Name: a "dual-addition" calcium fluorescence assay for the high-throughput screening of recombinant g protein-coupled receptors
Uploaded: 2022-12-02T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors at JoVE.com

Detta arbete stöddes av USDA-NIFA-AFRI Animal Health and Well-Being Award (prisnummer 2022-67015-36336, PVP [projektledare]) och från konkurrenskraftiga medel från Texas A&M AgriLife Research Insect Vector Diseases Grant Program (FY'22-23) till P.V.P. A.W.E.S.O.M.E.-fakultetsgruppen vid College of Agriculture and Life Sciences, TAMU, är erkänd för hjälp med att redigera manuskriptet. Kompletterande tabell S2 innehåller data från ett internt, slumpmässigt, småmolekylärt bibliotek som erhållits från Dr. James Sacchettinis laboratorium vid Texas A&M University och Texas A&M AgriLife Research.

1. Cell underhåll
OBS: En CHO-K1-cellinje som stabilt uttrycker kininreceptorn från R. microplus, med namnet BMLK3, utvecklades av Holmes et al.16. Detaljerna om utvecklingen av cellinjen presenteras någon annanstans14. Alla följande steg utförs under sterila förhållanden i ett klass II biosäkerhetsskåp.
<ol><li>Odla den rekombinanta cellinjen i selektiva medier (F-12K-medium innehållande 10% fetal...

<ol>
	<li>Hanlon, C. D., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outside-in+signaling+-+A+brief+review+of+GPCR+signaling+with+a+focus+on+the+Drosophila+GPCR+family.">Outside-in signaling - A brief review of GPCR signaling with a focus on the Drosophila GPCR family.</a> Journal of Cell Science. 128 (19), 3533-3542 (2015).</li><li>Liu, N., Li, T., Wang, Y., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein+coupled+receptors+(GPCRs)+in+insects-A+potential+target+for+new+insecticide+development.">G-protein coupled receptors (GPCRs) in insects-A potential target for new insecticide development.</a> Molecules. 26 (10), 2993 (2021).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 639-650 (2002).</li><li>Pietrantonio, P. V., Xiong, C., Nachman, R. J., Shen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptors+in+arthropod+vectors:+Omics+and+pharmacological+approaches+to+elucidate+ligand-receptor+interactions+and+novel+organismal+functions.">G protein-coupled receptors in arthropod vectors: Omics and pharmacological approaches to elucidate ligand-receptor interactions and novel organismal functions.</a> Current Opinion in Insect Science. 29, 12-20 (2018).</li><li>Hilger, D., Masureel, M., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+GPCR+signaling+complexes.">Structure and dynamics of GPCR signaling complexes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (1), 4-12 (2018).</li><li>Liu, N., Wang, Y., Li, T., Feng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein+coupled+receptors+(GPCRs):+Signaling+pathways,+characterization,+and+functions+in+insect+physiology+and+toxicology.">G-protein coupled receptors (GPCRs): Signaling pathways, characterization, and functions in insect physiology and toxicology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (10), 5260 (2021).</li><li>Hansen, K. B., Br&#228;uner-Osborne, H., Leifert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIPR&#174;+assays+of+intracellular+calcium+in+GPCR+drug+discovery.">FLIPR&#174; assays of intracellular calcium in GPCR drug discovery.</a> G Protein-Coupled Receptors in Drug Discovery. , (2009).</li><li>Bauknecht, P., Jekely, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+combinatorial+deorphanization+of+Platynereis+neuropeptide+GPCRs.">Large-scale combinatorial deorphanization of Platynereis neuropeptide GPCRs.</a> Cell Reports. 12 (4), 684-693 (2015).</li><li>Frooninckx, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+GPCRs+in+C.+elegans.">Neuropeptide GPCRs in C. elegans.</a> Frontiers in Endocrinology. 3, 167 (2012).</li><li>Caers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+two+decades+of+research+on+insect+neuropeptide+GPCRs:+An+overview.">More than two decades of research on insect neuropeptide GPCRs: An overview.</a> Frontiers in Endocrinology. 3, 151 (2012).</li><li>&#352;imo, L., Ko&#269;i, J., Park, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptors+for+the+neuropeptides,+myoinhibitory+peptide+and+SIFamide,+in+control+of+the+salivary+glands+of+the+blacklegged+tick+Ixodes+scapularis.">Receptors for the neuropeptides, myoinhibitory peptide and SIFamide, in control of the salivary glands of the blacklegged tick Ixodes scapularis.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (4), 376-387 (2013).</li><li>&#352;imo, L., Park, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptidergic+control+of+the+hindgut+in+the+black-legged+tick+Ixodes+scapularis.">Neuropeptidergic control of the hindgut in the black-legged tick Ixodes scapularis.</a> International Journal for Parasitology. 44 (11), 819-826 (2014).</li><li>Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+genetic+characterization+of+neuropeptide+Y-like+receptors+in+Aedes+aegypti.">Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 2486 (2013).</li><li>Lu, H. L., Kersch, C. N., Taneja-Bageshwar, S., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+calcium+bioluminescence+assay+for+functional+analysis+of+mosquito+(Aedes+aegypti)+and+tick+(Rhipicephalus+microplus)+G+protein-coupled+receptors.">A calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (Aedes aegypti) and tick (Rhipicephalus microplus) G protein-coupled receptors.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2732 (2011).</li><li>Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cattle+fever+tick,+Rhipicephalus+microplus,+as+a+model+for+forward+pharmacology+to+elucidate+kinin+GPCR+function+in+the+Acari.">The cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, as a model for forward pharmacology to elucidate kinin GPCR function in the Acari.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1008 (2019).</li><li>Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+a+G+protein-coupled+receptor+from+the+Southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+(Acari:+Ixodidae)+identifies+it+as+the+first+arthropod+myokinin+receptor.">Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor.</a> Insect Molecular Biology. 12 (1), 27-38 (2003).</li><li>Cox, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning,+characterization,+and+expression+of+a+G-protein-coupled+receptor+from+Lymnaea+stagnalis+and+identification+of+a+leucokinin-like+peptide,+PSFHSWSamide,+as+its+endogenous+ligand.">Cloning, characterization, and expression of a G-protein-coupled receptor from Lymnaea stagnalis and identification of a leucokinin-like peptide, PSFHSWSamide, as its endogenous ligand.</a> Journal of Neuroscience. 17 (4), 1197-1205 (1997).</li><li>Dircksen, H., Kastin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+32+-+Crustacean+bioactive+peptides.">Chapter 32 - Crustacean bioactive peptides.</a> Handbook of Biologically Active Peptides (Second Edition). , 209-221 (2013).</li><li>Halberg, K. A., Terhzaz, S., Cabrero, P., Davies, S. A., Dow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+the+evolutionary+origins+of+insect+renal+function.">Tracing the evolutionary origins of insect renal function.</a> Nature Communications. 6, 6800 (2015).</li><li>Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+leucokinin+receptor+is+a+multiligand+receptor+for+the+three+Aedes+kinins.">The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins.</a> Insect Molecular Biology. 14 (1), 55-67 (2005).</li><li>Radford, J. C., Davies, S. A., Dow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+G-protein-coupled+receptor+analysis+in+Drosophila+melanogaster+identifies+a+leucokinin+receptor+with+novel+roles.">Systematic G-protein-coupled receptor analysis in Drosophila melanogaster identifies a leucokinin receptor with novel roles.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38810-38817 (2002).</li><li>Brock, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+leucokinin-like+peptide+receptor+from+the+cattle+fever+tick,+Rhipicephalus+microplus,+is+localized+in+the+midgut+periphery+and+receptor+silencing+with+validated+double-stranded+RNAs+causes+a+reproductive+fitness+cost.">The leucokinin-like peptide receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, is localized in the midgut periphery and receptor silencing with validated double-stranded RNAs causes a reproductive fitness cost.</a> International Journal for Parasitology. 49 (3-4), 287-299 (2019).</li><li>N&#228;ssel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucokinin+and+associated+neuropeptides+regulate+multiple+aspects+of+physiology+and+behavior+in+Drosophila.">Leucokinin and associated neuropeptides regulate multiple aspects of physiology and behavior in Drosophila.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1940 (2021).</li><li>Kim, Y. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+peptidergic+ensembles+associated+with+organization+of+an+innate+behavior.">Central peptidergic ensembles associated with organization of an innate behavior.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14211-14216 (2006).</li><li>Al-Anzi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+leucokinin+pathway+and+its+neurons+regulate+meal+size+in+Drosophila.">The leucokinin pathway and its neurons regulate meal size in Drosophila.</a> Current Biology. 20 (11), 969-978 (2010).</li><li>Yurgel, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+pair+of+leucokinin+neurons+are+modulated+by+feeding+state+and+regulate+sleep-metabolism+interactions.">A single pair of leucokinin neurons are modulated by feeding state and regulate sleep-metabolism interactions.</a> PLoS Biology. 17 (2), 2006409 (2019).</li><li>N&#228;ssel, D. R., Zandawala, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+neuropeptide+signaling+in+Drosophila,+from+genes+to+physiology+and+behavior.">Recent advances in neuropeptide signaling in Drosophila, from genes to physiology and behavior.</a> Progress in Neurobiology. 179, 101607 (2019).</li><li>Okusawa, S., Kohsaka, H., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+and+downstream+leucokinin+neurons+modulate+larval+turning+behavior+in+Drosophila.">Serotonin and downstream leucokinin neurons modulate larval turning behavior in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 34 (7), 2544-2558 (2014).</li><li>Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+leucokinin+receptor+is+critical+for+in+vivo+fluid+excretion+post+blood+feeding.">Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding.</a> FEBS letters. 585 (22), 3507-3512 (2011).</li><li>Kwon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucokinin+mimetic+elicits+aversive+behavior+in+mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+and+inhibits+the+sugar+taste+neuron.">Leucokinin mimetic elicits aversive behavior in mosquito Aedes aegypti (L.) and inhibits the sugar taste neuron.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 6880-6885 (2016).</li><li>Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+random+small+molecule+library+screen+identifies+novel+antagonists+of+the+kinin+receptor+from+the+cattle+fever+tick,+Rhipicephalus+microplus+(Acari:+Ixodidae).">A random small molecule library screen identifies novel antagonists of the kinin receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae).</a> Pest Management Science. 77 (5), 2238-2251 (2021).</li><li>Torfs, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinin+peptide+family+in+invertebrates.">The kinin peptide family in invertebrates.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 897 (1), 361-373 (1999).</li><li>Ma, Q., Ye, L., Liu, H., Shi, Y., Zhou, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+Ca2++mobilization+assays+in+GPCR+drug+discovery.">An overview of Ca2+ mobilization assays in GPCR drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (5), 511-523 (2017).</li><li>Zhang, J. -. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).</li><li>Offermanns, S., Simon, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&#945;15+and+G&#945;16+couple+a+wide+variety+of+receptors+to+phospholipase+C.">G&#945;15 and G&#945;16 couple a wide variety of receptors to phospholipase C.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (25), 15175-15180 (1995).</li><li>Murgia, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+phenotypic+screening+identifies+novel+chemistries+that+disrupt+mosquito+activity+and+development.">High-content phenotypic screening identifies novel chemistries that disrupt mosquito activity and development.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 182, 105037 (2022).</li><li>Lismont, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+BRET-based+biosensors+be+used+to+characterize+G-protein+mediated+signaling+pathways+of+an+insect+GPCR,+the+Schistocerca+gregaria+CRF-related+diuretic+hormone+receptor.">Can BRET-based biosensors be used to characterize G-protein mediated signaling pathways of an insect GPCR, the Schistocerca gregaria CRF-related diuretic hormone receptor.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 122, 103392 (2020).</li></ol>

Målet med HTS är att identifiera träffmolekyler genom screening av ett stort antal små molekyler. Därför representerar resultaten från det här exemplet bara en liten del av ett konventionellt HTS-experiment. Dessutom måste de identifierade träffmolekylerna valideras i nedströmsanalyser, såsom en dosberoende analys på samma rekombinanta cellinje och på en CHO-K1-cellinje som endast bär den tomma vektorn, som kan utföras samtidigt för att spara små molekyler. Cytotoxicitetsanalyser hjälper till att visa ...

G-proteinkopplade receptorer (GPCR), som finns från jäst till människor, representerar den största superfamiljen av receptorer i många organismer1. De spelar kritiska roller för att reglera nästan alla biologiska processer hos djur. Det finns 50-200 GPCR i genomet hos leddjur, vilket innebär att de representerar den största membranreceptoröverfamiljen2. De klassificeras i sex huvudklasser, A-F, baserat på deras sekvenslikhet och funktioner3. GPCR transducerar olika extracellulära signaler, såsom hormoner, neuropeptider, biogena aminer, glutamat, proton, lipoglykoproteiner och fotoner4. GPCR kopplas till heterotrimer-G-proteiner (Gα, Gβ och Gγ) för att överföra nedströmssignaler. GPCR kopplade till Gαs eller Gαi / o-proteiner ökar respektive minskar de intracellulära 3', 5'-cykliska adenosinmonofosfatnivåerna (cAMP) genom att aktivera eller hämma adenylylcyklas. GPCR kopplade till Gαq / 11 inducerar kalciumfrisättning från endoplasmatiska retikulumkalciumförråden genom att aktivera fosfolipas C (PLC) -inositol-1,4,5-trifosfat (IP3) vägen. GPCR kopplade till Gα12/13 aktiverar RhoGTPase nukleotidutbytesfaktorer 5,6. GPCR är målet för mer än 50% av humana droger och en akaricid, amitraz4. Eftersom GPCR omvandlar så olika signaler är de lovande mål för att utveckla nya bekämpningsmedel som stör ryggradslösa djurspecifika fysiologiska funktioner.
Målet med HTS är att identifiera träffmolekyler som kan modulera receptorfunktioner. HTS involverar analysutveckling, miniatyrisering och automatisering7. Leddjur neuropeptid GPCR är involverade i de flesta fysiologiska funktioner, såsom utveckling, smältning och ecdysis, utsöndring, energimobilisering och reproduktion4. De flesta neuropeptid-GPCR: erna hos leddjur och metazoer signalerar genom kalciumsignalkaskaden 2,6,8,9,10, såsom i myoinhibitoripeptid och SIFamidreceptorer i den svarta fästingen Ixodes scapularis; deras ligander är antagonistiska i bakgutmotilitetsanalyser, med SIF som framkallar sammandragning och MIP hämmar den11,12. En NPY-liknande receptor för gula febern myggan, Aedes aegypti, reglerar kvinnlig värd som söker13. Jämfört med andra alternativa kalciummobiliseringsanalyser, såsom aequorinkalciumbioluminescensanalys14, är kalciumfluorescensanalysen lätt att utföra, kräver inte transfektion av andra rekombinanta kalciumdetekterande proteiner och är kostnadseffektiv. Kalciumfluorescensanalysen ger en långvarig signal jämfört med den snabba kinetiska signalen som erhålls i aequorinkalciumbioluminescensanalysen14,15.
I exemplet här uttrycktes kininreceptorn från nötkreatursfeberfästingen, Rhipicephalus microplus, rekombinant i CHO-K1-cellinjen och användes för kalciumfluorescensanalysen. Det finns bara en kininreceptorgen som finns i R. microplus; receptorn signalerar genom en Gq-proteinberoende signalväg och utlöser efflux av Ca2+ från kalciumförråd till det intracellulära utrymmet16. Denna process kan detekteras och kvantifieras med en fluorofor, som framkallar en fluorescenssignal vid bindning av kalciumjoner (figur 1).
Kininreceptorn är en ryggradslös djurspecifik GPCR, som tillhör de klass A Rhodopsin-liknande receptorerna. Kinin är en gammal signalerande neuropeptid som finns i Mollusca, Crustacea, Insecta och Acari 4,17,18. Coleopterans (skalbaggar) saknar kininsignalsystemet; i myggan Aedes aegypti finns det bara en kininreceptor som binder tre aedeskininer, medan Drosophila melanogaster har en kininreceptor med drosokinin som en unik ligand 19,20,21. Det finns inga homologa kininer eller kininreceptorer hos ryggradsdjur. Även om kinins exakta funktion är okänd hos fästingar, visar kininreceptorn RNAi-tystade honor av R. microplus signifikant minskad reproduktiv kondition22. Kininer är pleotropa peptider i insekter. I Drosophila melanogaster är de involverade i både centrala och perifera nervsystemet 23, pre-ecdysis 24, matning25, metabolism 26 och sömnaktivitetsmönster26,27, samt larvrörelse 28. Kininer reglerar bakgutkontraktion, diurese och utfodring i myggan A. aegypti 29,30,31. Kininpeptiderna har en konserverad C-terminal pentapeptid Phe-X1-X2-Trp-Gly-NH2, vilket är den minsta erforderliga sekvensen för biologisk aktivitet32. Leddjursspecificiteten, den lilla storleken på den endogena liganden, vilket gör dem mottagliga för småmolekylära störningar och de pleiotropa funktionerna hos insekter gör kininreceptorn till ett lovande mål för skadedjursbekämpning4.
Analysen "dual-addition" (figur 2) möjliggör identifiering av agonister eller antagonister i samma HTS-analys15. Den är anpassad från en "dual-addition" -analys som vanligtvis används inom läkemedelsindustrin för läkemedelsupptäckt33. I korthet möjliggör den första tillsatsen av läkemedel i cellplattan identifiering av potentiella agonister i det kemiska biblioteket när en högre fluorescenssignal detekteras jämfört med appliceringen av lösningsmedelskontrollen. Efter 5 minuters inkubation med dessa små molekyler appliceras en känd agonist (kininpeptid) på alla brunnar. De brunnar som slumpmässigt fick en antagonist från läkemedelsplattan visar en lägre fluorescenssignal vid agonisttillsats jämfört med kontrollbrunnarna som fick lösningsmedlet i den första tillsatsen. Denna analys möjliggör sedan identifiering av potentiella agonister och antagonister med samma celler. I ett standard HTS-projekt skulle dessa träffmolekyler valideras ytterligare genom dos-responsanalyser och genom ytterligare biologiska aktivitetsanalyser, som inte visas här.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64505/64505fig01.jpg"> Figur 1: Illustration av kalciumfluorescensanalysmekanismen. Gq-proteinet utlöser den intracellulära kalciumsignalvägen. Kininreceptorn (G-proteinkopplad receptor) uttrycktes rekombinant i CHO-K1-celler. När agonistliganden binder till receptorn aktiverar Gq-proteinet associerat med kininreceptorn PLC, vilket katalyserar omvandlingen av en PIP2-molekyl till IP3 och DAG. IP 3 binder sedan till IP3R på ytan av endoplasmatisk retikulum, vilket leder till frisättning av Ca 2+ i cytoplasman, där Ca2+ joner binder till fluoroforerna och framkallar en fluorescenssignal. Fluorescenssignalen kan erhållas genom excitation vid 490 nm och detekteras vid 514 nm. Förkortningar: GPCR = G proteinkopplad receptor; PLC = fosfolipas C; PIP2 = fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat; IP3 = inositoltrisfosfat; DAG = diacylglycerol; IP 3 R = IP3-receptor. Skapad med BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64505/64505fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64505/64505fig02.jpg"> Figur 2: Arbetsflödet för screening med hög genomströmning av små molekyler på en G-proteinkopplad receptor uttryckt i CHO-K1-celler. (A) Rekombinanta CHO-K1-celler som stabilt uttrycker kininreceptorn tillsattes till 384-brunnsplattan (10 000 celler/brunn) med hjälp av ett vätskehanteringssystem (25 μl/brunn) och inkuberades i en fuktad CO2-inkubator i12-16 timmar. (B ) Analysbufferten som innehåller det fluorescerande färgämnet (25 μl/brunn) tillsattes i cellplattan med hjälp av ett vätskehanteringssystem. Plattan inkuberades i 30 min vid 37 °C i 30 min och jämnades vid RT i ytterligare 30 min. (D) Läkemedelslösningar från en biblioteksplatta med 384 brunnar och blankt lösningsmedel (alla vid 0,5 μl/brunn) tillsattes i den cellulära analysplattan med hjälp av ett vätskehanteringssystem. (E) Cellulära kalciumfluorescenssvar mättes med plattläsaren omedelbart efter tillsats av läkemedelslösningarna; föreningar som framkallade högre fluorescenssignaler än genomsnittet valdes ut som agonistträff(ar). Antagonistträffar som blockerar GPCR (ikonen nedan) avslöjades efter tillsatsen av peptidagonisten under steg G. (F) I samma analysplatta, efter 5 minuters inkubation av cellerna med screeningföreningar, tillsattes en endogen agonistpeptid Rhimi-K-1 (QFSPWGamid) av fästingkininreceptorn till varje brunn (1 μM). (G) Cellulära fluorescenssvar efter tillsats av agonistpeptiden mättes omedelbart av plattläsaren. Förening (er) som hämmar fluorescenssignalen valdes som antagonistträff(ar). Förkortningar: GPCR = G proteinkopplad receptor; RT = rumstemperatur; RFU = relativa fluorescensenheter. Skapad med BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64505/64505fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>15050-065</td>
			<td>with phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% trypan blue</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td>liquid, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM12400</td>
			<td>RNase-free Microfuge Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-045</td>
			<td>Corning Costar Stripette individually wrapped&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-047</td>
			<td>Corning Costar Stripette individually wrapped&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L filter tips</td>
			<td>USA Scientifc Inc.</td>
			<td>P1121</td>
			<td>sterile, barrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-049</td>
			<td>Corning Costar Stripette individually wrapped&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>graduated, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL auto-friendly reservior</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>6317</td>
			<td>sterile, individually wrapped for cell seeding in day 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL auto-friendly reservior</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>6318</td>
			<td>sterile, stacked, for loading dye in day 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384/ 12.5 &#181;L low retention tips</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>6405</td>
			<td>long, sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384/ 12.5 &#181;L tips</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>6404</td>
			<td>long, sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781091</td>
			<td>CELLSTAR, clear polystyrene, &#181;Clear, Black/Flat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum plate seals</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>PCR-AS-200</td>
			<td>polyester-based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil wrap</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafty cabinet II</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-540-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>AutoT4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell counting slides</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>SD-100</td>
			<td>20 &#181;L chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 humidified incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Forma Series II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desk Lamp</td>
			<td>SunvaleeyTEK</td>
			<td>RS1000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>276855</td>
			<td>anhydous, &#62;99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>DPBS, 1x without calcium amd magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12K Nutrient Mixture&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-354</td>
			<td>(Kaighn&#39;s Mod.) with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>SFBU30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent calcium assay kit</td>
			<td>ENZO Lifescience</td>
			<td>ENZ-51017</td>
			<td>10x96 tests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 sulfate</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>10131-027</td>
			<td>Geneticin selective antibiotic 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s buffer</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>55037C</td>
			<td>HBSS modified, with calcium, with magnesium, without phenol read</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>1 Molar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTS data storage plateform</td>
			<td>CDD vault&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://www.collaborativedrug.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid handling system</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>Viaflo</td>
			<td>384/12.5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Sorvall ST8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BMG technology</td>
			<td>Clariostar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhimi-K-1 agonist peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>custom order</td>
			<td>QFSPWGamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a "dual-addition" calcium fluorescence assay for the high-throughput screening of recombinant g protein-coupled receptors

G-proteinkopplade receptorer (GPCR) representerar den största superfamiljen av receptorer och är målen för många mänskliga läkemedel. High-throughput screening (HTS) av slumpmässiga småmolekylbibliotek mot GPCR används av läkemedelsindustrin för målspecifik läkemedelsupptäckt. I denna studie användes en HTS för att identifiera nya småmolekylära ligander av ryggradslösa djurspecifika neuropeptid-GPCR som sonder för fysiologiska studier av vektorer av dödliga mänskliga och veterinära patogener.
Den ryggradslösa djurspecifika kininreceptorn valdes som mål eftersom den reglerar många viktiga fysiologiska processer hos ryggradslösa djur, inklusive diurese, utfodring och matsmältning. Dessutom är farmakologin hos många ryggradslösa djur-GPCR dåligt karakteriserad eller inte karakteriserad alls; Därför tillför differentialfarmakologin hos dessa grupper av receptorer med avseende på de relaterade GPCR: erna i andra metazoer, särskilt människor, kunskap om struktur-aktivitetsförhållandena mellan GPCR som en superfamilj. En HTS-analys utvecklades för celler i 384-brunnsplattor för upptäckt av ligander av kininreceptorn från nötkreatursfeberfästingen eller södra boskapsfästingen, Rhipicephalus microplus. Fästingkininreceptorn uttrycktes stabilt i CHO-K1-celler.
Kininreceptorn, när den aktiveras av endogena kininneuropeptider eller andra småmolekylagonister, utlöser Ca2+ frisättning från kalciumförråd till cytoplasman. Denna kalciumfluorescensanalys i kombination med en "dual-addition" -metod kan detektera funktionell agonist och antagonist "hit" -molekyler i samma analysplatta. Varje analys utfördes med användning av läkemedelsplattor som bär en rad 320 slumpmässiga små molekyler. En tillförlitlig Z-faktor på 0,7 erhölls och tre agonister och två antagonistträffmolekyler identifierades när HTS var vid en slutlig koncentration på 2 μM. Kalciumfluorescensanalysen som rapporteras här kan anpassas för att screena andra GPCR som aktiverar Ca2+ signalkaskaden.

En intern läkemedelsplatta (SAC2-34-6170) bestående av 320 slumpmässiga små molekyler användes för att demonstrera denna HTS-analys som ett exempel. HTS hade utmärkt analyskvalitet med en Z-faktor på 0,7 (tabell 1). Denna Z-faktor återspeglar analyskvaliteten oberoende av de testade föreningarna34. En Z′-faktor på 0,5 eller högre indikerar ett bra dynamiskt analyssignalområde mellan de positiva kontrollernas RFU:er och de negativa kontrollerna....

Watch this Scientific Journal Video about A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors at JoVE.com

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

I detta arbete beskrivs en intracellulär kalciumfluorescensanalys med hög genomströmning för 384-brunnsplattor för att screena små molekylbibliotek på rekombinanta G-proteinkopplade receptorer (GPCR). Målet, kininreceptorn från nötkreatursfeberfästingen, Rhipicephalus microplus, uttrycks i CHO-K1-celler. Denna analys identifierar agonister och antagonister som använder samma celler i en "dual-addition" -analys.

En "dual-addition" kalciumfluorescensanalys för screening med hög genomströmning av rekombinanta G-proteinkopplade receptorer

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

High-Throughput screening kalciumfluorescens dubbel additionsanalys möjliggör identifiering av nya småmolekylära ligander av en G-proteinkopplad receptor som signalerar genom den intracellulära kalciumkaskaden. Den största fördelen med den dubbla additionsanalysen är detekteringen av agonist och antagonist HTS i en enda analys med samma celler förutsatt att fluorescenssignalen varar i två minuter. Denna metod kan tillämpas på vilken GPCR som helst som signalerar genom kalciumkaskaden, som inkluderar det mesta av leddjursneuronpeptidfamiljen, en GPCR.För analysreproducerbarhet är det viktigt att optimera celldensiteten, injektionshastigheten och koncentrationen av den kända agonisten för den andra upplagan. Demonstrerar proceduren kommer att vara Bianca Henriques-Santos, postdoktoral forskningsassistent i mitt laboratorium. Börja kalciumfluorescensanalysen genom att ta bort det förbrukade mediet från T-75-kolven innehållande 70 till 90% sammanflytande BMLK tre celler.Tvätta cellerna med 10 ml Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning eller DPBS. Efter avlägsnande av DPBS, lossa cellerna med två milliliter 0,25% trypsinetdiamintetraättiksyra eller EDTA och inkubera i tre till fem minuter vid 37 grader Celsius. Tillsätt åtta milliliter selektivt medium och överför cellsuspensionen till ett 15 ml koniskt rör.Före centrifugering av cellsuspensionen vid 1000 x g i tre minuter. Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 10 ml F-12K-medium innehållande 1% fetalt bovint serum eller FBS och 400 mikrogram per milliliter G418-sulfat. För att bestämma celldensiteten hos suspensionen för ytterligare utspädning, blanda 20 mikroliter cellsuspension i 20 mikroliter 0,4% trypanblå och ladda sedan 20 mikroliter blandning i en cellräkningskammare som ska läsas av en cellräknare för celldensitet.Späd cellsuspensionen med samma F-12K-medium och fyll den slutliga volymen till 15 ml med en densitet av fyra gånger 10 till de femte cellerna per milliliter. Att så cellerna i Poly-D-lysin- eller PDL-kodade 384-brunnsplattan. Tillsätt 25 mikroliter av den utspädda cellsuspensionen i 384 brunnar på plattan med hjälp av ett vätskehanteringssystem.Inkubera plattan över natten vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i den fuktade inkubatorn. Nästa dag, invertera snabbt 90% sammanflytande 384 brunnsplattan. För att ta bort det förbrukade mediet och försiktigt blottas på sterila pappershanddukar två till tre gånger för att ta bort all vätska från plattan.Utför nästa steg i det mjuka svaga ljuset inuti biosäkerhetsskåpet. Tillsätt sedan 25 mikroliter av lastfärgen i varje brunn med hjälp av ett vätskehanteringssystem genom att dosera 12,5 mikroliter i varje brunn med en aspiration och doseringshastighet på 3,8 mikroliter per sekund. Upprepa detta pipettsteg för att nå en slutlig volym på 25 mikroliter i varje brunn.När du är klar, täck plattan med aluminiumfolie för att skydda den från omgivande ljus och inkubera vid 37 grader Celsius i koldioxidfuktad inkubator i 30 minuter. Efter att ha utjämnat den täckta plattan i ytterligare 30 minuter är cellerna redo för screening med hög genomströmning eller HTS. Centrifugera sedan läkemedelsplattan vid 1200 x g i en plattcentrifug i en minut.Överför 10x agonistpeptidlösningen av Rhimi-K-1 till en 150 ml autovänlig behållare. Klicka på Hantera protokoll i plattläsaren. Välj sedan Flow Forte-förläsning i slutpunktsprotokollet för fluorescerande intensitet, klicka på starta mätning för att mäta bakgrundssignalen för hela HTS-analysen.Sätt i cellplattan i plattläsaren. Klicka på en slumpmässig brunn på plattan i instrumentpanelen och klicka sedan på ny fokushöjd. Klicka på fokusjustering.Klicka på förstärkningsjustering. Tilldela det som 5% till 10% av det maximala mätbara fluorescensvärdet. Klicka på startjustering.Klicka på startmätningen för att läsa hela plattan för bakgrundsfluorescenssignalen i relativa fluorescensenheter eller RFU. Medan plattan läser klickar du på aktuellt tillstånd för att se läsvärdet i realtid. För dubbeladditionsanalysen, pipettera 10 mikroliter av läkemedelslösningen upp och ner tre gånger med användning av vätskehanteringssystemet och aspirera 1,5 mikroliter från varje brunn i läkemedelsplattan med en aspirationshastighet på 1,0 mikroliter per sekund.Dispensera 0,5 mikroliter av föreningarna i cellanalysen för att nå en slutlig koncentration av två mikromolar i 0,2% dimetylsulfoxid eller DMSO. När du har tillsatt screeningföreningarna, placera analysplattan omedelbart i plattläsaren. Klicka på det förinställda läsprogrammet och läs plattan i framåt- och bakåtläsningsanvisningarna.Kassera en mikroliter läkemedelslösning som finns kvar i spetsarna genom att nedsänka spetsarna i en 150 ml avfallsbehållare innehållande cirka 50 ml DPBS. Inkubera screeningföreningarna med cellerna i totalt fem minuter, inklusive tiden inuti plattläsaren i biosäkerhetsskåpet med lamporna släckta. Tillsätt sedan tre mikroliter av agonistpeptiden Rhimi-K-1 från behållaren till analysplattan med hjälp av vätskehanteringssystemet med 384 12,5 mikroliter spetsar.Placera plattan i plattläsaren omedelbart. Klicka på det förinställda läsprogrammet och läs plattan i framåt- och bakåtläsningsanvisningarna. När du har gjort det beräknar du Z'factor manuellt för kvalitetskontrollen av varje plattanalys.Välj träffmolekylerna manuellt från värmekartorna på HTS-dataplattformen online och beräkna den normaliserade procentaktiveringen eller NPA och hämmande aktivitet, eller I0 för agonistträffar och antagonistträffar. En egen läkemedelsplatta SAC2-34-6170 bestående av 320 slumpmässiga små molekyler användes för att demonstrera denna HTS-analys. HTS hade utmärkt analyskvalitet med en Z'faktor på 0,7 vilket återspeglar att analyskvaliteten är oberoende av de testade föreningarna.Det är viktigt att läsa plattan omedelbart efter tillsats av agonisten eftersom fluorescenssignalen är kortlivad. Efter denna procedur bör den identifierade träffmolekylen valideras genom dosresponsanalyser och testas i celler som inte uttrycker mål-GPCR för att utesluta träffar utanför målet.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

High-throughput screening av kolhydratnedbrytande enzymer Använda Novel Olöslig kromogena substratmetod Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metod för att identifiera små molekylhämmare av protein-proteininteraktion Mellan HCN1 och TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Mätning av G-proteinkopplad receptorreceptor via radiomärkt GTP-bindning

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metod för hög genomströmning kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

En hög genomströmning luciferas analysen att utvärdera proteolys av enda-omsättning proteas PCSK9

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

En semi-High-genomströmning anpassning av NADH-kopplad ATPas-analys för screening av småmolekylära hämmare

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Hög genomströmning total intern reflektions fluorescens och direkt stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi med ett Fotoniskt chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Fullständigt bearbetat rekombinant KRAS4b: isolerar och karakteriserar det farnesylerade och metylerade proteinet

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Strategisk screening och karakterisering av Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex för framgångsrik kristallisering

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Klickkemibaserad fluorometrisk analys för apolipoprotein N-acyltransferas från enzymkarakterisering till screening med hög genomströmning

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...