Name: generation of retinal organoids from healthy and retinal disease-specific human-induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2022-12-09T13:40:00
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著者らは、遺伝学者のチトラ・カンナビラン博士からの科学的および技術的支援を認めています。スバドラ・ジャラリ博士、網膜コンサルタント;ミリンド・ナイク博士、眼球形成外科医;ハイデラバードのLVプラサド眼科研究所の眼腫瘍医であるスワティカリキ博士は、正常および患者固有のiPS細胞株の生成に向けて取り組んでいます。著者らは、科学技術省(IM)、(SB/SO/HS/177/2013)、バイオテクノロジー省(IM)、(BT/PR32404/MED/30/2136/2019)、およびインド政府のICMR(S.M.、D.P.)、UGC(T.A.)、CSIR(V.K.P.)の上級研究員からのR&D助成金を認める。

hiPS細胞を含むすべての実験は、標準的な実験室慣行、倫理的およびバイオセーフティガイドラインに準拠し、施設内倫理委員会(IEC)、幹細胞研究のための施設内委員会(IC-SCR)、および機関バイオセーフティ委員会(IBSC)などの規制機関の承認を得て、無菌的に実施されました。
1. iPS細胞培養液、網膜分化培地及び試薬の調製
<ol><li>iPS細胞培養および維持培地<o...

<ol>
	<li>Dandona, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+visual+impairment+in+India:+the+Andhra+Pradesh+Eye+Disease+Study.">Moderate visual impairment in India: the Andhra Pradesh Eye Disease Study.</a> British Journal of Ophthalmology. 86 (4), 373-377 (2002).</li><li>Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinitis+pigmentosa.">Retinitis pigmentosa.</a> Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).</li><li>Sen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+retinitis+pigmentosa+in+South+Indian+population+aged+above+40+years.">Prevalence of retinitis pigmentosa in South Indian population aged above 40 years.</a> Ophthalmic Epidemiology. 15 (4), 279-281 (2008).</li><li>Nazimul, H., Rohit, K., Anjli, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trend+of+retinal+diseases+in+developing+countries.">Trend of retinal diseases in developing countries.</a> Expert Review of Ophthalmology. 3 (1), 43-50 (2008).</li><li>. RetNet - Retinal Information Network Available from: <a target="_blank" href="https://sph.uth.edu/retnet/">https://sph.uth.edu/retnet/</a> (2022)</li><li>Cicero, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+previously+identified+as+retinal+stem+cells+are+pigmented+ciliary+epithelial+cells.">Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (16), 6685-6690 (2009).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+retinitis+pigmentosa:+retinal+organoids+generated+from+the+iPSCs+of+a+patient+with+the+USH2A+mutation+show+early+developmental+abnormalities.">Modeling retinitis pigmentosa: retinal organoids generated from the iPSCs of a patient with the USH2A mutation show early developmental abnormalities.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 361 (2019).</li><li>Lane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+and+rescue+of+RP2+Retinitis+pigmentosa+using+iPSC-derived+retinal+organoids.">Modeling and rescue of RP2 Retinitis pigmentosa using iPSC-derived retinal organoids.</a> Stem Cell Reports. 15 (1), 67-79 (2020).</li><li>Li, Y. P., Deng, W. L., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+retinitis+pigmentosa+through+patient-derived+retinal+organoids.">Modeling retinitis pigmentosa through patient-derived retinal organoids.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100438 (2021).</li><li>Gonzalez-Cordero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+human+retinal+development+from+human+pluripotent+stem+cells+generates+transplantable+populations+of+cone+photoreceptors.">Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors.</a> Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).</li><li>Meyer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+vesicle-like+structures+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+facilitate+a+customized+approach+to+retinal+disease+treatment.">Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment.</a> Stem Cells. 29 (8), 1206-1218 (2011).</li><li>Zhu, J., Lamba, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-based+retinal+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Small molecule-based retinal differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells.</a> Bio-Protocol. 8 (12), 2882 (2018).</li><li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs.">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium.">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs.">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communications. 5, 4047 (2014).</li><li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3D+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells.">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 766 (2017).</li><li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines.">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Chichagova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+retinal+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Differentiation of retinal organoids from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 95 (2019).</li><li>Kelley, R. A., Chen, H. Y., Swaroop, A., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+development+of+rod+photoreceptors+in+retinal+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+by+supplementation+with+9-cis+retinal.">Accelerated development of rod photoreceptors in retinal organoids derived from human pluripotent stem cells by supplementation with 9-cis retinal.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100033 (2020).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+cone+photoreceptors+through+simultaneous+inhibition+of+BMP,+TGFbeta+and+Wnt+signaling.">Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling.</a> Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li><li>Mellough, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-1+signaling+plays+an+important+role+in+the+formation+of+three-dimensional+laminated+neural+retina+and+other+ocular+structures+from+human+embryonic+stem+cells.">IGF-1 signaling plays an important role in the formation of three-dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 33 (8), 2416-2430 (2015).</li><li>Susaimanickam, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+minicorneal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).</li></ol>

hiPS細胞は、in vitroで臓器や組織の発達を研究するための強力なツールです。健康なhiPS細胞と疾患特異的なhiPS細胞を網膜系統に分化させることによって疾患表現型を再現することは、さまざまな形態の遺伝性網膜ジストロフィーの病態生理学に関する新しい洞察を得るのに役立ちます。PSCの網膜細胞型へのインビトロ分化のために、いくつかのプロトコルが記載され、採用され?...

網膜は脊椎動物の目の後ろに存在する光感受性組織であり、光伝達経路として知られる生化学的現象によって光信号を神経インパルスに変換します。網膜の視細胞で生成された最初の神経インパルスは、他の網膜介在ニューロンと網膜神経節細胞(RGC)に形質導入され、脳の視覚野に到達し、画像知覚と視覚反応に役立ちます。
世界保健機関(WHO)によると、推定150万人の子供が失明しており、そのうち100万人がアジアにいます。遺伝性網膜ジストロフィー(IRD)は、世界中の4,000人に1人が罹患する主要な失明性疾患ですが1,2,3、加齢黄斑変性症(AMD)に関連する失明の有病率は、発展途上国では0.6%〜1.1%の範囲です4。IRDは、網膜の発生と機能に関与する300以上の異なる遺伝子の遺伝性遺伝的欠陥によって引き起こされます5。このような遺伝的変化は、正常な網膜機能の破壊と網膜細胞、すなわち光受容体細胞と網膜色素上皮(RPE)の段階的な変性をもたらし、したがって重度の視力喪失と失明につながります。角膜、水晶体などを含む他の失明状態では大きな進歩が見られました。しかし、網膜ジストロフィーと視神経萎縮症は、これまでに証明された治療法を持っていません。成人のヒト網膜には幹細胞がないため6、胚性幹細胞(ESC)や患者由来の人工多能性幹細胞(iPSC)などの代替ソースは、目的の細胞タイプを無制限に供給でき、in vitro疾患モデリング研究や再生療法の開発に必要な複雑な組織オルガノイドの開発に大きな期待を寄せています7。8,9,10。
数年の網膜研究により、初期の網膜発生を調整する分子イベントの理解が深まりました。PSCから網膜細胞と3Dオルガノイドを生成するためのほとんどのプロトコルは、成長因子と低分子の複雑なカクテルで細胞を培養して既知の生物学的プロセスを段階的に調節することにより、これらの発生イベントをin vitroで再現することを目的としています。このようにして生成された網膜オルガノイドは、主要な網膜細胞、すなわち網膜神経節細胞(RGC)、介在ニューロン、光受容体、および網膜色素性上皮(RPE)で構成されています11,12,13,14,15,16,17,18,19.網膜オルガノイドを用いたIRDのモデリングは成功しているが、分化中の成長因子と低分子の複雑なカクテルの必要性と網膜オルガノイド生成の比較的低い効率は、ほとんどのプロトコルで大きな課題となっている。それらは主に胚様体の形成とそれに続くin vitro発生の異なる段階での複雑な培養条件を使用した網膜系統への段階的な分化を含む20,21,22。
ここでは、健常対照および網膜疾患特異的なhiPS細胞から複雑な3D神経-網膜オルガノイドを開発するための簡単で堅牢な方法が報告されています。ここで説明するプロトコルは、胚様体形成を必要とせずに、ほぼコンフルエントなhiPS細胞培養物の直接分化を利用します。また、培地の複雑さが簡素化され、新しい研究者が簡単に採用できる費用対効果と再現性の高い技術になります。これには、網膜分化の最初の4週間から明確な自己組織化された眼野原始クラスター(EFP)の出現までの付着性単層培養からなるハイブリッド培養システムが含まれます。さらに、各EFP内の円形の神経網膜島を手動でピックし、浮遊培養で1〜2週間増殖させて、PAX6+およびCHX10+増殖神経網膜前駆体からなる多層3D網膜カップまたはオルガノイドを調製します。100 μMタウリン含有培地中での網膜オルガノイドをさらに4週間延長培養すると、RCVRN+およびCRX+光受容体前駆体と、初歩的な内部セグメントのような伸長を有する成熟細胞が出現しました。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Syringe filters</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99722&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>TPP</td>
			<td>91015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>TPP</td>
			<td>91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC365519</td>
			<td>1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab140603</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3201</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5585</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50x), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fibroblast growth factor (bFGF)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F0291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar (50 mL)</td>
			<td>Tarson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoTubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>V7884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EP0709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 medium kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1517001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal&#160;Bovine&#160;Serum, qualified, United States&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelDocXR+ with Image lab software</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>Agarose Gel documentation system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11030</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11035</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoCore MULTICUT</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>For sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Acsorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A92902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>To quantify RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>23995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7095D-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab183951</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab195045</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab231782</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Noggin Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6057-NG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 10 mL</td>
			<td>TPP</td>
			<td>94010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 5 mL</td>
			<td>TPP</td>
			<td>94005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate Tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starfrost (silane coated) microscopic slides</td>
			<td>Knittel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>18080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol&#160;Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI&#160;</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1200&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A27940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of retinal organoids from healthy and retinal disease-specific human-induced pluripotent stem cells

多能性幹細胞は、in vitro疾患モデリング研究や再生医療の開発に役立つ複雑な組織オルガノイドを生成することができます。このプロトコルは、網膜分化の最初の4週間から明確な自己組織化された眼野原始クラスター(EFP)の出現までの間に、付着性単層培養からなるハイブリッド培養システムで網膜オルガノイドを生成する、より簡単で堅牢かつ段階的な方法について説明しています。さらに、各EFP内のドーナツ型、円形、および半透明の神経網膜島を手作業でピックし、網膜分化培地中の非付着培養皿を使用して懸濁下で1〜2週間培養して、多層3D光学カップ(OC-1M)を生成します。これらの未熟な網膜オルガノイドには、PAX6+およびChX10+が増殖する多能性網膜前駆体が含まれています。前駆細胞はオルガノイド内で直線的に自己組織化しており、明確な放射状の縞模様として現れます。浮遊培養後4週間で、網膜前駆細胞は有糸分裂後停止および系統分化を経て、成熟網膜オルガノイド(OC-2M)を形成します。光受容体系統コミット前駆体は、網膜オルガノイドの最外層内に発達する。これらのCRX+およびRCVRN+光受容体細胞は、形態学的に成熟し、内部セグメントのような伸長を示します。この方法は、ヒト胚性幹細胞(hESC)および人工多能性幹細胞(iPSC)を用いた網膜オルガノイドの作製に採用できます。すべてのステップと手順は、再現性を確保し、基礎科学およびトランスレーショナルリサーチにおけるより広いアプリケーションのために明確に説明および実証されています。

hiPS細胞の眼系統への分化は、図1に示すように、サプリメントと成長因子を含む培養培地の異なるカクテル中で細胞を異なる時点で順次培養することによって達成されます。このhiPSC培養物は、多能性幹細胞維持培地であるエッセンシャル8培地で維持される。70%〜80%のコンフルエンシーに達したら(図2A)、培地は0日目に分化誘導培地(DIM)に交換され?...

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Generation of Retinal Organoids from Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells

このプロトコルは、接着培養システムと浮遊培養システムの両方を含む簡略化された培養条件を使用して、hiPS細胞を眼野クラスターに分化させ、神経網膜オルガノイドを生成する効率的な方法について説明しています。RPEや角膜上皮などの他の眼細胞タイプも、網膜培養の成熟眼野から単離することができます。

健常および網膜疾患特異的ヒト誘起多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの作製

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative ...

このプロトコルは、研究および再生アプリケーションのために、ヒトIPCを複雑な3次元神経網膜オルガノイドに分化させる簡単で効率的な方法を説明しています。この技術には、接着培養と浮遊培養の両方が含まれ、網膜オルガノイドとRP細胞の両方を選択的にピッキングして濃縮することができます。網膜変性疾患の細胞ベースの治療法を開発するための細胞源の実行可能で定期的な供給を提供することができます。このような幹細胞由来網膜オルガノイドやRPE細胞は、眼の発達や遺伝性網膜疾患を研究するためのin vitroモデルとして有用である。この方法は、ヒトIPSC培養の取り扱いにすでに精通している研究室でも簡単に再現できます。視覚的デモンストレーションは、眼野の識別と、空間的位置と形態学的特徴に基づく神経網膜カップの分離を大幅にサポートします。まず、使用済み培地を70〜80%コンフルエントなヒトIPSC培養液を6ウェルプレートで吸引します。PBSをウェルに加え、それらを回転させ、洗浄バッファーを吸引します。次に、1ミリリットルの細胞解離溶液またはCDSを各ウェルに加え、細胞が切り上げられるまでプレートを摂氏37度で5〜7分間インキュベートします。CDSを吸引し、細胞懸濁液を15ミリリットルの遠沈管に回収します。チューブを室温で4分間1, 000 RPMで回転させます。上清を廃棄し、細胞ペレットを1.2ミリリットルのエッセンシャル8培地に再懸濁します。1.5ミリリットルのIPSC培地と10マイクロモルのY27632を含むマトリックスコーティングされた6ウェルプレートの各ウェルに200マイクロリットルの細胞懸濁液を分注します。12〜24時間後、使用済みの培地を取り除き、培養を維持するためにY27632を含まない予熱した完全上昇培地を追加します。培養液が70〜80%のコンフルエントに達するまで、24時間ごとに培地を交換します。0日目に、ヒトIPSC維持培地を吸引し、1ミリリットルのBFGFあたり1ナノグラムと1ミリリットルのNogginあたり1ナノグラムを含む分化誘導培地を6ウェルプレートに追加します。5%二酸化炭素インキュベーター内で摂氏37度で細胞をインキュベートします。初日目に、使用済み培地を吸引し、1ミリリットルのBFGFあたり1ナノグラムと1ミリリットルのノギンあたり10ナノグラムを含む分化誘導培地を追加します。5%二酸化炭素インキュベーター内で摂氏37度で細胞を再びインキュベートします。2日目と3日目に、使用済みの培地を取り除き、1ミリリットルあたり10ナノグラムのNogginを含む分化誘導培地を追加します。6ウェルプレートに1ウェルあたり2ミリリットルの培地を加えた後、5%二酸化炭素インキュベーター内で細胞を摂氏37度でインキュベートし、24時間ごとに培地を交換します。4日目に、使用済みの培地を取り除き、網膜分化培地またはRDMを追加します。同じ手順に従って、ウェルあたり2ミリリットルの培地を6ウェルプレートに追加し、培養液をインキュベートします。培地は毎日交換してください。14日目と18日目頃に、初期の眼野前駆細胞からなる神経ロゼット様ドメインの出現について、10倍の倍率で顕微鏡下で培養を観察します。21日目と28日目頃に、4倍と10倍の倍率で顕微鏡下で培養物を観察し、神経上皮と眼表面上皮の連続した成長に囲まれた円形の3D神経網膜構造の中央島を持つ自己組織化された異なるEFPの出現を観察します。滅菌パスツールピペットを取り、片手でベースを持ち、もう片方の手でキャピラリーチップを持ちます。ガラスが柔軟になるまで、キャピラリーチップの中央近くの領域を回転運動で火炎滅菌および加熱します。次に、炎から離れ、キャピラリーチップをすばやく外側に引っ張って、閉じたルーメンを持つ細かいキャピラリーチップを作成します。細い先端を炎の前で水平に持ち、外側にすばやく炎に通して、滑らかなフックまたはL字型の毛細管先端を作成します。実体顕微鏡下で、キャピラリーフックの滑らかな外側曲率ゾーンを細かいスクープとして使用して、個々のEFPから整形式の神経網膜カップを手動で選択します。25日目と30日目に、4ミリリットルの事前に温めた網膜分化培地を低付着性60ミリメートルディッシュに入れて培養し、3D網膜オルガノイドを生成するための網膜カップを維持します。これは、神経網膜カップを収穫する前に行う必要があります。1ミリメートルのマイクロピペットを100マイクロリットルの吸引にセットし、広い口径開口部を持つ1ミリリットルのマイクロチップを使用して吸引し、浮遊する網膜カップを吸引し、以前に準備した新鮮な低付着性培養皿に移します。網膜カップを非付着性浮遊培養としてRDMに維持し、5%二酸化炭素インキュベーター内で摂氏37度でインキュベートします。30日目と45日目に、部分供給法に従って、使用済み培地の半分の容量を取り除き、等量の新鮮な培地と交換します。45日目と60日目に、100マイクロモルのタウリンを含むRDMで網膜オルガノイドをさらに2週間培養し、神経網膜前駆細胞のより良い生存と系統分化、および成熟網膜細胞タイプの発達をサポートします。網膜オルガノイドは、RT-PCRおよび免疫組織化学を用いて、いくつかの網膜前駆細胞マーカーの発現について、成熟のさまざまな段階で特徴付けられます。RT-PCRの結果、1ヶ月齢の網膜オルガノイドと2ヶ月齢の網膜オルガノイドにおける神経網膜マーカーの誘導と発現が確認されました。神経網膜前駆マーカーChx10、PAX6、Otx2に対する抗体を用いた未熟網膜オルガノイドの免疫標識切片と、視細胞前駆体マーカーリカバーインおよびCRXに対する抗体を用いた成熟網膜オルガノイドの共焦点画像を示します。分化した光受容体細胞を有する網膜オルガノイドの顕著な最外層がズームされ、これらの画像に示される。初歩的な内部セグメントのような延長は白い矢印でマークされています。EFPクラスターは、神経網膜カップを中心に、RPEの成長物の移動は、前縁に沿って色素沈着を示します。神経網膜島周辺の複数のEFPからの高分化色素性上皮成長がここに示されています。EFPのより高い倍率は、RPE前駆細胞の遊走帯および神経網膜カップを囲む眼表面上皮を示す。色素細胞と非色素細胞の両方を含む未熟RPE細胞の単層を発達させた拡張接着培養をここに示します。完全に成熟した色素性RPE細胞の単層培養は、60日目に石畳の形態を示します。PAX6、MITF、およびRPE65を発現するRPE細胞をこの図に示します。これらの画像は、歪んだ積層と縞模様の欠如を伴う網膜前駆細胞の異常な凝集体を有するEFPを表しています。ミニチュア神経網膜カップを有するが、RPEおよび眼表面上皮の周囲領域を欠いているEFPがこの図に示されている。代表的な画像は、浮遊培養で形成された不規則な神経網膜凝集体を示しています。3〜4週間以内に眼野の効率的な誘導を達成するためには、IPCのほぼコンフルエントな成長培養物を使用して分化プロセスを開始することが非常に重要です。正常および患者特異的IPCから生成された網膜オルガノイドおよびRPE細胞は、網膜疾患モデルとして、また新規治療薬の試験に使用できます。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

幹細胞から網膜色素上皮細胞の効率的な導出

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

発生生物学

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

胚様体の異なるサイズによって人工多能性幹（iPS）細胞から網膜色素上皮（RPE）の導出

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

髪の由来ケラチノサイトを使用した統合フリーヒト誘導多能性幹細胞の生成

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起棘の三次元定量

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞から肝細胞様細胞の定義され、スケーラブルな世代

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

末梢血由来ヒト誘導多能性幹細胞からの軟骨細胞の分化

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

標準化され、再現性のある前脳型人間から脳オルガノイドの生成誘導多能性幹細胞

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

臍帯血由来から 3 D 肌 Organoid の生成誘導多能性幹細胞

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...