Name: a "dual-addition" calcium fluorescence assay for the high-throughput screening of recombinant g protein-coupled receptors
Uploaded: 2022-12-02T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors at JoVE.com

Bu çalışma, USDA-NIFA-AFRI Hayvan Sağlığı ve Refahı Ödülü (Ödül numarası 2022-67015-36336, PVP [Proje Direktörü]) ve Texas A&M AgriLife Araştırma Böcek Vektör Hastalıkları Hibe Programı'ndan (FY'22-23) P.V.P.'ye kadar rekabetçi fonlardan desteklenmiştir. Ek Tablo S2 , Dr. James Sacchettini'nin Texas A & M Üniversitesi ve Texas A & M AgriLife Research'teki laboratuvarından elde edilen şirket içi, rastgele, küçük moleküllü bir kütüphaneden elde edilen verileri içerir.

1. Hücre bakımı
NOT:BMML 3 olarak adlandırılan R. microplus'tan kinin reseptörünü istikrarlı bir şekilde eksprese eden bir cho-K1 hücre hattı, Holmes ve ark.16 tarafından geliştirilmiştir. Hücre hattının gelişiminin ayrıntıları başka bir yerde sunulmuştur14. Aşağıdaki adımların tümü steril koşullar altında sınıf II biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilir.
<ol><li>Hedef r...

<ol>
	<li>Hanlon, C. D., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outside-in+signaling+-+A+brief+review+of+GPCR+signaling+with+a+focus+on+the+Drosophila+GPCR+family.">Outside-in signaling - A brief review of GPCR signaling with a focus on the Drosophila GPCR family.</a> Journal of Cell Science. 128 (19), 3533-3542 (2015).</li><li>Liu, N., Li, T., Wang, Y., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein+coupled+receptors+(GPCRs)+in+insects-A+potential+target+for+new+insecticide+development.">G-protein coupled receptors (GPCRs) in insects-A potential target for new insecticide development.</a> Molecules. 26 (10), 2993 (2021).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 639-650 (2002).</li><li>Pietrantonio, P. V., Xiong, C., Nachman, R. J., Shen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptors+in+arthropod+vectors:+Omics+and+pharmacological+approaches+to+elucidate+ligand-receptor+interactions+and+novel+organismal+functions.">G protein-coupled receptors in arthropod vectors: Omics and pharmacological approaches to elucidate ligand-receptor interactions and novel organismal functions.</a> Current Opinion in Insect Science. 29, 12-20 (2018).</li><li>Hilger, D., Masureel, M., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+GPCR+signaling+complexes.">Structure and dynamics of GPCR signaling complexes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (1), 4-12 (2018).</li><li>Liu, N., Wang, Y., Li, T., Feng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein+coupled+receptors+(GPCRs):+Signaling+pathways,+characterization,+and+functions+in+insect+physiology+and+toxicology.">G-protein coupled receptors (GPCRs): Signaling pathways, characterization, and functions in insect physiology and toxicology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (10), 5260 (2021).</li><li>Hansen, K. B., Br&#228;uner-Osborne, H., Leifert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIPR&#174;+assays+of+intracellular+calcium+in+GPCR+drug+discovery.">FLIPR&#174; assays of intracellular calcium in GPCR drug discovery.</a> G Protein-Coupled Receptors in Drug Discovery. , (2009).</li><li>Bauknecht, P., Jekely, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+combinatorial+deorphanization+of+Platynereis+neuropeptide+GPCRs.">Large-scale combinatorial deorphanization of Platynereis neuropeptide GPCRs.</a> Cell Reports. 12 (4), 684-693 (2015).</li><li>Frooninckx, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+GPCRs+in+C.+elegans.">Neuropeptide GPCRs in C. elegans.</a> Frontiers in Endocrinology. 3, 167 (2012).</li><li>Caers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+two+decades+of+research+on+insect+neuropeptide+GPCRs:+An+overview.">More than two decades of research on insect neuropeptide GPCRs: An overview.</a> Frontiers in Endocrinology. 3, 151 (2012).</li><li>&#352;imo, L., Ko&#269;i, J., Park, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptors+for+the+neuropeptides,+myoinhibitory+peptide+and+SIFamide,+in+control+of+the+salivary+glands+of+the+blacklegged+tick+Ixodes+scapularis.">Receptors for the neuropeptides, myoinhibitory peptide and SIFamide, in control of the salivary glands of the blacklegged tick Ixodes scapularis.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (4), 376-387 (2013).</li><li>&#352;imo, L., Park, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptidergic+control+of+the+hindgut+in+the+black-legged+tick+Ixodes+scapularis.">Neuropeptidergic control of the hindgut in the black-legged tick Ixodes scapularis.</a> International Journal for Parasitology. 44 (11), 819-826 (2014).</li><li>Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+genetic+characterization+of+neuropeptide+Y-like+receptors+in+Aedes+aegypti.">Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 2486 (2013).</li><li>Lu, H. L., Kersch, C. N., Taneja-Bageshwar, S., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+calcium+bioluminescence+assay+for+functional+analysis+of+mosquito+(Aedes+aegypti)+and+tick+(Rhipicephalus+microplus)+G+protein-coupled+receptors.">A calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (Aedes aegypti) and tick (Rhipicephalus microplus) G protein-coupled receptors.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2732 (2011).</li><li>Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cattle+fever+tick,+Rhipicephalus+microplus,+as+a+model+for+forward+pharmacology+to+elucidate+kinin+GPCR+function+in+the+Acari.">The cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, as a model for forward pharmacology to elucidate kinin GPCR function in the Acari.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1008 (2019).</li><li>Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+a+G+protein-coupled+receptor+from+the+Southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+(Acari:+Ixodidae)+identifies+it+as+the+first+arthropod+myokinin+receptor.">Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor.</a> Insect Molecular Biology. 12 (1), 27-38 (2003).</li><li>Cox, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning,+characterization,+and+expression+of+a+G-protein-coupled+receptor+from+Lymnaea+stagnalis+and+identification+of+a+leucokinin-like+peptide,+PSFHSWSamide,+as+its+endogenous+ligand.">Cloning, characterization, and expression of a G-protein-coupled receptor from Lymnaea stagnalis and identification of a leucokinin-like peptide, PSFHSWSamide, as its endogenous ligand.</a> Journal of Neuroscience. 17 (4), 1197-1205 (1997).</li><li>Dircksen, H., Kastin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+32+-+Crustacean+bioactive+peptides.">Chapter 32 - Crustacean bioactive peptides.</a> Handbook of Biologically Active Peptides (Second Edition). , 209-221 (2013).</li><li>Halberg, K. A., Terhzaz, S., Cabrero, P., Davies, S. A., Dow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+the+evolutionary+origins+of+insect+renal+function.">Tracing the evolutionary origins of insect renal function.</a> Nature Communications. 6, 6800 (2015).</li><li>Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+leucokinin+receptor+is+a+multiligand+receptor+for+the+three+Aedes+kinins.">The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins.</a> Insect Molecular Biology. 14 (1), 55-67 (2005).</li><li>Radford, J. C., Davies, S. A., Dow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+G-protein-coupled+receptor+analysis+in+Drosophila+melanogaster+identifies+a+leucokinin+receptor+with+novel+roles.">Systematic G-protein-coupled receptor analysis in Drosophila melanogaster identifies a leucokinin receptor with novel roles.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38810-38817 (2002).</li><li>Brock, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+leucokinin-like+peptide+receptor+from+the+cattle+fever+tick,+Rhipicephalus+microplus,+is+localized+in+the+midgut+periphery+and+receptor+silencing+with+validated+double-stranded+RNAs+causes+a+reproductive+fitness+cost.">The leucokinin-like peptide receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, is localized in the midgut periphery and receptor silencing with validated double-stranded RNAs causes a reproductive fitness cost.</a> International Journal for Parasitology. 49 (3-4), 287-299 (2019).</li><li>N&#228;ssel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucokinin+and+associated+neuropeptides+regulate+multiple+aspects+of+physiology+and+behavior+in+Drosophila.">Leucokinin and associated neuropeptides regulate multiple aspects of physiology and behavior in Drosophila.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1940 (2021).</li><li>Kim, Y. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+peptidergic+ensembles+associated+with+organization+of+an+innate+behavior.">Central peptidergic ensembles associated with organization of an innate behavior.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14211-14216 (2006).</li><li>Al-Anzi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+leucokinin+pathway+and+its+neurons+regulate+meal+size+in+Drosophila.">The leucokinin pathway and its neurons regulate meal size in Drosophila.</a> Current Biology. 20 (11), 969-978 (2010).</li><li>Yurgel, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+pair+of+leucokinin+neurons+are+modulated+by+feeding+state+and+regulate+sleep-metabolism+interactions.">A single pair of leucokinin neurons are modulated by feeding state and regulate sleep-metabolism interactions.</a> PLoS Biology. 17 (2), 2006409 (2019).</li><li>N&#228;ssel, D. R., Zandawala, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+neuropeptide+signaling+in+Drosophila,+from+genes+to+physiology+and+behavior.">Recent advances in neuropeptide signaling in Drosophila, from genes to physiology and behavior.</a> Progress in Neurobiology. 179, 101607 (2019).</li><li>Okusawa, S., Kohsaka, H., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+and+downstream+leucokinin+neurons+modulate+larval+turning+behavior+in+Drosophila.">Serotonin and downstream leucokinin neurons modulate larval turning behavior in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 34 (7), 2544-2558 (2014).</li><li>Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+leucokinin+receptor+is+critical+for+in+vivo+fluid+excretion+post+blood+feeding.">Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding.</a> FEBS letters. 585 (22), 3507-3512 (2011).</li><li>Kwon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucokinin+mimetic+elicits+aversive+behavior+in+mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+and+inhibits+the+sugar+taste+neuron.">Leucokinin mimetic elicits aversive behavior in mosquito Aedes aegypti (L.) and inhibits the sugar taste neuron.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 6880-6885 (2016).</li><li>Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+random+small+molecule+library+screen+identifies+novel+antagonists+of+the+kinin+receptor+from+the+cattle+fever+tick,+Rhipicephalus+microplus+(Acari:+Ixodidae).">A random small molecule library screen identifies novel antagonists of the kinin receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae).</a> Pest Management Science. 77 (5), 2238-2251 (2021).</li><li>Torfs, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinin+peptide+family+in+invertebrates.">The kinin peptide family in invertebrates.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 897 (1), 361-373 (1999).</li><li>Ma, Q., Ye, L., Liu, H., Shi, Y., Zhou, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+Ca2++mobilization+assays+in+GPCR+drug+discovery.">An overview of Ca2+ mobilization assays in GPCR drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (5), 511-523 (2017).</li><li>Zhang, J. -. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).</li><li>Offermanns, S., Simon, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&#945;15+and+G&#945;16+couple+a+wide+variety+of+receptors+to+phospholipase+C.">G&#945;15 and G&#945;16 couple a wide variety of receptors to phospholipase C.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (25), 15175-15180 (1995).</li><li>Murgia, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+phenotypic+screening+identifies+novel+chemistries+that+disrupt+mosquito+activity+and+development.">High-content phenotypic screening identifies novel chemistries that disrupt mosquito activity and development.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 182, 105037 (2022).</li><li>Lismont, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+BRET-based+biosensors+be+used+to+characterize+G-protein+mediated+signaling+pathways+of+an+insect+GPCR,+the+Schistocerca+gregaria+CRF-related+diuretic+hormone+receptor.">Can BRET-based biosensors be used to characterize G-protein mediated signaling pathways of an insect GPCR, the Schistocerca gregaria CRF-related diuretic hormone receptor.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 122, 103392 (2020).</li></ol>

HTS'nin amacı, çok sayıda küçük molekülü tarayarak isabetli molekülleri tanımlamaktır. Bu nedenle, bu örnekten elde edilen sonuçlar geleneksel bir HTS deneyinin yalnızca küçük bir bölümünü temsil etmektedir. Ayrıca, tanımlanan isabet moleküllerinin, aynı rekombinant hücre hattında ve sadece boş vektörü taşıyan bir CHO-K1 hücre hattında doza bağımlı bir tahlil gibi aşağı akış tahlillerinde doğrulanması gerekir; bu, küçük molekülleri kurtarmak için aynı anda gerçekleştiri...

Mayadan insanlara kadar mevcut olan G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler), birçok organizmada reseptörlerin en büyük süper ailesini temsil eder1. Hayvanlarda neredeyse tüm biyolojik süreçlerin düzenlenmesinde kritik rol oynarlar. Eklembacaklıların genomunda 50-200 GPCR vardır, yani en büyük membran reseptörü süper ailesi2'yi temsil ederler. Dizi benzerliklerine ve işlevlerine göre A-F olmak üzere altı ana sınıfa ayrılırlar3. GPCR'ler hormonlar, nöropeptitler, biyojenik aminler, glutamat, proton, lipoglikoproteinler ve fotonlar gibi çeşitli hücre dışı sinyalleri dönüştürür4. GPCR'ler, aşağı akış sinyallerini iletmek için heterotrimer G proteinlerine (Gα, Gβ ve Gγ) bağlanır. Gαs veya Gαi / o proteinlerine bağlı GPCR'ler, sırasıyla adenilil siklazı aktive ederek veya inhibe ederek hücre içi 3', 5'-siklik adenozin monofosfat (cAMP) seviyelerini arttırır veya azaltır. Gαq/11'e bağlı GPCR'ler, fosfolipaz C (PLC)-inositol-1,4,5-trifosfat (IP3) yolunu aktive ederek endoplazmik retikulum kalsiyum depolarından kalsiyum salınımını indükler. Gα12/13'e bağlı GPCR'ler RhoGTPaz nükleotid değişim faktörleri 5,6'yı aktive eder. GPCR'ler, insan ilaçlarının% 50'sinden fazlasının ve bir akarisitin hedefidir, amitraz4. GPCR'ler bu kadar çeşitli sinyalleri dönüştürürken, omurgasızlara özgü fizyolojik fonksiyonları bozan yeni pestisitler geliştirmek için umut verici hedeflerdir.
HTS'nin amacı, reseptör fonksiyonlarını modüle edebilen isabetli molekülleri tanımlamaktır. HTS, tahlil geliştirme, minyatürleştirme ve otomasyon7'yi içerir. Eklembacaklı nöropeptit GPCR'leri, gelişim, erime ve ekdisis, atılım, enerji mobilizasyonu ve üreme gibi çoğu fizyolojik fonksiyonda rol oynar4. Eklembacaklıların ve metazoanların nöropeptit GPCR'lerinin çoğu, siyah bacaklı kene Ixodes scapularis'in miyoinhibitör peptid ve SIFamid reseptörlerinde olduğu gibi, kalsiyum sinyal kaskadın 2,6,8,9,10 yoluyla sinyal verir; ligandları hindgut motilite testlerinde antagonistiktir, SIF kasılmaya neden olur ve MIP bunu inhibe eder11,12. Sarı humma sivrisineğinin NPY benzeri bir reseptörü olan Aedes aegypti,13 arayan kadın konağı düzenler. Aequorin kalsiyum biyolüminesans testi14 gibi diğer alternatif kalsiyum mobilizasyon testleriyle karşılaştırıldığında, kalsiyum floresan testinin gerçekleştirilmesi kolaydır, diğer rekombinant kalsiyum tespit proteinlerinin transfeksiyonunu gerektirmez ve uygun maliyetlidir. Kalsiyum floresan testi, aequorin kalsiyum biyolüminesans testi14,15'te elde edilen hızlı kinetik sinyale kıyasla uzun süreli bir sinyal üretir.
Buradaki örnekte, sığır ateşi kenesinden kinin reseptörü Rhipicephalus microplus, CHO-K1 hücre hattında rekombinant olarak eksprese edildi ve kalsiyum floresan testi için kullanıldı. R. microplus'ta bulunan sadece bir kinin reseptör geni vardır; reseptör, Gq proteinine bağımlı bir sinyal yolundan sinyal verir ve kalsiyum depolarından hücre içi boşluğa16 Ca2 + 'nın efflüksünü tetikler. Bu işlem, kalsiyum iyonlarını bağlarken bir floresan sinyali ortaya çıkaran bir florofor ile tespit edilebilir ve ölçülebilir (Şekil 1).
Kinin reseptörü, A Sınıfı Rodopsin benzeri reseptörlere ait omurgasızlara özgü bir GPCR'dir. Kinin, Mollusca, Crustacea, Insecta ve Acari 4,17,18'de bulunan eski bir sinyal nöropeptitidir. Koleopteranlar (böcekler) kinin sinyal sisteminden yoksundur; Sivrisinek Aedes aegypti'de, üç aedeskinin'i bağlayan sadece bir kinin reseptörü bulunurken, Drosophila melanogaster'in benzersiz bir ligand19,20,21 olarak drosokinin ile bir kinin reseptörü vardır. Omurgalılarda homolog kininler veya kinin reseptörleri yoktur. Kininin kesin işlevi kenelerde bilinmemekle birlikte, R. microplus'ın kinin reseptörü RNAi-susturulmuş dişileri, üreme uygunluğunu önemli ölçüde azalttığını göstermektedir22. Kininler böceklerde pleotropik peptitlerdir. Drosophila melanogaster'da, hem merkezi hem de periferik sinir düzenleyici sistemler 23, ekdisis öncesi 24, beslenme 25, metabolizma 26 ve uyku aktivite paternleri26,27 ve larva lokomotifi 28'de rol oynarlar. Kininler, sivrisinek A. aegypti29,30,31'de hindgut kontraksiyonunu, diürezi ve beslenmeyi düzenler. Kinin peptitleri, biyolojik aktivite için gerekli minimum sekans olan korunmuş bir C-terminal pentapeptid Phe-X1-X2-Trp-Gly-NH2'ye sahiptir32. Eklembacaklı özgüllüğü, endojen ligandın küçük boyutu, onları küçük moleküllü girişime uygun hale getirir ve böceklerdeki pleiotropik fonksiyonlar, kinin reseptörünü haşere kontrolü için umut verici bir hedef haline getirir4.
"Çift eklemeli" tahlil (Şekil 2), aynı HTS tahlili15'teki agonistlerin veya antagonistlerin tanımlanmasına izin verir. İlaç endüstrisinde ilaç keşfi için yaygın olarak kullanılan "çift eklemeli" bir tahlilden uyarlanmıştır33. Kısacası, ilaçların hücre plakasına ilk eklenmesi, çözücü kontrolünün uygulanmasına kıyasla daha yüksek bir floresan sinyali tespit edildiğinde kimyasal kütüphanedeki potansiyel agonistlerin tanımlanmasına izin verir. Bu küçük moleküllerle 5 dakikalık inkübasyondan sonra, tüm kuyucuklara bilinen bir agonist (kinin peptidi) uygulanır. İlaç plakasından rastgele bir antagonist alan kuyucuklar, ilk eklemede çözücüyü alan kontrol kuyularına kıyasla agonist ilavesi üzerine daha düşük bir floresan sinyali gösterir. Bu tahlil daha sonra aynı hücrelere sahip potansiyel agonistlerin ve antagonistlerin tanımlanmasına izin verir. Standart bir HTS projesinde, bu isabet molekülleri, doz-yanıt testleri ve burada gösterilmeyen ek biyolojik aktivite testleri ile daha da doğrulanacaktır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64505/64505fig01.jpg"> Şekil 1: Kalsiyum floresan tahlil mekanizmasının gösterimi. Gq proteini hücre içi kalsiyum sinyal yolunu tetikler. Kinin reseptörü (G proteinine bağlı reseptör) CHO-K1 hücrelerinde rekombinant olarak eksprese edildi. Agonist ligand reseptöre bağlandığında, kinin reseptörü ile ilişkili Gq proteini, bir PIP2 molekülünün IP3 ve DAG'ye dönüşümünü katalize eden PLC'yi aktive eder. IP 3 daha sonra endoplazmik retikulumun yüzeyindeki IP3R'ye bağlanır ve Ca 2 + iyonlarının floroforlara bağlandığı ve bir floresan sinyali ortaya çıkardığı sitoplazmaya Ca2 + 'nın salınmasına yol açar. Floresan sinyali, 490 nm'de uyarma ile elde edilebilir ve 514 nm'de tespit edilebilir. Kısaltmalar: GPCR = G proteinine bağlı reseptör; PLC = fosfolipaz C; PIP2 = fosfatidilinositol 4,5-bisfosfat; IP3 = inositol trisfosfat; DAG = diasilgliserol; IP3 R = IP3 reseptörü. BioRender.com ile oluşturuldu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64505/64505fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64505/64505fig02.jpg"> Şekil 2: CHO-K1 hücrelerinde eksprese edilen G proteinine bağlı bir reseptör üzerindeki küçük moleküllerin yüksek verimli taranması için iş akışı. (A) Kinin reseptörünü kararlı bir şekilde eksprese eden rekombinant CHO-K1 hücreleri, bir sıvı taşıma sistemi (25 μL / kuyu) kullanılarak 384 delikli plakaya (10.000 hücre / kuyu) eklendi ve nemlendirilmiş bir CO2 inkübatöründe 12-16 saat boyunca inkübe edildi (B ) Floresan boyayı (25 μL/kuyu) içeren tahlil tamponu, sıvı taşıma sistemi kullanılarak hücre plakasına eklenmiştir. Plaka, 30 dakika boyunca 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edildi ve RT'de 30 dakika daha dengelendi. (C) Her bir kuyucuktaki hücrelerin arka plan floresan sinyali bir plaka okuyucu ile ölçüldü. (D) 384 delikli bir kütüphane plakasından ve boş çözücüden (hepsi 0,5 μL / kuyuda) ilaç çözeltileri, bir sıvı işleme sistemi kullanılarak hücresel tahlil plakasına eklendi. (E) Hücresel kalsiyum floresan yanıtları, ilaç çözeltilerinin eklenmesinden hemen sonra plaka okuyucu ile ölçülmüştür; ortalamadan daha yüksek floresan sinyalleri ortaya çıkaran bileşik (ler) agonist hit (ler) olarak seçildi. GPCR'yi bloke eden antagonist vuruşları (aşağıdaki simge), G adımı sırasında peptid agonistinin eklenmesinden sonra ortaya çıkmıştır. (F) Aynı tahlil plakasında, hücrelerin tarama bileşikleri ile 5 dakikalık inkübasyonundan sonra, kene kinin reseptörünün endojen agonist peptidi Rhimi-K-1 (QFSPWGamide) her bir oyuğa (1 μM) eklenmiştir. (G) Agonist peptid ilavesinden sonra hücresel floresan yanıtları hemen plaka okuyucu tarafından ölçüldü. Floresan sinyalini inhibe eden bileşik (ler) antagonist hit (ler) olarak seçildi. Kısaltmalar: GPCR = G proteinine bağlı reseptör; RT = oda sıcaklığı; RFU = bağıl floresan birimleri. BioRender.com ile oluşturuldu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64505/64505fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>15050-065</td>
			<td>with phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% trypan blue</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td>liquid, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM12400</td>
			<td>RNase-free Microfuge Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-045</td>
			<td>Corning Costar Stripette individually wrapped&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-047</td>
			<td>Corning Costar Stripette individually wrapped&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L filter tips</td>
			<td>USA Scientifc Inc.</td>
			<td>P1121</td>
			<td>sterile, barrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-049</td>
			<td>Corning Costar Stripette individually wrapped&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>graduated, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL auto-friendly reservior</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>6317</td>
			<td>sterile, individually wrapped for cell seeding in day 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL auto-friendly reservior</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>6318</td>
			<td>sterile, stacked, for loading dye in day 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384/ 12.5 &#181;L low retention tips</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>6405</td>
			<td>long, sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384/ 12.5 &#181;L tips</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>6404</td>
			<td>long, sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781091</td>
			<td>CELLSTAR, clear polystyrene, &#181;Clear, Black/Flat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum plate seals</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>PCR-AS-200</td>
			<td>polyester-based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil wrap</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafty cabinet II</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-540-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>AutoT4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell counting slides</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>SD-100</td>
			<td>20 &#181;L chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 humidified incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Forma Series II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desk Lamp</td>
			<td>SunvaleeyTEK</td>
			<td>RS1000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>276855</td>
			<td>anhydous, &#62;99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>DPBS, 1x without calcium amd magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12K Nutrient Mixture&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-354</td>
			<td>(Kaighn&#39;s Mod.) with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>SFBU30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent calcium assay kit</td>
			<td>ENZO Lifescience</td>
			<td>ENZ-51017</td>
			<td>10x96 tests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 sulfate</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>10131-027</td>
			<td>Geneticin selective antibiotic 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s buffer</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>55037C</td>
			<td>HBSS modified, with calcium, with magnesium, without phenol read</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>1 Molar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTS data storage plateform</td>
			<td>CDD vault&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://www.collaborativedrug.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid handling system</td>
			<td>Integra Bioscience</td>
			<td>Viaflo</td>
			<td>384/12.5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Sorvall ST8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BMG technology</td>
			<td>Clariostar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhimi-K-1 agonist peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>custom order</td>
			<td>QFSPWGamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a "dual-addition" calcium fluorescence assay for the high-throughput screening of recombinant g protein-coupled receptors

G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler), reseptörlerin en büyük süper ailesini temsil eder ve çok sayıda insan ilacının hedefidir. GPCR'lere karşı rastgele küçük molekül kütüphanelerinin yüksek verimli taraması (HTS), ilaç endüstrisi tarafından hedefe özgü ilaç keşfi için kullanılır. Bu çalışmada, omurgasız-spesifik nöropeptit GPCR'lerin yeni küçük moleküllü ligandlarını, ölümcül insan ve veteriner patojenlerinin vektörlerinin fizyolojik çalışmaları için problar olarak tanımlamak için bir HTS kullanılmıştır.
Omurgasızlara özgü kinin reseptörü hedef olarak seçildi çünkü omurgasızlarda diürez, beslenme ve sindirim dahil olmak üzere birçok önemli fizyolojik süreci düzenliyor. Ayrıca, birçok omurgasız GPCR'nin farmakolojisi zayıf bir şekilde karakterize edilir veya hiç karakterize edilmez; bu nedenle, bu reseptör gruplarının diğer metazoanlardaki, özellikle de insanlardaki ilgili GPCR'lere göre diferansiyel farmakolojisi, GPCR'lerin bir süper aile olarak yapı-aktivite ilişkilerine bilgi katmaktadır. Sığır ateşi kenesinden kinin reseptörünün ligandlarının veya güney sığır kenesi Rhipicephalus microplus'tan keşfedilmesi için 384 kuyucuklu plakalardaki hücreler için bir HTS testi geliştirilmiştir. Kene kinin reseptörü CHO-K1 hücrelerinde kararlı bir şekilde eksprese edildi.
Kinin reseptörü, endojen kinin nöropeptitleri veya diğer küçük molekül agonistleri tarafından aktive edildiğinde, kalsiyum depolarından sitoplazmaya Ca2 + salınımını tetikler. Bu kalsiyum floresan testi, "çift eklemeli" bir yaklaşımla birleştirildiğinde, aynı tahlil plakasındaki fonksiyonel agonist ve antagonist "hit" moleküllerini tespit edebilir. Her tahlil, 320 rastgele küçük molekülden oluşan bir dizi taşıyan ilaç plakaları kullanılarak gerçekleştirildi. 0.7'lik güvenilir bir Z 'faktörü elde edildi ve HTS 2 μM nihai konsantrasyondayken üç agonist ve iki antagonist isabet molekülü tanımlandı. Burada bildirilen kalsiyum floresan testi, Ca2+ sinyal kaskadını aktive eden diğer GPCR'leri taramak için uyarlanabilir.

Bu HTS tahlilini örnek olarak göstermek için 320 rastgele küçük molekülden oluşan bir kurum içi ilaç plakası (SAC2-34-6170) kullanılmıştır. HTS, 0.7 Z' faktörü ile mükemmel tahlil kalitesine sahipti (Tablo 1). Bu Z' faktörü, test edilen bileşiklerden bağımsız olarak tahlil kalitesini yansıtır34. 0,5 veya daha yüksek bir Z′ faktörü, pozitif kontrollerin RFU'ları ile negatif kontroller arasında iyi bir tahlil sinyali dinamik ara...

Watch this Scientific Journal Video about A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors at JoVE.com

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Bu çalışmada, rekombinant G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) üzerindeki küçük molekül kütüphanelerini taramak için 384 kuyucuklu plakalar için yüksek verimli, hücre içi kalsiyum floresan testi açıklanmaktadır. Hedef, sığır ateşi kenesinden kinin reseptörü, Rhipicephalus microplus, CHO-K1 hücrelerinde eksprese edilir. Bu tahlil, aynı hücreleri tek bir "çift eklemeli" tahlilde kullanarak agonistleri ve antagonistleri tanımlar.

Rekombinant G Proteinine Bağlı Reseptörlerin Yüksek Verimli Taraması için "Çift İlaveli" Bir Kalsiyum Floresan Testi

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

Yüksek Verimli tarama kalsiyum floresan çift ilaveli test, hücre içi kalsiyum kaskad yoluyla sinyal veren bir G proteinine bağlı reseptörün yeni küçük molekül ligandlarının tanımlanmasına izin verir. İkili toplama testinin temel avantajı, floresan sinyalinin iki dakika sürmesi koşuluyla aynı hücrelerle tek bir tahlilde agonist ve antagonist HTS'nin saptanmasıdır. Bu yöntem, eklembacaklı nöron peptid ailesinin, bir GPCR'nin çoğunu içeren kalsiyum kaskad yoluyla sinyal veren herhangi bir GPCR'ye uygulanabilir.Tahlil tekrarlanabilirliği için, ikinci baskı için bilinen agonistin hücre yoğunluğunu, enjeksiyon hızını ve konsantrasyonunu optimize etmek önemlidir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımda doktora sonrası araştırma görevlisi olan Bianca Henriques-Santos olacak. Kalsiyum floresan tahliline, harcanan ortamı% 70 ila% 90 oranında akıcı BMLK üç hücre içeren T-75 şişesinden çıkararak başlayın.Hücreleri 10 mililitre Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini veya DPBS ile yıkayın. DPBS'yi çıkardıktan sonra, iki mililitre% 0.25 tripsin etilendiamintetraasetik asit veya EDTA kullanarak hücreleri ayırın ve 37 santigrat derecede üç ila beş dakika kuluçkaya yatırın. Sekiz mililitre seçici ortam ekleyin ve hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın.Hücre süspansiyonunu üç dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj etmeden önce. Süpernatantı atın ve hücre peletini% 1 fetal sığır serumu veya FBS ve mililitre G418 sülfat başına 400 mikrogram içeren 10 mililitre F-12K ortamında yeniden askıya alın. Daha fazla seyreltme için süspansiyonun hücre yoğunluğunu belirlemek için, 20 mikrolitre hücre süspansiyonunu 20 mikrolitre% 0.4 tripan mavisine karıştırın ve ardından 20 mikrolitre karışımı, hücre yoğunluğu için bir hücre sayacı tarafından okunmak üzere bir hücre sayma odasına yükleyin.Aynı F-12K ortamını kullanarak hücre süspansiyonunu seyreltin ve mililitre başına dört kat 10 ila beşinci hücre yoğunluğunda 15 mililitreye kadar son hacmi oluşturun. Poly-D lizin veya PDL kodlu 384 kuyu plakasındaki hücreleri tohumlamak. Bir sıvı taşıma sistemi kullanarak plakanın 384 kuyucuğuna 25 mikrolitre seyreltilmiş hücre süspansiyonu ekleyin.Plakayı nemlendirilmiş inkübatörde gece boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Ertesi gün,% 90 akıcı 384 kuyu plakasını hızla tersine çevirin. Harcanan ortamı çıkarmak ve steril kağıt havlular üzerine hafifçe lekelenmek için tüm sıvıyı plakadan çıkarmak için iki ila üç kez.Sonraki adımları biyogüvenlik kabininin içindeki yumuşak loş ışıkta gerçekleştirin. Daha sonra, saniyede 3,8 mikrolitre aspirasyon ve dağıtım hızı ile her bir kuyucuğa 12,5 mikrolitre dağıtarak bir sıvı taşıma sistemi kullanarak her bir kuyucuğa 25 mikrolitre yükleme boyası ekleyin. Her bir kuyucukta 25 mikrolitrelik son hacme ulaşmak için bu pipetleme adımını tekrarlayın.Bir kez bittiğinde, ortam ışığından korumak için plakayı alüminyum folyo ile örtün ve karbondioksit nemlendirilmiş inkübatörde 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kapalı plakayı 30 dakika daha dengeledikten sonra, hücreler yüksek verimli tarama veya HTS için hazırdır. Daha sonra, ilaç plakasını bir dakika boyunca bir plaka santrifüjünde 1200 x g'de santrifüj edin.Rhimi-K-1'in 10x agonist peptid çözeltisini 150 mililitrelik otomatik dostu bir rezervuara aktarın. Plaka okuyucuda, protokolleri yönet'i tıklayın. Ardından uç nokta floresan yoğunluğu protokolünde, Flow Forte önceden okuma'yı seçin, HTS testinin tamamı için arka plan sinyalini ölçmek üzere ölçümü başlat'a tıklayın.Hücre plakasını plaka okuyucuya yerleştirin. Gösterge panelinde, plakadaki rastgele bir kuyuya ve ardından yeni odak yüksekliğine tıklayın. Odak ayarına tıklayın.Kazanç ayarlamasına tıklayın. Maksimum ölçülebilir floresan değerinin% 5 ila% 10'u olarak atayın. Ayarlamayı başlat'ı tıklayın.Göreceli floresan birimleri veya RFU'daki arka plan floresan sinyalinin tüm plakasını okumak için ölçümü başlat'ı tıklatın. Plaka okurken, gerçek zamanlı okuma değerini görmek için geçerli durumu tıklayın. Çift ilaveli tahlil için, sıvı taşıma sistemini kullanarak ilaç çözeltisinin 10 mikrolitresini üç kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve ilaç plakasının her bir kuyucuğundan saniyede 1.0 mikrolitre aspirasyon hızında 1.5 mikrolitre aspire edin.% 0.2 dimetil sülfoksit veya DMSO'da iki mikromolar'ın nihai konsantrasyonuna ulaşmak için bileşiklerin 0.5 mikrolitresini hücre tahliline dağıtın. Eleme bileşiklerini ekledikten sonra, tahlil plakasını hemen plaka okuyucusuna yerleştirin. Önceden ayarlanmış okuma programına tıklayın ve plakayı ileri ve geri okuma yönlerinde okuyun.Uçlarda kalan bir mikrolitre ilaç çözeltisini, uçları yaklaşık 50 mililitre DPBS içeren 150 mililitrelik bir atık rezervuarına batırarak atın. Tarama bileşiklerini, ışıklar kapalıyken biyogüvenlik kabinindeki plaka okuyucunun içindeki süre de dahil olmak üzere toplam beş dakika boyunca hücrelerle birlikte inkübe edin. Daha sonra, 384 12.5 mikrolitre uç kullanarak sıvı taşıma sistemini kullanarak rezervuardan üç mikrolitre agonist peptid Rhimi-K-1'i tahlil plakasına ekleyin.Plakayı hemen plaka okuyucuya yerleştirin. Önceden ayarlanmış okuma programına tıklayın ve plakayı ileri ve geri okuma yönlerinde okuyun. Bir kez yapıldıktan sonra, her plaka testinin kalite kontrolü için Z'faktörünü manuel olarak hesaplayın.Çevrimiçi HTS veri platformundaki ısı haritalarından isabet moleküllerini manuel olarak seçin ve agonist isabetleri ve antagonist isabetleri için normalleştirilmiş yüzde aktivasyonunu veya NPA ve inhibitör aktiviteyi veya I0'ı hesaplayın. Bu HTS testini göstermek için 320 rastgele küçük molekülden oluşan bir ilaç plakası SAC2-34-6170 kullanıldı. HTS, test edilen bileşiklerden bağımsız olarak tahlil kalitesinin olduğunu yansıtan 0.7'lik bir Z'faktörü ile mükemmel bir tahlil kalitesine sahipti.Agonisti ekledikten hemen sonra plakayı okumak önemlidir, çünkü floresan sinyali kısa ömürlüdür. Bu işlemden sonra, tanımlanan isabet molekülü, doz yanıtı testleri ile doğrulanmalı ve hedef dışı vuruşları dışlamak için hedef GPCR'yi ifade etmeyen hücrelerde test edilmelidir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Yeni çözünmez Kromojenik altyapı deneyiyle kitleri kullanılarak karbonhidrat parçalayıcı Enzimlerin yüksek verimli tarama

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Yöntem HCN1 ve TRIP8b arasında protein-protein etkileşimi küçük molekül önleyicilerinin tespit edilmesi için

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Radyo-etiketli GTP Bağlanması vasıtasıyla G-protein ile birleşmiş Reseptör Sinyalizasyonunun Ölçümü

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Tek-ciro proteaz PCSK9 proteolizis değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek Luciferase tahlil

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Küçük Molekül Inhibitörlerinin Taranması için NADH-Coupled ATPase Tsay'ın Yarı-Yüksek İş-İşLenme Adaptasyonu

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Fotonik Çip Kullanarak Yüksek İşLeç Toplam İç Yansıma Floresansı ve Direkt Stokastik Optik Rekonstrüksiyon Mikroskobu

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Tam İşlenmiş Rekombinant KRAS4b: Farnesile ve Metillenmiş Proteini Yalıtma ve Karakterize Etme

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Başarılı Kristalizasyon Için Görsel GPCR-mini-G Protein Sinyal Kompleksi Stratejik Tarama ve Karakterizasyonu

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Enzim Karakterizasyonundan Yüksek Verimli Taramaya Kadar Apolipoprotein N-asiltransferaz için Click-Kimya Tabanlı Florometrik Analiz

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...