Name: live-cell imaging of intact ex vivo globes using a novel 3d printed holder
Uploaded: 2022-10-06T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-Cell Imaging of Intact Ex Vivo Globes Using a Novel 3D Printed Holder at JoVE.com

ברצוננו להודות ל-NIH על תמיכת המענק הבאה: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) ו-5T32GM008541-24 (KS). ברצוננו להודות גם לקרן לחקר העיניים של אריות מסצ'וסטס ולקרן השתלות הקרנית של ניו אינגלנד.

ההליכים המערבים נבדקים מן החי אושרו על ידי האגודה למחקר בראייה ורפואת עיניים לשימוש בבעלי חיים בטיפול עיניים ומחקר ראייה ופרוטוקול IACUC של אוניברסיטת בוסטון (201800302).
1. עיצוב המחזיקים ופס העטיפה המודפסים בתלת מימד
<ol><li>עצב את המחזיקים המודפסים בתלת-ממד ואת פס הכיסוי...

<ol>
	<li>Kneer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fat+diet+induces+pre-type+2+diabetes+with+regional+changes+in+corneal+sensory+nerves+and+altered+P2X7+expression+and+localization.">High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization.</a> Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+Ca2++mobilizations:+A+quantitative+approach+to+predict+their+importance+in+cell-cell+communication+and+wound+healing.">Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing.</a> PLoS One. 14 (4), 0213422 (2019).</li><li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals.">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).</li><li>Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors+but+not+gap+junctions+play+a+role+in+injury-induced+Ca2++waves+in+epithelial+cells.">Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+changes+in+Ca(2+)+mobilization+and+protein+phosphorylation+implicated+in+impaired+wound+healing.">Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).</li><li>Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2Y2+receptor+mediates+the+epithelial+injury+response+and+cell+migration.">The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).</li><li>Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collapse+of+global+neuronal+states+in+Caenorhabditis+elegans+under+isoflurane+anesthesia.">Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia.</a> Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).</li><li>Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+gentle+hydrogel+encapsulation+of+living+organisms+enables+long-term+microscopy+over+multiple+hours.">Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours.</a> Communications Biology. 1, 73 (2018).</li><li>Rhodes, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pannexin1:+Role+as+a+sensor+to+injury+is+attenuated+in+pretype+2+corneal+diabetic+epithelium.">Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium.</a> Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338 (2021).</li><li>Segars, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+dependent+changes+in+corneal+epithelial+cell+signaling.">Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721 (2022).</li><li>Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+epithelial+and+stromal+corneal+stiffness+occur+with+age+and+obesity.">Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity.</a> Bioengineering. 7 (1), 14 (2020).</li><li>Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinoreceptor+P2X7+regulation+of+Ca(2+)+mobilization+and+cytoskeletal+rearrangement+is+required+for+corneal+reepithelialization+after+injury.">Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury.</a> The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).</li><li>Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+euthanasia+and+enucleation+on+mouse+corneal+epithelial+axon+density+and+nerve+terminal+morphology.">The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology.</a> The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).</li></ol>

פרוטוקול זה מתאר טכניקת הדמיה של תאים חיים המשתמשת במחזיק מודפס בתלת-ממד כדי לייצב ולשתק עיניים שלמות של בעלי חיים. הוא נועד לעקוף מספר חסרונות משמעותיים המוכרים בפרוטוקולי הדמיה קודמים של תאים חיים של רקמת קרנית ex vivo . פרוטוקול זה מציע יתרונות רבים להדמיית תאים חיים של גלובוסים שלמי?...

קרנית הקרנית היא מבנה שקוף ואווסקולרי המכסה את המשטח הקדמי של העין אשר שובר את האור כדי לאפשר ראייה ומגן על פנים העין מפני נזק. מכיוון שהקרנית חשופה לסביבה, היא רגישה לנזקים הן מסיבות מכניות (גירוד) והן מזיהום. פגיעה בקרנית אצל חולה בריא בדרך כלל מחלימה תוך 1-3 ימים. עם זאת, בחולים עם מחלות רקע, כולל מחסור בתאי גזע לימבליים וסוכרת מסוג II, תהליך הריפוי של פצעי הקרנית יכול להיות ממושך מאוד1. מכיוון שהקרנית מאוד מופנמת, כיבים אלה שאינם מרפאים את הקרנית ושחיקות חוזרות ונשנות של הקרנית כואבים מאוד ופוגעים מאוד באיכות החיים של המטופלים החווים אותם1.
איתות תאי כאשר קרנית בריאה נפגעת, אירועי איתות סידן בתאים הסמוכים לפצע מקדימים וגורמים לנדידה תאית לתוך מיטת הפצע, שם הם סוגרים את הפציעה ללא סיכון של הצטלקות 2,3. אירועי איתות אלה אופיינו היטב במודלים של תרביות תאי אפיתל בקרנית באמצעות הדמיית תאים חיים2. ניסויים ראשוניים הדגימו איתות סידן גבוה יותר באופן משמעותי לאחר פציעה בתאים שאינם סוכרתיים בהשוואה לתאים סוכרתיים. עם זאת, אפיון אירועי האיתות הסלולרי בגלובוסים ex vivo התגלה כאתגר טכני.
הדמיית תאים חיים מחקרים קודמים תיעדו בהצלחה אירועי איתות סידן ממודלים של תרביות תאים במבחנה של ריפוי פצעי בקרנית 4,5,6. פיתוח מתודולוגיה להפקת תמונות באיכות גבוהה של אירועי איתות אלה ברקמת ex vivo הוא עניין רב מכיוון שהוא יאפשר לחקור אירועים אלה במערכת מורכבת ונאמנה יותר לחיים. גישות קודמות כללו כריתה של הקרנית ואחריה אימוביליזציה בג'ל PEGהמושרה על ידי UV 7,8,9. אימוביליזציה היא צעד חיוני אך מאתגר בעבודה עם רקמות חיות, מכיוון שהיא חייבת להישאר בת קיימא ולחות לאורך כל הניסוי. יתר על כן, אסור שאימוביליזציה תפגע ברקמה. בעוד שתמיסת PEG שיתקה את הרקמה, הרזולוציה והאיכות של התמונות שהופקו לא היו עקביות. לכן, מחזיקי הדפסה בתלת-ממד פותחו כדי לשתק גלובוסים שלמים כדי להפיק תמונות באיכות גבוהה יותר עם פחות סיכון לנזק לרקמות.
הגישה מחזיק ייחודי המודפס בתלת-ממד פותח כדי לשתק גלובוסים שלמים של ex vivo להדמיית תאים חיים. מחזיק זה מונע נזק משני מקורות עיקריים: הוא מאפשר הדמיה של כדור הארץ ללא צורך לנתח את הקרנית, והוא מבטל את החשיפה לאור UV. ללא מקורות נזק אלה, התמונות שהתקבלו ייצגו בצורה מדויקת יותר את התגובה לפציעות השריטות שנעשו בניסוי. יתר על כן, המחזיק שהודפס בתלת-ממד כויל לממדים המדויקים של עין המורין. זה סיפק התאמה טובה בהרבה מאשר אימוביליזציה בפתרון PEG, מה שהוביל לתמונה באיכות גבוהה יותר ביעדים בעלי עוצמה נמוכה יותר עקב ירידה בתנועת הרקמות. פס כיסוי המחובר לחלק העליון של המחזיק מבטיח כי הגלובוס נשאר ללא תנועה לאורך כל משך הניסוי וכי אין תזוזה של הגלובוס כאשר מדיית הצמיחה מוחלת כדי לשמור על הידרציה וכדאיות. היכולת להדפיס את המחזיק למידות מדויקות מאפשרת לנו גם לייצר התאמה אופטימלית לעיניים מורין בגדלים שונים בשל הגיל או מצב המחלה. טכנולוגיה זו יכולה להיות מיושמת באופן רחב יותר כדי לפתח מחזיקים לעיניים של מינים שונים בהתבסס על מידותיהם.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic</td>
			<td>Creality (Shenzen, China)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Material for holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated</td>
			<td>MatTek Corporation (Ashland, MA)</td>
			<td>P35GC-1.5-14-C</td>
			<td>Well for imaging.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autodesk Fusion 360 software</td>
			<td>Autodesk (San Rafael, CA).</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Software used for printing the holders.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>305124</td>
			<td>For experimentally-induced wounds to the globes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask DeepRed</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>C10046</td>
			<td>Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Home Super Glue</td>
			<td>Walgreens (Deerfield, IL)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For attaching the holder to the imaging well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ender 3 Pro 3D printer&#160;</td>
			<td>Creality (Shenzen, China)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For printing the holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI/ImageJ</td>
			<td>ImageJ (Bethesda, MD)</td>
			<td>License Number: GPL2</td>
			<td>Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte Serum-Free Medium</td>
			<td>Gibco (Waltham, MA)</td>
			<td>17005042</td>
			<td>25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 &#181;g/mL, respectively) added to medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phophate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning, Medlabtech (Manassas, VA)</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>Used to wash excess stain off of corneas before imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>20x magnification objective was used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell imaging of intact ex vivo globes using a novel 3d printed holder

ריפוי פצעי אפיתל בקרנית הוא תהליך נדידה היזום על ידי הפעלת קולטנים פורינרגיים המתבטאים בתאי אפיתל. הפעלה זו גורמת לאירועי גיוס סידן המתפשטים מתא לתא, החיוניים לייזום תנועתיות תאית לתוך מיטת הפצע, ומקדמים ריפוי פצעים יעיל. מעבדת טרינקאוס-רנדל פיתחה מתודולוגיה להדמיית תגובת ריפוי פצעי הקרנית בגלובוסים ex vivo murine בזמן אמת. גישה זו כוללת הרטבת גלובוס שלם מעכבר שעבר המתת חסד על פי פרוטוקולים שנקבעו ומיד דגירה של כדור הארץ באמצעות צבע מחוון סידן. בשלב זה ניתן ליישם כתם נגדי שמכתים תכונות אחרות של התא כדי לסייע בהדמיה ולהראות ציוני דרך תאיים. הפרוטוקול עבד היטב עם מספר צבעים שונים של תאים חיים המשמשים להכתמה נגדית, כולל אקטין SiR לצביעת אקטין וכתם קרום פלזמה אדום עמוק כדי להכתים את קרום התא. כדי לבחון את התגובה לפצע, אפיתל הקרנית נפגע באמצעות מחט 25 גרם, והגלובוסים ממוקמים במחזיק מודפס בתלת מימד. הממדים של המחזיק המודפס בתלת-ממד מכוילים כדי להבטיח אימוביליזציה של כדור הארץ לאורך כל משך הניסוי, וניתן לשנותם כך שיתאימו לעיניים בגדלים שונים. הדמיית תאים חיים של תגובת הפצע מבוצעת באופן רציף בעומקים שונים ברחבי הרקמה לאורך זמן באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. פרוטוקול זה מאפשר לנו להפיק תמונות ברזולוציה גבוהה ובאיכות פרסום באמצעות מטרה אווירית של פי 20 במיקרוסקופ קונפוקלי. מטרות אחרות יכולות לשמש גם עבור פרוטוקול זה. הוא מייצג שיפור משמעותי באיכות הדמיית התאים החיים בגלובוסים ex vivo murine ומאפשר זיהוי של עצבים ואפיתל.

פרוטוקול זה שימש להפקה עקבית של נתונים ותמונות באיכות פרסום10. התמונות המתקבלות מייצגות שיפור משמעותי בהשוואה לגישות קודמות (איור 2). באמצעות המחזיק המודפס בתלת-ממד, ניתן לצלם תמונות לאורך שכבות הקרנית, וניתן לצפות בגיוס סידן במישורי z שונים (איור 3</st...

Watch this Scientific Journal Video about Live-Cell Imaging of Intact Ex Vivo Globes Using a Novel 3D Printed Holder at JoVE.com

Live-Cell Imaging of Intact Ex Vivo Globes Using a Novel 3D Printed Holder

העבודה הנוכחית מתארת פרוטוקול ניסיוני חדשני המשתמש במחזיק מודפס בתלת-ממד כדי לאפשר הדמיית תאים חיים ברזולוציה גבוהה של גלובוסים דחוסים. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לצפות בפעילות איתות הסידן התאי באפיתל קרנית פצועה מגלובוסים ex vivo בזמן אמת.

הדמיית תאים חיים של גלובוסים שלמים של Ex Vivo באמצעות מחזיק חדשני מודפס בתלת-ממד

Corneal epithelial wound healing is a migratory process initiated by the activation of purinergic receptors expressed on epithelial cells. This activation ...

המחזיק המודפס בתלת-ממד המשמש בפרוטוקול זה מאפשר לנו לעקוב אחר איתות תאי לטווח קצר ואירועי נדידה סלולרית ארוכת טווח בקרניות פצועות בזמן אמת. על ידי שמירה על כדור הארץ שלם, בר קיימא וחסר תנועה, פרוטוקול זה מפיק תמונות חיות באיכות גבוהה של תאי הקרנית, כולל האפיתל והעצבים. ניתן היה לשנות בקלות את המחזיק המודפס בתלת-ממד עבור גלובוסים בגדלים ומינים שונים.אנו יכולים גם לכוון את העיניים באופן שונה לתמונה של אזורים אחרים או לבצע ניסויי כניסת ננו. כדי להתחיל, לאחר הסרת ראשו של עכבר מורדם, הנח אותו מיד על הקרח כדי לשמור על הכדאיות של הרקמה. לאחר מכן עטפו את הגלובוסים על ידי הנמנמתו, באמצעות פינצטה.ולקצץ את עצב הראייה באמצעות מספריים דיסקציה ממש מתחת למקום שבו הוא מוחזק על ידי פינצטה. דגירה של הגלובוסים בשני מיליליטרים של המדיום בצלחת תרבית תאים P-35, כולל מחוון סידן ו/או כתם קרום התא למשך שעה אחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני בתנאי תאורה נמוכים, כדי להבטיח שהגלובוסים יהיו שקועים במדיום הכתמים להכתמה אחידה. כדי להדביק את המחזיקים לכיסוי תחתון נקי מזכוכית, שטפו את המחזיק ב-70% אתנול והניחו דבק על המחזיק.לאחר מכן, הדביקו את המחזיק לכיסוי התחתון של הזכוכית, וודאו שאין דבק באזור הפנימי של המחזיק, שכן דבק יכול להתנפץ, מה שמסבך את ההדמיה. לאחר שהדבק מתמצק, ודא שהמחזיק מאובטח מפני תלוש הכיסוי. הסר את הגלובוסים מתמיסת הכתם באמצעות טפטפות סטריליות, תוך הקפדה על מניעת נזק לרקמות באזור העניין.שוטפים את הגלובוסים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, תוך שימוש במלח זרחתי סטרילי כדי להסיר כתמים עודפים ולהניח את הגלובוסים בתווך להובלה למיקרוסקופ. כדי לפצוע את הגלובוסים באמצעות מחט סטרילית של 25 מד באזור העניין, הרימו והחזיקו את הגלובוס מהחלק האחורי של העין, באמצעות טפטפת סטרילית כדי לשמור על יציבות הגלובוס ולמנוע ממנו להתגלגל. עבור פצע שריטה, יש להזיז בעדינות מחט סטרילית בגודל 25 מד על פני הקרנית החשופה או ללחוץ בעדינות את המחט ישירות לתוך הקרנית המרכזית לפצע ניקוב, כדי להבטיח שהפצע לא יחדור את קרום מרתף הקרנית.מניחים את אזור הקרנית או הלימבל על מחליק הכיסוי באזור הפנימי של המחזיק, תוך אישור שהגלובוס ממוקם כראוי ושאתר העניין נמצא במגע עם כיסוי הזכוכית. ייצוב באמצעות הכיסוי המודפס בתלת-ממד המודבק למחזיק, באמצעות דבק. ואל תנסה להסיר את כדור הארץ, שכן זה עלול לגרום נזק לרקמות.הפעילו את המיקרוסקופ וקבעו את התא הסביבתי ל-35 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני וודאו את התא הלח. הניחו את מחזיק הכיסוי ואת הגלובוס המיוצב על במת המיקרוסקופ בתוך התא והתמונה הסביבתית, תוך שימוש בטכניקות הדמיה של תאים חיים. על ידי בדיקה של מדיית גידול נוספת על גבי הכיסוי כדי למנוע התייבשות ולשמור על כדאיות הרקמות, ולהבטיח שיש מספיק מדיום בבאר כדי לכסות את כדור הארץ במחזיק.התחל ניסויים באמצעות טכניקות הדמיה של תאים חיים, תוך שימוש בהגדרות לייזר בהספק נמוך כדי לשמר את הרקמה ולמנוע נזק לרקמות ומטרות מתאימות לניסויים ממושכים. הקלט ושמור נתונים בתבנית הקובץ המועדפת של קבצי CZI להקלטת נתונים. נתוני הדמיה באיכות גבוהה של מבנה רב-שכבתי התקבלו עבור קרנית X vivo, מיוצבת באמצעות מחזיק מודפס בתלת-ממד, המדגימה אירועי איתות סידן בשכבות האפיקליות, הבסיסיות והסטרומליות של הקרנית.תמונות Z-stack של קרנית, משותקת במחזיק המודפס בתלת-ממד, בפצע שריטה, התקבלו כדי להמחיש את קרומי התאים ואת איתות הסידן לאורך שכבות הקרנית וגיוס הסידן במישורי Z שונים. ניסוי בסדרת זמן של קרנית בוצע כדי לחקור את נדידת התאים לתוך מיטת הפצע במהלך תגובת הריפוי, וחשף תנועה מועטה של כדור הארץ בכיווני X, Y או Z. זה היה ציין כי על ידי הצבת כדור הארץ במחזיק, אזורים שונים של הקרנית, הן במרכז והן באזור הלימבל הקרנית ניתן לדמיין.פרוטוקול זה מאפשר לנו לדמות עיניים ממודלים של מחלות המציגות הבדלים בריפוי פצעים. אנו יכולים לאפיין סטיות באיתות התא ותנועתיות ברקמה חיה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Live-Cell Imaging of Intact Ex Vivo Globes Using a Novel 3D Printed Holder

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

הקרנת תפוקה גבוהה של אנזימים פחמימות-משפיל שימוש רומן מסיסים chromogenic המצע Assay ערכות

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

הדמיה סופר-רזולוציה מולקולה בודדת של 4,5-bisphosphate phosphatidylinositol בקרום פלזמה עם רומן פלורסנט בדיקות

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

זיהוי של חלבונים קושרי מולקולה קטנים בסביבה נייד Native ידי תיוג Live- תא Photoaffinity

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

קרום המוח Fractation: An<em&gt; אקס ויוו</em&gt; גישה כדי להעריך לוקליזציה חלבון subsynaptic

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Glycoproteomics של מטריקס: שיטה Intact ניתוח Glycopeptide באמצעות ספקטרומטריית מסה

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

קרינה פלואורסצנטית Live-תא הדמיה של שלמה וגטטיבי תא מחזור של חיידק חברתית גידול איטי Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

ללא כיול במבחנה כימות של חלבון ההומו-oligomerization באמצעות מכשור מסחרי ותוכנות אנליזה של בהירות חינם, קוד פתוח

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

זיהוי של סובסטרטים קינאז CK2 הרומן תוך שימוש בגישה הביוכימי רב-תכליתי

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

בשנת הדמיה Vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

מחזיק מדגם All-in-one עבור קריסטלוגרפיה Macromolecular X-ray עם פיזור רקע מינימלי

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...