Name: generation of retinal organoids from healthy and retinal disease-specific human-induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2022-12-09T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Retinal Organoids from Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Yazarlar, Genetikçi Dr. Chitra Kannabiran'ın bilimsel ve teknik desteğini kabul ediyor; Dr. Subhadra Jalali, Retina Danışmanı; Dr. Milind Naik, Oküloplastik Cerrah; ve Dr. Swathi Kaliki, LV Prasad Göz Enstitüsü, Haydarabad'da Oküler Onkolog normal ve hastaya özgü iPSC hatlarının oluşturulmasına doğru. Yazarlar, Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu, Bilim ve Teknoloji Bölümü (IM), (SB / SO / HS / 177/2013), Biyoteknoloji Bölümü (IM), (BT / PR32404 / MED / 30/2136/2019) ve ICMR (S.M., D.P.), UGC (T.A.) ve CSIR (V.K.P.), Hindistan Hükümeti'nden Kıdemli Araştırma Burslarından Ar-Ge hibelerini kabul etmektedir.

HiPSC'leri içeren tüm deneyler, standart laboratuvar uygulamalarına, etik ve biyogüvenlik kılavuzlarına bağlı kalınarak ve Kurumsal Etik Komitesi (IEC), Kurumsal Kök Hücre Araştırmaları Komitesi (IC-SCR) ve Kurumsal Biyo-Güvenlik Komitesi (IBSC) gibi düzenleyici kurumların onaylarıyla aseptik olarak gerçekleştirilmiştir.
1. iPSC kültürü ve retina farklılaşma ortamı ve reaktiflerinin hazırlanması
<ol><li>iPSC kültürü ve bakım ortamı<ol><li>No...

<ol>
	<li>Dandona, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+visual+impairment+in+India:+the+Andhra+Pradesh+Eye+Disease+Study.">Moderate visual impairment in India: the Andhra Pradesh Eye Disease Study.</a> British Journal of Ophthalmology. 86 (4), 373-377 (2002).</li><li>Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinitis+pigmentosa.">Retinitis pigmentosa.</a> Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).</li><li>Sen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+retinitis+pigmentosa+in+South+Indian+population+aged+above+40+years.">Prevalence of retinitis pigmentosa in South Indian population aged above 40 years.</a> Ophthalmic Epidemiology. 15 (4), 279-281 (2008).</li><li>Nazimul, H., Rohit, K., Anjli, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trend+of+retinal+diseases+in+developing+countries.">Trend of retinal diseases in developing countries.</a> Expert Review of Ophthalmology. 3 (1), 43-50 (2008).</li><li>. RetNet - Retinal Information Network Available from: <a target="_blank" href="https://sph.uth.edu/retnet/">https://sph.uth.edu/retnet/</a> (2022)</li><li>Cicero, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+previously+identified+as+retinal+stem+cells+are+pigmented+ciliary+epithelial+cells.">Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (16), 6685-6690 (2009).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+retinitis+pigmentosa:+retinal+organoids+generated+from+the+iPSCs+of+a+patient+with+the+USH2A+mutation+show+early+developmental+abnormalities.">Modeling retinitis pigmentosa: retinal organoids generated from the iPSCs of a patient with the USH2A mutation show early developmental abnormalities.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 361 (2019).</li><li>Lane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+and+rescue+of+RP2+Retinitis+pigmentosa+using+iPSC-derived+retinal+organoids.">Modeling and rescue of RP2 Retinitis pigmentosa using iPSC-derived retinal organoids.</a> Stem Cell Reports. 15 (1), 67-79 (2020).</li><li>Li, Y. P., Deng, W. L., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+retinitis+pigmentosa+through+patient-derived+retinal+organoids.">Modeling retinitis pigmentosa through patient-derived retinal organoids.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100438 (2021).</li><li>Gonzalez-Cordero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+human+retinal+development+from+human+pluripotent+stem+cells+generates+transplantable+populations+of+cone+photoreceptors.">Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors.</a> Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).</li><li>Meyer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+vesicle-like+structures+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+facilitate+a+customized+approach+to+retinal+disease+treatment.">Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment.</a> Stem Cells. 29 (8), 1206-1218 (2011).</li><li>Zhu, J., Lamba, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-based+retinal+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Small molecule-based retinal differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells.</a> Bio-Protocol. 8 (12), 2882 (2018).</li><li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs.">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium.">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs.">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communications. 5, 4047 (2014).</li><li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3D+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells.">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 766 (2017).</li><li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines.">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Chichagova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+retinal+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Differentiation of retinal organoids from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 95 (2019).</li><li>Kelley, R. A., Chen, H. Y., Swaroop, A., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+development+of+rod+photoreceptors+in+retinal+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+by+supplementation+with+9-cis+retinal.">Accelerated development of rod photoreceptors in retinal organoids derived from human pluripotent stem cells by supplementation with 9-cis retinal.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100033 (2020).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+cone+photoreceptors+through+simultaneous+inhibition+of+BMP,+TGFbeta+and+Wnt+signaling.">Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling.</a> Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li><li>Mellough, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-1+signaling+plays+an+important+role+in+the+formation+of+three-dimensional+laminated+neural+retina+and+other+ocular+structures+from+human+embryonic+stem+cells.">IGF-1 signaling plays an important role in the formation of three-dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 33 (8), 2416-2430 (2015).</li><li>Susaimanickam, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+minicorneal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).</li></ol>

hiPSC'ler in vitro organ ve doku gelişimini incelemek için güçlü bir araçtır. Sağlıklı ve hastalığa özgü hiPSC'leri retina soyuna doğru ayırt ederek hastalık fenotipinin özetlenmesi, kalıtsal retina distrofilerinin farklı formlarının patofizyolojisi hakkında daha yeni bilgiler edinilmesine yardımcı olabilir. PSC'lerin retinal hücre tiplerine in vitro farklılaşması için çeşitli protokoller tanımlanmış ve benimsenmiştir. Bunların çoğu, rekombinant büyüme faktörler...

Retina, omurgalı gözün arkasında bulunan ve ışık sinyallerini foto-transdüksiyon yolu olarak bilinen biyokimyasal bir fenomenle sinir uyarılarına dönüştüren ışığa duyarlı bir dokudur. Retinanın fotoreseptör hücrelerinde üretilen ilk sinir uyarıları, diğer retinal internöronlara ve retinal ganglion hücrelerine (RGC'ler) dönüştürülür ve beynin görsel korteksine ulaşır, bu da görüntü algısına ve görsel tepkiye yardımcı olur.
Dünya Sağlık Örgütü'ne (WHO) göre, 1 milyonu Asya'da olmak üzere tahmini 1,5 milyon çocuk kördür. Kalıtsal Retina Distrofisi (IRD), dünya çapında 4.000 kişiden 1'ini etkileyen majör bir körleme hastalığıdır 1,2,3, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ile ilişkili körlük prevalansı gelişmekte olan ülkelerde %0,6-%1,1 arasında değişmektedir 4. IRD'ler, retina gelişimi ve fonksiyonunda rol oynayan 300'den fazla farklı gendeki kalıtsal genetik kusurlardan kaynaklanır5. Bu tür genetik değişiklikler, normal retina fonksiyonlarının bozulmasına ve retina hücrelerinin, yani fotoreseptör hücrelerin ve retina pigmentli epitelin (RPE) kademeli olarak dejenerasyonuna neden olur ve böylece ciddi görme kaybına ve körlüğe yol açar. Kornea, lens vb. ile ilgili diğer kör edici durumlarda muazzam ilerlemeler kaydedilmiştir. Bununla birlikte, retina distrofileri ve optik sinir atrofilerinin bugüne kadar kanıtlanmış bir tedavisi yoktur. Yetişkin bir insan retinasında kök hücrelerbulunmadığından 6, embriyonik kök hücreler (ESC'ler) ve hasta kaynaklı indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) gibi alternatif kaynaklar, istenen hücre tiplerinin sınırsız bir tedarikini sağlayabilir ve in vitro hastalık modelleme çalışmaları için gerekli olan karmaşık doku organoidlerinin geliştirilmesi ve rejeneratif tedavilerin geliştirilmesi için büyük bir umut vaat edebilir7, 8,9,10.
Birkaç yıllık retinal araştırma, erken retina gelişimini düzenleyen moleküler olayların daha iyi anlaşılmasını sağlamıştır. PSC'lerden retinal hücreler ve 3D organoidler üretmek için kullanılan protokollerin çoğu, bilinen biyolojik süreçleri aşamalı bir şekilde modüle etmek için hücreleri karmaşık bir büyüme faktörleri ve küçük moleküller kokteylinde kültürleyerek bu gelişimsel olayları in vitro olarak özetlemeyi amaçlamaktadır. Bu şekilde üretilen retinal organoidler başlıca retinal hücrelerden oluşur: retinal ganglion hücreleri (RGC'ler), internöronlar, fotoreseptörler ve retina pigmentli epitel (RPE)11,12,13,14,15,16,17,18,19. Retinal organoidleri kullanarak IRD'leri modellemeye yönelik başarılı girişimlere rağmen, farklılaşma sırasında büyüme faktörlerinin ve küçük moleküllerin karmaşık kokteyline olan gereksinim ve retinal organoid üretiminin nispeten düşük verimliliği, çoğu protokolde büyük bir zorluk oluşturmaktadır. Bunlar büyük ölçüde embriyoid cisimlerin oluşumunu ve ardından in vitro gelişimin farklı aşamalarında karmaşık kültür koşullarını kullanarak retinal soylara kademeli olarak farklılaşmalarını içerir20,21,22.
Burada, sağlıklı kontrol ve retina hastalığına özgü hiPSC'lerden kompleks 3D nöro-retinal organoidler geliştirmek için basitleştirilmiş ve sağlam bir yöntem bildirilmiştir. Burada tarif edilen protokol, embriyoid vücut oluşumuna ihtiyaç duymadan yakın birleşimli hiPSC kültürlerinin doğrudan farklılaşmasını kullanır. Ayrıca, kültür ortamının karmaşıklığı basitleştirilmiştir, bu da onu yeni araştırmacılar tarafından kolayca benimsenebilecek uygun maliyetli ve tekrarlanabilir bir teknik haline getirmektedir. Retinal farklılaşmanın ilk 4 haftasında, farklı, kendi kendini organize eden göz alanı ilkel kümelerinin (EFP'ler) ortaya çıkmasına kadar yapışkan tek katmanlı kültürlerden oluşan hibrit bir kültür sistemini içerir. Ayrıca, her EFP içindeki dairesel nöro-retinal adalar, PAX6 + ve CHX10 + prolifere eden nöro-retinal öncüllerden oluşan çok katmanlı 3D retinal kaplar veya organoidler hazırlamak için 1-2 hafta boyunca süspansiyon kültürlerinde manuel olarak toplanır ve yetiştirilir. Retinal organoidlerin 100 μM Taurin içeren ortamda 4 hafta daha uzatılmış kültürü, RCVRN + ve CRX + fotoreseptör öncüllerinin ve ilkel iç segment benzeri uzantılara sahip olgun hücrelerin ortaya çıkmasına neden olmuştur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Syringe filters</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99722&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>TPP</td>
			<td>91015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>TPP</td>
			<td>91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC365519</td>
			<td>1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab140603</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3201</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5585</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50x), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fibroblast growth factor (bFGF)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F0291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar (50 mL)</td>
			<td>Tarson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoTubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>V7884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EP0709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 medium kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1517001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal&#160;Bovine&#160;Serum, qualified, United States&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelDocXR+ with Image lab software</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td>Agarose Gel documentation system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11030</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11035</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoCore MULTICUT</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>For sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Acsorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A92902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>To quantify RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>23995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7095D-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab183951</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab195045</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab231782</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Noggin Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6057-NG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 10 mL</td>
			<td>TPP</td>
			<td>94010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 5 mL</td>
			<td>TPP</td>
			<td>94005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate Tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starfrost (silane coated) microscopic slides</td>
			<td>Knittel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>18080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol&#160;Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI&#160;</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1200&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A27940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of retinal organoids from healthy and retinal disease-specific human-induced pluripotent stem cells

Pluripotent kök hücreler, in vitro hastalık modelleme çalışmaları ve rejeneratif tedaviler geliştirmek için yararlı olan karmaşık doku organoidleri üretebilir. Bu protokol, retinal farklılaşmanın ilk 4 haftasında, farklı, kendi kendini organize eden göz alanı primordial kümelerinin (EFP'ler) ortaya çıkmasına kadar, yapışkan tek katmanlı kültürlerden oluşan hibrid bir kültür sisteminde retinal organoidlerin üretilmesinin daha basit, sağlam ve aşamalı bir yöntemini tanımlamaktadır. Ayrıca, her EFP'deki çörek şeklindeki, dairesel ve yarı saydam nöro-retinal adalar, çok katmanlı 3D optik kaplar (OC-1M) üretmek için 1-2 hafta boyunca retinal farklılaşma ortamında yapışkan olmayan kültür kapları kullanılarak süspansiyon altında manuel olarak toplanır ve kültürlenir. Bu olgunlaşmamış retinal organoidler PAX6+ ve ChX10+ proliferasyonlu, multipotent retinal öncülleri içerir. Öncü hücreler organoidler içinde doğrusal olarak kendi kendine monte edilir ve farklı radyal çizikler olarak görünür. Süspansiyon kültüründen 4 hafta sonra, retinal progenitörler post-mitotik arrest ve olgun retinal organoidleri (OC-2M) oluşturmak için soy farklılaşmasına uğrarlar. Fotoreseptör soyu işlenen öncüller, retinal organoidlerin en dış katmanlarında gelişir. Bu CRX + ve RCVRN + fotoreseptör hücreleri, iç segment benzeri uzantıları görüntülemek için morfolojik olarak olgunlaşır. Bu yöntem, insan embriyonik kök hücreleri (hESC'ler) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) kullanılarak retinal organoidler üretmek için benimsenebilir. Tüm adımlar ve prosedürler, tekrarlanabilirliği sağlamak ve temel bilim ve çeviri araştırmalarında daha geniş uygulamalar için açıkça açıklanmış ve gösterilmiştir.

HiPSC'lerin göz soylarına farklılaşması, Şekil 1'de açıklandığı gibi, takviyeleri ve büyüme faktörlerini içeren farklı kültür ortamı kokteyllerindeki hücrelerin farklı zaman noktalarında sıralı adımlarla kültürlenmesiyle elde edilir. HiPSC kültürleri, pluripotent kök hücre bakım ortamı olan Essential 8 ortamında tutulur. % 70-80 akıcılığa ulaştıklarında (Şekil 2A), ortam 1 ng / mL bFGF, 1 ng / mL Noggin ve% 1 N2 takviyes...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Retinal Organoids from Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of Retinal Organoids from Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Bu protokol, hiPSC'leri göz alanı kümelerine ayırmanın ve hem yapışkan hem de süspansiyon kültür sistemlerini içeren basitleştirilmiş kültür koşullarını kullanarak nöro-retinal organoidler üretmenin etkili bir yöntemini açıklamaktadır. RPE ve kornea epiteli gibi diğer oküler hücre tipleri de retina kültürlerinde olgun göz alanlarından izole edilebilir.

Sağlıklı ve Retina Hastalığına Özgü İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Retinal Organoidlerin Üretimi

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative ...

Bu protokol, insan IPC'lerini araştırma ve rejeneratif uygulamalar için karmaşık üç boyutlu nöro retinal organoidlere ayırmanın basit ve etkili bir yöntemini açıklamaktadır. Bu teknik, hem retinal organoidlerin hem de RP hücrelerinin seçici olarak toplanmasına ve zenginleştirilmesine izin veren hem yapışkan hem de süspansiyon kültürlerini içerir. Retinal dejeneratif hastalıklar için hücre bazlı tedaviler geliştirmek için uygun ve düzenli bir hücre kaynağı kaynağı sağlayabilir.Bu tür kök hücre kaynaklı retinal organoidler ve RPE hücreleri, göz gelişimini ve kalıtsal retina hastalıklarını incelemek için in vitro modeller gibi yararlıdır. Bu yöntem, insan IPSC kültürlerini ele almaya aşina olan araştırma laboratuvarları tarafından kolayca çoğaltılabilir. Görsel gösterim, göz alanlarının tanımlanmasını ve nöro retinal bardakların mekansal konumlarına ve morfolojik özelliklerine göre izole edilmesini büyük ölçüde desteklemektedir.Başlamak için, harcanan ortamı% 70 ila% 80 arasında aspire edin.İnsan IPSC kültürleri altı kuyucuklu plakalarda. Kuyucuklara PBS ekleyin, onları döndürün ve yıkama tamponunu aspire edin. Daha sonra her bir kuyucuğa bir mililitre hücre ayrışma çözeltisi veya CDS ekleyin ve hücreler toplanana kadar plakayı beş ila yedi dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.CDS'yi aspire edin ve hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne toplayın. Tüpü oda sıcaklığında dört dakika boyunca 1.000 RPM'de döndürün. Süpernatantı atın ve hücre peletini 1.2 mililitre Essential 8 ortamında yeniden askıya alın.1,5 mililitre IPSC kültür ortamı ve 10 mikromolar Y27632 içeren matris kaplı altı delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 200 mikrolitre hücre süspansiyonu dağıtın. 12 ila 24 saat sonra, harcanan ortamı çıkarın ve kültürleri korumak için Y27632 olmadan önceden ısıtılmış tam yükseliş ortamı ekleyin. Kültürler% 70 ila% 80 birleşime ulaşana kadar her 24 saatte bir kültür ortamını değiştirin.Sıfır gününde, insan IPSC bakım ortamını aspire edin ve altı kuyucuklu plakaya mililitre BFGF başına bir nanogram ve mililitre Noggin başına bir nanogram içeren farklılaşma indüksiyon ortamı ekleyin. Hücreleri% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin. İlk gün, harcanan ortamı aspire edin ve mililitre BFGF başına bir nanogram ve mililitre Noggin başına 10 nanogram içeren farklılaşma indüksiyon ortamı ekleyin.Hücreleri% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede tekrar inkübe edin. İkinci ve üçüncü günde, harcanan ortamı çıkarın ve mililitre Noggin başına 10 nanogram içeren farklılaşma indüksiyon ortamı ekleyin. Altı delikli bir plakaya kuyu ortamı başına iki mililitre ekledikten sonra, hücreleri% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin ve ortamı her 24 saatte bir değiştirin.Dördüncü günde, harcanan ortamı çıkarın ve retinal farklılaşma ortamını veya RDM'yi ekleyin. Altı delikli bir plakaya kuyu ortamı başına iki mililitre eklemek ve kültürleri inkübe etmek için aynı prosedürü izleyin. Ortamı her gün değiştirin.14. ve 18. günlerde, erken göz alanı progenitörlerinden oluşan nöral rozet benzeri alanların ortaya çıkması için kültürleri mikroskop altında 10X büyütmede gözlemleyin. 21 ve 28. günlerde, nöro epitel ve oküler yüzey epitelinin bitişik çıkıntıları ile çevrili merkezi bir dairesel 3D nöro retinal yapı adası ile kendi kendini organize eden farklı EFP'lerin ortaya çıkışını gözlemlemek için kültürleri mikroskop altında 4X ve 10X büyütmede gözlemleyin. Steril bir Pasteur pipet alın ve tabanı bir elinizde ve kılcal ucu diğer elinizde tutun.Alev, kılcal ucun ortasına yakın bölgeyi, cam esnek hale gelene kadar dönme hareketleriyle sterilize eder ve ısıtır. Ardından alevden uzaklaşın ve kapalı lümenli ince bir kılcal uç oluşturmak için kılcal ucu hızla dışarı doğru çekin. İnce ucu alevin önünde yatay olarak tutun ve pürüzsüz bir kanca veya L şeklinde bir kılcal uç oluşturmak için alevin içinden dışa doğru bir hareketle hızla geçirin.Bir stereo mikroskop altında, kılcal kancanın pürüzsüz dış eğrilik bölgesini ince bir kepçe olarak kullanarak iyi biçimlendirilmiş nöro retinal kapları bireysel EFP'lerden manuel olarak seçin. 25. ve 30. günlerde, kültüre düşük bir bağlantı 60 milimetrelik bir kapta dört mililitre önceden ısıtılmış retinal farklılaşma ortamı ekleyin ve 3D retinal organoidler üretmek için retinal kapları koruyun. Bu, nöro retinal bardakların toplanmasından önce yapılmalıdır.100 mikrolitreyi aspire etmek için bir milimetrelik bir mikropipet ayarlayın ve yüzen retinal kapları aspire etmek ve daha önce hazırlanan taze, düşük yapışkanlı kültür yemeklerine aktarmak için geniş delikli açıklıklara sahip bir mililitre mikro uç kullanın. RDM'deki retinal kapları yapışkan olmayan süspansiyon kültürleri olarak tutun ve% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin. 30. ve 45. günlerde, kısmi bir besleme yöntemini izleyerek, harcanan ortamın hacminin yarısını çıkarın ve eşit miktarda taze ortam ile değiştirin.45. ve 60. günlerde, nöro retinal progenitörlerin daha iyi sağkalımını ve soy farklılaşmasını ve olgun retinal hücre tiplerinin gelişimini desteklemek için 100 mikromolar taurin içeren RDM'de retinal organoidleri iki hafta daha kültürleyin. Retinal organoidler, RT-PCR ve immünohistokimya kullanılarak çeşitli retinal progenitör belirteçlerin ekspresyonu için olgunlaşmanın farklı aşamalarında karakterize edilir. RT-PCR sonuçları, bir aylık retinal organoidlerde ve iki aylık retinal organoidlerde nöro retinal belirteçlerin indüksiyonunu ve ekspresyonunu doğruladı.Burada nöro retinal progenitör belirteçleri Chx10, PAX6 ve Otx2'ye karşı antikorlar kullanan olgunlaşmamış retinal organoidlerin immün işaretli kesitlerinin konfokal görüntüleri ve fotoreseptör öncü belirteçleri recoverin ve CRX'e karşı antikorlar kullanan olgun retinal organoidlerin konfokal görüntüleri gösterilmiştir. Farklılaşan fotoreseptör hücrelere sahip retinal organoidlerin belirgin dış tabakası yakınlaştırılır ve bu görüntülerde gösterilir. İlkel iç segment benzeri uzantılar beyaz oklarla işaretlenmiştir.Merkezde nöroretinal fincan bulunan EFP kümeleri ve göç eden RPE çıkıntıları, ön kenarlar boyunca pigmentasyon gösterir. Burada nöro retinal adanın her yerindeki çoklu EFP'lerden iyi diferansiye pigmente epitel çıkıntıları gösterilmiştir. Bir EFP'nin daha yüksek büyütmesi, RPE progenitörlerinin göç bölgesini ve bir nöro retinal kabı çevreleyen oküler yüzey epitelini gösterir.Hem pigmentli hem de pigmentli olmayan hücreleri içeren olgunlaşmamış RPE hücrelerinin monokatmanlarını geliştiren genişletilmiş yapışkan kültürler burada gösterilmiştir. Tam olgun ve pigmentli RPE hücrelerinin tek katmanlı kültürleri 60. günde parke taşı morfolojisi gösterir. PAX6, MITF ve RPE65'i eksprese eden RPE hücreleri bu şekilde gösterilmiştir.Bu görüntüler, retinal progenitörlerin anormal agregaları olan EFP'leri, çarpık laminasyon ve çizik eksikliği ile temsil eder. Minyatür nöroretinal fincan ile EFP, ancak RPE ve oküler yüzey epitelinin çevresindeki bölgeden yoksun olarak bu şekilde gösterilmiştir. Temsili görüntü, süspansiyon kültüründe oluşan düzensiz nöroretinal agregaları göstermektedir.Üç ila dört hafta içinde göz alanlarının verimli bir şekilde indüksiyonunu sağlamak için IPC'lerin neredeyse birleşen büyüyen kültürlerini kullanarak farklılaşma sürecine başlamak çok önemlidir. Normal ve hastaya özgü IPC'lerden üretilen retinal organoidler ve RPE hücreleri, retina hastalığı modelleri olarak ve yeni terapötik ilaçların test edilmesinde kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

Kök Hücreleri Retina pigment epiteli hücrelerinin Verimli türetilmesi

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Gelişim Biyolojisi

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Embriyoid Kuruluşlarının Farklı Boyutları tarafından uyarılmış pluripotent kök gelen Retina pigment epiteli (RPE) türetilmesi (iPS) Hücreler

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Saç türetilmiş keratinositlerden Kullanarak Entegrasyon serbest İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Tanımlı ve hepatosit benzeri Hücrelerinin Ölçeklenebilir Nesil insan pluripotent kök hücreleri gelen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Periferal Kan Türevi İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrositlerin Farklılaşması

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Standart ve tekrarlanabilir ön türü beyin Organoids insan nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

3B cilt Organoid kablosu kan kaynaklı nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...