Name: generation of retinal organoids from healthy and retinal disease-specific human-induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2022-12-09T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Retinal Organoids from Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

De auteurs erkennen de wetenschappelijke en technische ondersteuning van Dr. Chitra Kannabiran, geneticus; Dr. Subhadra Jalali, retinale consultant; Dr. Milind Naik, Oculoplastisch Chirurg; en Dr. Swathi Kaliki, oculaire oncoloog aan het LV Prasad Eye Institute, Hyderabad naar het genereren van normale en patiëntspecifieke iPSC-lijnen. De auteurs erkennen de R&D-subsidies van de Science and Engineering Research Board, Department of Science and Technology (IM), (SB/SO/HS/177/2013), Department of Biotechnology (IM), (BT/PR32404/MED/30/2136/2019) en Senior Research Fellowships van ICMR (S.M., D.P.), UGC (T.A.) en CSIR (V.K.P.), Government of India.

Alle experimenten met hiPSC's werden aseptisch uitgevoerd, in overeenstemming met de standaard laboratoriumpraktijken, ethische en bioveiligheidsrichtlijnen en met de goedkeuring van regelgevende instanties zoals de Institutional Ethics Committee (IEC), Institutional Committee for Stem Cell Research (IC-SCR) en Institutional Bio-Safety Committee (IBSC).
1. Bereiding van iPSC-cultuur en retinale differentiatiemedium en reagentia
<ol><li>iPSC kweek- en onderhoudsmedium<ol><li>...

<ol>
	<li>Dandona, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+visual+impairment+in+India:+the+Andhra+Pradesh+Eye+Disease+Study.">Moderate visual impairment in India: the Andhra Pradesh Eye Disease Study.</a> British Journal of Ophthalmology. 86 (4), 373-377 (2002).</li><li>Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinitis+pigmentosa.">Retinitis pigmentosa.</a> Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).</li><li>Sen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+retinitis+pigmentosa+in+South+Indian+population+aged+above+40+years.">Prevalence of retinitis pigmentosa in South Indian population aged above 40 years.</a> Ophthalmic Epidemiology. 15 (4), 279-281 (2008).</li><li>Nazimul, H., Rohit, K., Anjli, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trend+of+retinal+diseases+in+developing+countries.">Trend of retinal diseases in developing countries.</a> Expert Review of Ophthalmology. 3 (1), 43-50 (2008).</li><li>. RetNet - Retinal Information Network Available from: <a target="_blank" href="https://sph.uth.edu/retnet/">https://sph.uth.edu/retnet/</a> (2022)</li><li>Cicero, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+previously+identified+as+retinal+stem+cells+are+pigmented+ciliary+epithelial+cells.">Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (16), 6685-6690 (2009).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+retinitis+pigmentosa:+retinal+organoids+generated+from+the+iPSCs+of+a+patient+with+the+USH2A+mutation+show+early+developmental+abnormalities.">Modeling retinitis pigmentosa: retinal organoids generated from the iPSCs of a patient with the USH2A mutation show early developmental abnormalities.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 361 (2019).</li><li>Lane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+and+rescue+of+RP2+Retinitis+pigmentosa+using+iPSC-derived+retinal+organoids.">Modeling and rescue of RP2 Retinitis pigmentosa using iPSC-derived retinal organoids.</a> Stem Cell Reports. 15 (1), 67-79 (2020).</li><li>Li, Y. P., Deng, W. L., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+retinitis+pigmentosa+through+patient-derived+retinal+organoids.">Modeling retinitis pigmentosa through patient-derived retinal organoids.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100438 (2021).</li><li>Gonzalez-Cordero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+human+retinal+development+from+human+pluripotent+stem+cells+generates+transplantable+populations+of+cone+photoreceptors.">Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors.</a> Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).</li><li>Meyer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+vesicle-like+structures+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+facilitate+a+customized+approach+to+retinal+disease+treatment.">Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment.</a> Stem Cells. 29 (8), 1206-1218 (2011).</li><li>Zhu, J., Lamba, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-based+retinal+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Small molecule-based retinal differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells.</a> Bio-Protocol. 8 (12), 2882 (2018).</li><li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs.">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium.">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs.">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communications. 5, 4047 (2014).</li><li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3D+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells.">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 766 (2017).</li><li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines.">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Chichagova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+retinal+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Differentiation of retinal organoids from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 95 (2019).</li><li>Kelley, R. A., Chen, H. Y., Swaroop, A., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+development+of+rod+photoreceptors+in+retinal+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+by+supplementation+with+9-cis+retinal.">Accelerated development of rod photoreceptors in retinal organoids derived from human pluripotent stem cells by supplementation with 9-cis retinal.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100033 (2020).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+cone+photoreceptors+through+simultaneous+inhibition+of+BMP,+TGFbeta+and+Wnt+signaling.">Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling.</a> Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li><li>Mellough, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-1+signaling+plays+an+important+role+in+the+formation+of+three-dimensional+laminated+neural+retina+and+other+ocular+structures+from+human+embryonic+stem+cells.">IGF-1 signaling plays an important role in the formation of three-dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 33 (8), 2416-2430 (2015).</li><li>Susaimanickam, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+minicorneal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).</li></ol>

hiPSC's zijn een krachtig hulpmiddel om orgaan- en weefselontwikkeling in vitro te bestuderen. Het samenvatten van het fenotype van de ziekte door gezonde versus ziektespecifieke hiPSC's te differentiëren in de richting van de retinale afstamming kan helpen bij het verkrijgen van nieuwere inzichten in de pathofysiologie van verschillende vormen van erfelijke retinale dystrofieën. Verschillende protocollen zijn beschreven en aangenomen voor de in vitro differentiatie van PSC's in retinale celtypen. De ...

Het netvlies is een lichtgevoelig weefsel aan de achterkant van het gewervelde oog dat lichtsignalen omzet in zenuwimpulsen door een biochemisch fenomeen dat bekend staat als de fototransductieroute. De initiële zenuwimpulsen die in de fotoreceptorcellen van het netvlies worden gegenereerd, worden getransduceerd naar andere retinale interneuronen en retinale ganglioncellen (RGC's) en bereiken de visuele cortex van de hersenen, wat helpt bij beeldperceptie en visuele respons.
Volgens de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) zijn naar schatting 1,5 miljoen kinderen blind, waarvan 1 miljoen in Azië. Erfelijke retinale dystrofie (IRD) is een belangrijke blinderende ziekte die 1 op de 4.000 personen wereldwijd treft 1,2,3, terwijl de prevalentie van blindheid geassocieerd met leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) varieert van 0,6% -1,1% in ontwikkelingslanden 4. IRD's worden veroorzaakt door erfelijke genetische defecten in meer dan 300 verschillende genen die betrokken zijn bij de ontwikkeling en functie van het netvlies5. Dergelijke genetische veranderingen resulteren in de verstoring van normale retinale functies en geleidelijke degeneratie van retinale cellen, namelijk de fotoreceptorcellen en het retinale gepigmenteerde epitheel (RPE), wat leidt tot ernstig verlies van het gezichtsvermogen en blindheid. Er is enorme vooruitgang geboekt in andere verblindende aandoeningen met betrekking tot het hoornvlies, de lens, enz. Retinale dystrofieën en oogzenuwatrofieën hebben tot op heden echter geen bewezen therapie. Aangezien een volwassen menselijk netvlies geen stamcellenheeft 6, kunnen alternatieve bronnen zoals embryonale stamcellen (SER's) en patiënt-afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) een onbeperkte voorraad van gewenste celtypen bieden en een grote belofte inhouden voor het ontwikkelen van complexe weefselorganoïden die nodig zijn voor in vitro ziektemodelleringsstudies en voor het ontwikkelen van regeneratieve therapieën7, 8,9,10.
Enkele jaren van netvliesonderzoek hebben geleid tot een beter begrip van moleculaire gebeurtenissen die de vroege retinale ontwikkeling orkestreren. De meeste protocollen om retinale cellen en 3D-organoïden uit PSC's te genereren, hebben tot doel deze ontwikkelingsgebeurtenissen in vitro samen te vatten, door de cellen te kweken in een complexe cocktail van groeifactoren en kleine moleculen om de bekende biologische processen stapsgewijs te moduleren. De aldus gegenereerde retinale organoïden bestaan uit belangrijke retinale cellen: retinale ganglioncellen (RGC's), interneuronen, fotoreceptoren en retinaal gepigmenteerd epitheel (RPE)11,12,13,14,15,16,17,18,19. Ondanks succesvolle pogingen om IRD's te modelleren met behulp van retinale organoïden, vormt de behoefte aan de complexe cocktail van groeifactoren en kleine moleculen tijdens differentiatie en de relatief lage efficiëntie van retinale organoïde generatie een grote uitdaging bij de meeste protocollen. Ze omvatten voornamelijk de vorming van embryoïde lichamen, gevolgd door hun stapsgewijze differentiatie in retinale afstammingslijnen met behulp van complexe kweekomstandigheden in verschillende stadia van in vitro ontwikkeling20,21,22.
Hier wordt een vereenvoudigde en robuuste methode gerapporteerd voor het ontwikkelen van complexe 3D neuro-retinale organoïden uit gezonde controle en retinale ziekte-specifieke hiPSC's. Het hier beschreven protocol maakt gebruik van directe differentiatie van bijna-confluente hiPSC-culturen zonder dat embryoïde lichaamsvorming nodig is. Ook is de complexiteit van het kweekmedium vereenvoudigd, waardoor het een kosteneffectieve en reproduceerbare techniek is die gemakkelijk door nieuwe onderzoekers kan worden overgenomen. Het gaat om een hybride kweeksysteem bestaande uit aanhangende monolaagculturen gedurende de eerste 4 weken van retinale differentiatie tot het ontstaan van verschillende, zelfgeorganiseerde oogveld primordiale clusters (EFP's). Verder worden de cirkelvormige neuro-retinale eilanden binnen elke EFP handmatig geplukt en gekweekt in suspensieculturen gedurende 1-2 weken om meerlagige 3D-retinale cups of organoïden te bereiden die bestaan uit PAX6 + en CHX10 + prolifererende neuro-retinale voorlopers. Uitgebreide kweek van retinale organoïden in 100 μM Taurine-bevattend medium gedurende nog eens 4 weken resulteerde in de opkomst van RCVRN + en CRX + fotoreceptorvoorlopers en volwassen cellen met rudimentaire binnenste segmentachtige extensies.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Syringe filters</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99722&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>TPP</td>
			<td>91015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>TPP</td>
			<td>91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC365519</td>
			<td>1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab140603</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3201</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5585</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50x), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fibroblast growth factor (bFGF)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F0291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar (50 mL)</td>
			<td>Tarson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoTubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>V7884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EP0709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 medium kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1517001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal&#160;Bovine&#160;Serum, qualified, United States&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelDocXR+ with Image lab software</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>Agarose Gel documentation system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11030</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11035</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoCore MULTICUT</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>For sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Acsorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A92902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>To quantify RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>23995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7095D-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab183951</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab195045</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab231782</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Noggin Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6057-NG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 10 mL</td>
			<td>TPP</td>
			<td>94010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 5 mL</td>
			<td>TPP</td>
			<td>94005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate Tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starfrost (silane coated) microscopic slides</td>
			<td>Knittel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>18080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol&#160;Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI&#160;</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1200&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A27940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of retinal organoids from healthy and retinal disease-specific human-induced pluripotent stem cells

Pluripotente stamcellen kunnen complexe weefselorganoïden genereren die nuttig zijn voor in vitro ziektemodelleringsstudies en voor het ontwikkelen van regeneratieve therapieën. Dit protocol beschrijft een eenvoudigere, robuuste en stapsgewijze methode voor het genereren van retinale organoïden in een hybride kweeksysteem bestaande uit adherente monolaagculturen gedurende de eerste 4 weken van retinale differentiatie tot het ontstaan van verschillende, zelfgeorganiseerde oogveld primordiale clusters (EFP's). Verder worden de donutvormige, cirkelvormige en doorschijnende neuro-retinale eilanden binnen elke EFP handmatig geplukt en gekweekt onder suspensie met behulp van niet-hechtende kweekschalen in een retinale differentiatiemedium gedurende 1-2 weken om meerlagige 3D-optische cups (OC-1M) te genereren. Deze onrijpe retinale organoïden bevatten PAX6+ en ChX10+ prolifererende, multipotente retinale voorlopers. De voorlopercellen zijn lineair zelf geassembleerd binnen de organoïden en verschijnen als verschillende radiale strepen. Na 4 weken na suspensiecultuur ondergaan de retinale voorlopers post-mitotische arrestatie en afstammingsdifferentiatie om volwassen retinale organoïden (OC-2M) te vormen. De fotoreceptorlijn gebonden voorlopers ontwikkelen zich binnen de buitenste lagen van retinale organoïden. Deze CRX+ en RCVRN+ fotoreceptorcellen rijpen morfologisch om binnenste segmentachtige extensies weer te geven. Deze methode kan worden toegepast voor het genereren van retinale organoïden met behulp van menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Alle stappen en procedures worden duidelijk uitgelegd en gedemonstreerd om repliceerbaarheid te garanderen en voor bredere toepassingen in fundamentele wetenschap en translationeel onderzoek.

Differentiatie van hiPSC's in ooglijnen wordt bereikt door de cellen te kweken in verschillende cocktails van kweekmedium met supplementen en groeifactoren in opeenvolgende stappen op verschillende tijdstippen, zoals beschreven in figuur 1. De hiPSC-culturen worden onderhouden in Essential 8-medium, het pluripotente stamcelonderhoudsmedium. Zodra ze 70% -80% confluentie bereiken (figuur 2A), wordt het medium op dag 0 vervangen door differentiatie-inductiemedium ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Retinal Organoids from Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of Retinal Organoids from Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor het differentiëren van hiPSC's in oogveldclusters en het genereren van neuro-retinale organoïden met behulp van vereenvoudigde kweekomstandigheden waarbij zowel adherente als suspensiecultuursystemen betrokken zijn. Andere oculaire celtypen, zoals de RPE en het hoornvliesepitheel, kunnen ook worden geïsoleerd uit volwassen oogvelden in retinale culturen.

Generatie van retinale organoïden uit gezonde en retinale ziekte-specifieke door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative ...

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en efficiënte methode om menselijke IPC's te differentiëren in complexe driedimensionale neuro-retinale organoïden voor onderzoek en regeneratieve toepassingen. Deze techniek omvat zowel adherente als suspensieculturen, waardoor selectief plukken en verrijken van zowel retinale organoïden als RP-cellen mogelijk is. Het kan een levensvatbare en regelmatige toevoer van celbronnen bieden voor het ontwikkelen van celgebaseerde therapieën voor retinale degeneratieve ziekten.Dergelijke van stamcellen afgeleide retinale organoïden en RPE-cellen zijn nuttig als in vitro modellen om oogontwikkeling en erfelijke netvliesaandoeningen te bestuderen. Deze methode kan gemakkelijk worden gerepliceerd door onderzoekslaboratoria die al bekend zijn met het omgaan met menselijke IPSC-culturen. Visuele demonstratie ondersteunt de identificatie van oogvelden en de isolatie van neuro-retinale cups op basis van hun ruimtelijke positionering en morfologische kenmerken.Om te beginnen, zuig het gebruikte medium van 70 tot 80% confluente menselijke IPSC-culturen in zesputplaten. Voeg PBS toe aan de putjes, draai ze rond en zuig de wasbuffer eruit. Voeg vervolgens een milliliter celdissociatieoplossing of CDS toe aan elke put en incuber de plaat bij 37 graden Celsius gedurende vijf tot zeven minuten totdat de cellen zijn afgerond.Zuig de CDS op en verzamel de celsuspensie in een centrifugebuis van 15 milliliter. Draai de buis op 1.000 RPM gedurende vier minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en resuspensie de celpellet in 1,2 milliliter Essential 8-medium.Doseer 200 microliter van de celsuspensie in elke put van een matrix-gecoate zesputplaat met 1,5 milliliter IPSC-kweekmedium en 10 micromolair Y27632. Verwijder na 12 tot 24 uur het gebruikte medium en voeg voorverwarmd volledig ascensiemedium toe zonder Y27632 om de culturen te behouden. Verander het kweekmedium elke 24 uur totdat de culturen 70 tot 80% samenvloeiing bereiken.Zuig op dag nul het menselijke IPSC-onderhoudsmedium uit en voeg differentiatie-inductiemedium met één nanogram per milliliter BFGF en één nanogram per milliliter Noggin toe aan de zesputplaat. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in een 5% kooldioxide-incubator. Zuig op de eerste dag het gebruikte medium uit en voeg differentiatie-inductiemedium toe dat één nanogram per milliliter BFGF en 10 nanogram per milliliter Noggin bevat.Incubeer de cellen opnieuw bij 37 graden Celsius in een 5% kooldioxide-incubator. Verwijder op dag twee en drie het gebruikte medium en voeg differentiatie-inductiemedium toe dat 10 nanogram per milliliter Noggin bevat. Na het toevoegen van twee milliliter per putmedium aan een plaat met zes putten, incubeer je de cellen bij 37 graden Celsius in een 5% koolstofdioxide-incubator en verander je het medium elke 24 uur.Verwijder op dag vier het gebruikte medium en voeg het retinale differentiatiemedium of RDM toe. Volg dezelfde procedure om twee milliliter per putmedium toe te voegen aan een plaat met zes putten en de culturen te incuberen. Verander het medium elke dag.Observeer rond dag 14 en 18 de culturen onder een microscoop met een vergroting van 10x voor het ontstaan van neurale rozetachtige domeinen bestaande uit vroege oogveldvoorlopers. Observeer rond dag 21 en 28 de culturen onder een microscoop met een vergroting van 4x en 10x om de opkomst van zelfgeorganiseerde afzonderlijke EFP's te observeren met een centraal eiland van cirkelvormige 3D-neuroretinale structuren omringd door aaneengesloten uitlopers van neuro-epitheel en oculair oppervlakte-epitheel. Neem een steriele Pasteur-pipet en houd de basis in de ene hand en de capillaire punt in de andere.Vlam steriliseren en verwarmen het gebied in de buurt van het midden van de capillaire punt met rotatiebewegingen totdat het glas buigzaam wordt. Ga vervolgens weg van de vlam en trek de capillaire punt snel naar buiten om een fijne capillaire punt met een gesloten lumen te creëren. Houd de fijne punt horizontaal voor de vlam en laat deze snel in een naar buiten gerichte beweging door de vlam gaan om een gladde haak of een L-vormige capillaire punt te creëren.Kies onder een stereomicroscoop handmatig de goed gevormde neuro-retinale cups van de afzonderlijke EFP's met behulp van de gladde buitenste krommingszone van de capillaire haak als een fijne schep. Voeg op dag 25 en 30 vier milliliter voorverwarmd retinale differentiatiemedium in een schaal met lage hechting van 60 millimeter toe aan de cultuur en onderhoud retinale cups voor het genereren van 3D-retinale organoïden. Dit moet worden gedaan voorafgaand aan het oogsten van de neuro-retinale cups.Stel een micropipette van één millimeter in om 100 microliter op te zuigen en gebruik een milliliter microtips met brede boringsopeningen om de zwevende retinale cups op te zuigen en over te brengen in de verse laag aanhechtende kweekschalen die eerder zijn bereid. Onderhoud de retinale cups in RDM als niet-hechtende suspensieculturen en incuber ze bij 37 graden Celsius in een 5% koolstofdioxide-incubator. Verwijder op dag 30 en 45, na een gedeeltelijke voedingsmethode, de helft van het volume van het gebruikte medium en vervang het door een gelijk volume vers medium.Op dag 45 en 60, kweek de retinale organoïden nog eens twee weken in RDM met 100 micromolaire taurine om een betere overleving en afstammingsdifferentiatie van neuro-retinale voorlopers en de ontwikkeling van volwassen retinale celtypen te ondersteunen. Retinale organoïden worden gekarakteriseerd in verschillende stadia van rijping voor de expressie van verschillende retinale voorlopermarkers met behulp van RT-PCR en immunohistochemie. RT-PCR-resultaten bevestigden de inductie en expressie van neuro-retinale markers in één maand oude retinale organoïden en twee maanden oude retinale organoïden.De confocale beelden van immuno-gelabelde secties van onrijpe retinale organoïden met behulp van antilichamen tegen de neuro-retinale voorlopermarkers Chx10, PAX6 en Otx2, en rijpe retinale organoïden met behulp van antilichamen tegen de fotoreceptorvoorlopermarkers recoverin en CRX worden hier getoond. De gemarkeerde buitenste laag van de retinale organoïden met differentiërende fotoreceptorcellen worden ingezoomd en getoond in deze afbeeldingen. De rudimentaire binnenste segmentachtige uitlopers worden gemarkeerd door witte pijlen.EFP-clusters met de neuro-retinale cup in het midden en migrerende RPE-uitlopers vertonen pigmentatie langs de voorranden. Goed gedifferentieerde gepigmenteerde epitheliale uitlopers van meerdere EFP's rondom het neuro-retinale eiland worden hier getoond. Hogere vergroting van een EFP toont de migratiezone van RPE-voorlopers en oculair oppervlakte-epitheel rond een neuro-retinale cup.Uitgebreide hechtingsculturen die monolagen van onrijpe RPE-cellen ontwikkelden die zowel gepigmenteerde als niet-gepigmenteerde cellen bevatten, worden hier weergegeven. Monolaagse culturen van volledig volwassen en gepigmenteerde RPE-cellen vertonen kasseimorfologie op dag 60. RPE-cellen die PAX6, MITF en RPE65 tot expressie brengen, worden in deze afbeelding weergegeven.Deze afbeeldingen vertegenwoordigen EFP's met abnormale aggregaten van retinale voorlopers met vervormde laminatie en gebrek aan strepen. EFP met de miniatuur neuro retinale cup, maar zonder de omringende zone van RPE en oculair oppervlakte-epitheel worden in deze figuur weergegeven. Het representatieve beeld toont onregelmatige neuro-retinale aggregaten gevormd in de suspensiecultuur.Het is zeer belangrijk om het differentiatieproces te starten met behulp van bijna confluente groeiculturen van IPC's om binnen drie tot vier weken een efficiënte inductie van oogvelden te bereiken. Retinale organoïden en RPE-cellen gegenereerd uit normale en patiëntspecifieke IPC's kunnen worden gebruikt als retinale ziektemodellen en voor het testen van nieuwe therapeutische geneesmiddelen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

Efficiënte Afleiding van retinale pigment epitheel cellen uit stamcellen

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Afleiden van retinale pigment epitheel (RPE) van induced pluripotent stem (iPS) cellen door verschillende maten van embryoiden Bodies

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Generatie van Integratie-vrije mens geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van Hair-afgeleide keratinocyten

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Driedimensionale Kwantificering van Dendritische stekels van Piramidale Neuronen afgeleid van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Gedefinieerd en Scalable Generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke pluripotente stamcellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Differentiatie van chondrocyten van perifere bloed afgeleide humane geïnduceerde pluripotente stamcellen

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Snelle, gerichte differentiatie van de epitheliale cellen van de retinale Pigment van menselijke embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generatie van gestandaardiseerde en reproduceerbaar reukkolf-type cerebrale Organoids van mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Generatie van 3D huid Organoid van koord bloed afkomstige geïnduceerde pluripotente stamcellen

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In Vitro generatie van Somiet derivaten uit menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen-cellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...