis-respuesta y mediante ensayos de actividad biológica adicionales, que no se muestran aquí.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64505/64505fig01.jpg"> Figura 1: Ilustración del mecanismo de ensayo de fluorescencia de calcio. La proteína Gq desencadena la vía de señalización de calcio intracelular. El receptor de cinina (receptor acoplado a proteína G) se expresó recombinantemente en células CHO-K1. Cuando el ligando agonista se une al receptor, la proteína Gq asociada con el receptor de quinina activa PLC, que cataliza la conversión de una molécula PIP2 en IP3 y DAG. IP 3 luego se une al IP3R en la superficie del retículo endoplásmico, lo que lleva a la liberación de Ca 2+ en el citoplasma, donde los iones de Ca2+ se unen a los fluoróforos y provocan una señal de fluorescencia. La señal de fluorescencia puede obtenerse por excitación a 490 nm y detectarse a 514 nm. Abreviaturas: GPCR = receptor acoplado a proteína G; PLC = fosfolipasa C; PIP2 = fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato; IP3 = trifosfato de inositol; DAG = diacilglicerol; IP3 R = receptor IP3. Creado con BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64505/64505fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64505/64505fig02.jpg"> Figura 2: El flujo de trabajo para el cribado de alto rendimiento de moléculas pequeñas en un receptor acoplado a proteína G expresado en células CHO-K1. (A) Las células CHO-K1 recombinantes que expresan de manera estable el receptor de cinina se agregaron a la placa de 384 pocillos (10,000 células / pocillo) utilizando un sistema de manejo de líquidos (25 μL / pocillo) y se incubaron en una incubadora humidificada de CO2 durante12-16 h. (B ) El tampón de ensayo que contenía el colorante fluorescente (25 μL/pocillo) se añadió a la placa celular utilizando un sistema de manipulación de líquidos. La placa se incubó durante 30 min a 37 °C durante 30 min y se equilibró a RT durante otros 30 min. (C) La señal de fluorescencia de fondo de las células en cada pocillo se midió con un lector de placas. (D) Se agregaron soluciones farmacológicas de una placa de biblioteca de 384 pocillos y disolvente en blanco (todo a 0,5 μL/pocillo) a la placa de ensayo celular utilizando un sistema de manejo de líquidos. (E) Las respuestas de fluorescencia de calcio celular se midieron con el lector de placas inmediatamente después de la adición de las soluciones farmacológicas; Los compuestos que provocan señales de fluorescencia superiores a la media se seleccionaron como agonistas acertados. Los golpes antagonistas que bloquean el GPCR (icono a continuación) se revelaron después de la adición del agonista peptídico durante el paso G. (F) En la misma placa de ensayo, después de 5 minutos de incubación de las células con compuestos de cribado, se añadió un péptido agonista endógeno Rhimi-K-1 (QFSPWGamida) del receptor de quinina de garrapata a cada pocillo (1 μM). (G) Las respuestas de fluorescencia celular después de la adición del péptido agonista fueron medidas por el lector de placas inmediatamente. Los compuestos que inhiben la señal de fluorescencia se seleccionaron como antagonistas de los hits. Abreviaturas: GPCR = receptor acoplado a proteína G; RT = temperatura ambiente; RFU = unidades de fluorescencia relativa. Creado con BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64505/64505fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>15050-065</td>
			<td>with phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% trypan blue</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td>liquid, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM12400</td>
			<td>RNase-free Microfuge Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-045</td>
			<td>Corning Costar Stripette individually wrapped&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-047</td>
			<td>Corning Costar Stripette individually wrapped&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L filter tips</td>
			<td>USA Scientifc Inc.</td>
			<td>P1121</td>
			<td>sterile, barrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-049</td>
			<td>Corning Costar Stripette individually wrapped&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>graduated, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL auto-friendly reservior</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>6317</td>
			<td>sterile, individually wrapped for cell seeding in day 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL auto-friendly reservior</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>6318</td>
			<td>sterile, stacked, for loading dye in day 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384/ 12.5 &#181;L low retention tips</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>6405</td>
			<td>long, sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384/ 12.5 &#181;L tips</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>6404</td>
			<td>long, sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781091</td>
			<td>CELLSTAR, clear polystyrene, &#181;Clear, Black/Flat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum plate seals</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>PCR-AS-200</td>
			<td>polyester-based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil wrap</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafty cabinet II</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-540-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>AutoT4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell counting slides</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>SD-100</td>
			<td>20 &#181;L chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 humidified incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Forma Series II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desk Lamp</td>
			<td>SunvaleeyTEK</td>
			<td>RS1000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>276855</td>
			<td>anhydous, &#62;99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>DPBS, 1x without calcium amd magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12K Nutrient Mixture&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-354</td>
			<td>(Kaighn&#39;s Mod.) with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>SFBU30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent calcium assay kit</td>
			<td>ENZO Lifescience</td>
			<td>ENZ-51017</td>
			<td>10x96 tests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 sulfate</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>10131-027</td>
			<td>Geneticin selective antibiotic 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s buffer</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>55037C</td>
			<td>HBSS modified, with calcium, with magnesium, without phenol read</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>1 Molar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTS data storage plateform</td>
			<td>CDD vault&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://www.collaborativedrug.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid handling system</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>Viaflo</td>
			<td>384/12.5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Sorvall ST8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BMG technology</td>
			<td>Clariostar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhimi-K-1 agonist peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>custom order</td>
			<td>QFSPWGamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a "dual-addition" calcium fluorescence assay for the high-throughput screening of recombinant g protein-coupled receptors

Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) representan la superfamilia más grande de receptores y son el objetivo de numerosos medicamentos humanos. La industria farmacéutica utiliza el cribado de alto rendimiento (HTS) de bibliotecas aleatorias de moléculas pequeñas contra GPCR para el descubrimiento de fármacos específicos del objetivo. En este estudio, se empleó un HTS para identificar nuevos ligandos de moléculas pequeñas de GPCR de neuropéptidos específicos de invertebrados como sondas para estudios fisiológicos de vectores de patógenos humanos y veterinarios mortales.
El receptor de quinina específico de invertebrados se eligió como objetivo porque regula muchos procesos fisiológicos importantes en los invertebrados, incluida la diuresis, la alimentación y la digestión. Además, la farmacología de muchos GPCR de invertebrados está mal caracterizada o no está caracterizada en absoluto; por lo tanto, la farmacología diferencial de estos grupos de receptores con respecto a los GPCR relacionados en otros metazoos, especialmente humanos, agrega conocimiento a las relaciones estructura-actividad de GPCR como una superfamilia. Se desarrolló un ensayo HTS para células en placas de 384 pocillos para el descubrimiento de ligandos del receptor de cinina de la garrapata de la fiebre del ganado, o garrapata del ganado del sur, Rhipicephalus microplus. El receptor de quinina de garrapata se expresó de manera estable en las células CHO-K1.
El receptor de quinina, cuando es activado por neuropéptidos de quinina endógenos u otros agonistas de moléculas pequeñas, desencadena la liberación de Ca2+ de las reservas de calcio en el citoplasma. Este ensayo de fluorescencia de calcio combinado con un enfoque de "doble adición" puede detectar moléculas "golpeadas" agonistas funcionales y antagonistas en la misma placa de ensayo. Cada ensayo se realizó utilizando placas de fármacos que transportaban una matriz de 320 moléculas pequeñas aleatorias. Se obtuvo un factor Z' fiable de 0,7, y se identificaron tres moléculas agonistas y dos antagonistas cuando el HTS estaba en una concentración final de 2 μM. El ensayo de fluorescencia de calcio reportado aquí se puede adaptar para detectar otros GPCR que activan la cascada de señalización Ca2+ .

Se utilizó una placa de fármaco interna (SAC2-34-6170) compuesta por 320 moléculas pequeñas aleatorias para demostrar este ensayo HTS como ejemplo. El HTS tuvo una excelente calidad de ensayo con un factor Z' de 0,7 (Tabla 1). Este factor Z' refleja la calidad del ensayo independientemente de los compuestos probados34. Un factor Z′ de 0,5 o superior indica un buen rango dinámico de señal de ensayo entre las RFU de los controles positivos y negativos. ...

Watch this Scientific Journal Video about A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors at JoVE.com

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

En este trabajo, se describe un ensayo de fluorescencia de calcio intracelular de alto rendimiento para placas de 384 pocillos para examinar bibliotecas de moléculas pequeñas en receptores acoplados a proteínas G recombinantes (GPCR). El objetivo, el receptor de cinina de la garrapata de la fiebre del ganado, Rhipicephalus microplus, se expresa en las células CHO-K1. Este ensayo identifica agonistas y antagonistas utilizando las mismas células en un ensayo de "doble adición".

Un ensayo de fluorescencia de calcio de "doble adición" para el cribado de alto rendimiento de receptores acoplados a proteínas G recombinantes

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

El ensayo de doble adición de fluorescencia de calcio de alto rendimiento permite la identificación de nuevos ligandos de moléculas pequeñas de un receptor acoplado a proteína G que envía señales a través de la cascada de calcio intracelular. La principal ventaja del ensayo de doble adición es la detección de HTS agonista y antagonista en un solo ensayo con las mismas células, siempre que la señal de fluorescencia dure dos minutos. Este método se puede aplicar a cualquier GPCR que señale a través de la cascada de calcio, que incluye la mayor parte de la familia de péptidos de neuronas artrópodos, un GPCR.Para la reproducibilidad del ensayo, es importante optimizar la densidad celular, la velocidad de inyección y la concentración del agonista conocido para la segunda edición. Demostrando el procedimiento estará Bianca Henriques-Santos, investigadora postdoctoral asociada en mi laboratorio. Comience el ensayo de fluorescencia de calcio retirando el medio gastado del matraz T-75 que contiene 70 a 90% de tres células BMLK confluentes.Lave las células con 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco o DPBS. Después de retirar el DPBS, separe las células con dos mililitros de ácido etilendiaminotetraacético o EDTA al 0,25% de tripsina e incube durante tres a cinco minutos a 37 grados centígrados. Agregue ocho mililitros de medio selectivo y transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros.Antes de centrifugar la suspensión celular a 1000 x g durante tres minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 10 mililitros de medio F-12K que contenga 1% de suero bovino fetal o FBS y 400 microgramos por mililitro de sulfato G418. Para determinar la densidad celular de la suspensión para una dilución adicional, mezcle 20 microlitros de suspensión celular en 20 microlitros de azul de tripano al 0,4% y luego cargue 20 microlitros de mezcla en una cámara de conteo celular para que la lea un contador de células para determinar la densidad celular.Diluir la suspensión celular usando el mismo medio F-12K y completar el volumen final a 15 mililitros a una densidad de cuatro veces 10 a la quinta celda por mililitro. Para sembrar las células en la placa de lisina Poly-D o PDL codificada 384 pocillos. Agregue 25 microlitros de la suspensión de celda diluida en 384 pocillos de la placa utilizando un sistema de manejo de líquidos.Incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en la incubadora humidificada. Al día siguiente, invierta rápidamente la placa de pocillos de 384 confluentes al 90%. Para retirar el medio gastado y secar suavemente en toallas de papel estériles dos o tres veces para eliminar todo el líquido del plato.Realice los siguientes pasos en la luz tenue suave dentro del gabinete de bioseguridad. A continuación, agregue 25 microlitros del tinte de carga en cada pocillo utilizando un sistema de manejo de líquidos dispensando 12.5 microlitros en cada pocillo con una velocidad de aspiración y dispensación de 3.8 microlitros por segundo. Repita este paso de pipeteo para alcanzar un volumen final de 25 microlitros en cada pozo.Una vez hecho esto, cubra la placa con papel de aluminio para protegerla de la luz ambiental e incube a 37 grados centígrados en la incubadora humidificada de dióxido de carbono durante 30 minutos. Después de equilibrar la placa cubierta durante otros 30 minutos, las células están listas para el cribado de alto rendimiento o HTS. A continuación, centrifugar la placa de fármaco a 1200 x g en una centrífuga de placa durante un minuto.Transfiera la solución peptídica agonista 10x de Rhimi-K-1 a un depósito autoamigable de 150 mililitros. En el lector de placas, haga clic en administrar protocolos. Luego, en el protocolo de intensidad fluorescente de punto final, seleccione Flow Forte pre-read, haga clic en iniciar medición para medir la señal de fondo para todo el ensayo HTS.Inserte la placa celular en el lector de placas. En el panel de instrumentos, haga clic en un pozo aleatorio en la placa y luego haga clic en la nueva altura de enfoque. Haga clic en ajuste de enfoque.Haga clic en ajuste de ganancia. Asígnelo como 5% a 10% del valor máximo de fluorescencia medible. Haga clic en Iniciar ajuste.Haga clic en iniciar medición para leer toda la placa de la señal de fluorescencia de fondo en unidades de fluorescencia relativa o RFU. Mientras la placa está leyendo, haga clic en el estado actual para ver el valor de lectura en tiempo real. Para el ensayo de doble adición, pipetear 10 microlitros de la solución del fármaco hacia arriba y hacia abajo tres veces utilizando el sistema de manejo de líquidos y aspirar 1,5 microlitros de cada pocillo de la placa del fármaco a una velocidad de aspiración de 1,0 microlitros por segundo.Dispensar 0,5 microlitros de los compuestos en el ensayo celular para alcanzar una concentración final de dos micromolares en 0,2% de dimetilsulfóxido o DMSO. Después de agregar los compuestos de cribado, coloque la placa de ensayo inmediatamente en el lector de placas. Haga clic en el programa de lectura preestablecido y lea la placa en las direcciones de lectura hacia adelante y hacia atrás.Deseche un microlitro de solución de fármaco restante en las puntas sumergiendo las puntas en un depósito de residuos de 150 mililitros que contenga aproximadamente 50 mililitros de DPBS. Incubar los compuestos de cribado con las células durante un total de cinco minutos, incluido el tiempo dentro del lector de placas en el gabinete de bioseguridad con las luces apagadas. A continuación, agregue tres microlitros del péptido agonista Rhimi-K-1 del depósito en la placa de ensayo utilizando el sistema de manejo de líquidos utilizando 384 puntas de 12.5 microlitros.Coloque la placa en el lector de placas inmediatamente. Haga clic en el programa de lectura preestablecido y lea la placa en las direcciones de lectura hacia adelante y hacia atrás. Una vez hecho esto, calcule manualmente el factor Z para el control de calidad de cada ensayo de placa.Seleccione manualmente las moléculas de impacto de los mapas de calor en la plataforma de datos HTS en línea y calcule el porcentaje normalizado de activación o NPA y actividad inhibitoria, o I0 para los golpes de agonistas y los golpes de antagonistas. Se utilizó una placa de fármaco interna SAC2-34-6170 compuesta por 320 moléculas pequeñas aleatorias para demostrar este ensayo HTS. El HTS tuvo una excelente calidad de ensayo con un factor Z de 0,7 que refleja que la calidad del ensayo independiente de los compuestos probados.Es esencial leer la placa inmediatamente después de agregar el agonista porque la señal de fluorescencia es de corta duración. Después de este procedimiento, la molécula de acierto identificada debe validarse mediante ensayos de dosis-respuesta y probarse en células que no expresen el GPCR objetivo para excluir los golpes fuera del objetivo.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

La selección de alto rendimiento de los hidratos de carbono-El uso de enzimas que degradan la novela insoluble cromogénico sustrato de ensayo Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Investigación

Bioquímica

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Método para la identificación de inhibidores de moléculas pequeñas de la interacción proteína-proteína entre HCN1 y TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Medición de la señalización del receptor acoplado a la proteína G mediante unión de GTP marcada con radio

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Un método Simple para la detección química de alto rendimiento en Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Un ensayo de luciferasa de alto rendimiento para evaluar la proteólisis de la facturación única proteasa PCSK9

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Una adaptación de semi-alto rendimiento del ensayo ATPase acoplado a NADH para la detección de inhibidores de moléculas pequeñas

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Fluorescencia de reflexión interna total de alto rendimiento y microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa utilizando un chip fotónico

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

KRAS4b recombinante totalmente procesado: Aislamiento y caracterización de la proteína farnesilada y metilada

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Examen estratégico y caracterización del complejo de señalización de proteínas Visual GPCR-mini-G para una cristalización exitosa

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Ensayo fluorométrico basado en química de clics para la apolipoproteína N-aciltransferasa desde la caracterización enzimática hasta el cribado de alto rendimiento

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...