Name: live-cell imaging of intact ex vivo globes using a novel 3d printed holder
Uploaded: 2022-10-06T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-Cell Imaging of Intact Ex Vivo Globes Using a Novel 3D Printed Holder at JoVE.com

Vorremmo riconoscere il NIH per il seguente sostegno di sovvenzione: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) e 5T32GM008541-24 (KS). Vorremmo anche riconoscere il Massachusetts Lions Eye Research Fund e il New England Corneal Transplant Fund.

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dall'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia per l'uso di animali nella cura oftalmica e nella ricerca sulla visione e dal protocollo IACUC dell'Università di Boston (201800302).
1. Progettazione dei supporti stampati in 3D e della barra di copertura
<ol><li>Progetta i supporti stampati in 3D e la barra di copertura tenendo conto del diametro medio dei globi del mouse e stampa in 3D il design (...

<ol>
	<li>Kneer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fat+diet+induces+pre-type+2+diabetes+with+regional+changes+in+corneal+sensory+nerves+and+altered+P2X7+expression+and+localization.">High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization.</a> Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+Ca2++mobilizations:+A+quantitative+approach+to+predict+their+importance+in+cell-cell+communication+and+wound+healing.">Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing.</a> PLoS One. 14 (4), 0213422 (2019).</li><li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals.">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).</li><li>Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors+but+not+gap+junctions+play+a+role+in+injury-induced+Ca2++waves+in+epithelial+cells.">Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+changes+in+Ca(2+)+mobilization+and+protein+phosphorylation+implicated+in+impaired+wound+healing.">Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).</li><li>Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2Y2+receptor+mediates+the+epithelial+injury+response+and+cell+migration.">The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).</li><li>Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collapse+of+global+neuronal+states+in+Caenorhabditis+elegans+under+isoflurane+anesthesia.">Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia.</a> Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).</li><li>Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+gentle+hydrogel+encapsulation+of+living+organisms+enables+long-term+microscopy+over+multiple+hours.">Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours.</a> Communications Biology. 1, 73 (2018).</li><li>Rhodes, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pannexin1:+Role+as+a+sensor+to+injury+is+attenuated+in+pretype+2+corneal+diabetic+epithelium.">Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium.</a> Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338 (2021).</li><li>Segars, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+dependent+changes+in+corneal+epithelial+cell+signaling.">Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721 (2022).</li><li>Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+epithelial+and+stromal+corneal+stiffness+occur+with+age+and+obesity.">Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity.</a> Bioengineering. 7 (1), 14 (2020).</li><li>Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinoreceptor+P2X7+regulation+of+Ca(2+)+mobilization+and+cytoskeletal+rearrangement+is+required+for+corneal+reepithelialization+after+injury.">Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury.</a> The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).</li><li>Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+euthanasia+and+enucleation+on+mouse+corneal+epithelial+axon+density+and+nerve+terminal+morphology.">The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology.</a> The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).</li></ol>

Questo protocollo descrive una tecnica di imaging cellulare vivo che utilizza un supporto stampato in 3D per stabilizzare e immobilizzare gli occhi degli animali intatti. È progettato per aggirare diversi svantaggi significativi riconosciuti con precedenti protocolli di imaging di cellule vive del tessuto corneale ex vivo . Questo protocollo offre molti vantaggi per l'imaging di cellule vive di globi intatti. Riduce significativamente i danni tissutali non necessari che potrebbero interferire con la risposta di...

Cornea La cornea è una struttura avascolare chiara che copre la superficie anteriore dell'occhio che rifrange la luce per consentire la visione e protegge l'interno dell'occhio dai danni. Poiché la cornea è esposta all'ambiente, è suscettibile di danni sia da cause meccaniche (graffi) che da infezioni. Una lesione corneale in un paziente altrimenti sano guarisce in genere entro 1-3 giorni. Tuttavia, nei pazienti con condizioni di base tra cui deficit di cellule staminali limbari e diabete di tipo II, il processo di guarigione della ferita corneale può essere notevolmente prolungato1. Poiché la cornea è altamente innervata, queste ulcere corneali non cicatrizzanti e le erosioni corneali ricorrenti sono molto dolorose e diminuiscono notevolmente la qualità della vita dei pazienti che le sperimentano1.
Segnalazione cellulare Quando una cornea altrimenti sana è ferita, gli eventi di segnalazione del calcio nelle cellule adiacenti alla ferita precedono e inducono la migrazione cellulare nel letto della ferita, dove chiudono la lesione senza il rischio di cicatrici 2,3. Questi eventi di segnalazione sono stati ben caratterizzati in modelli di coltura cellulare epiteliale corneale utilizzando l'imaging cellulare vivo2. Gli esperimenti preliminari dimostrano significativamente più segnalazione di calcio dopo la lesione nelle cellule non diabetiche rispetto alle cellule diabetiche. Tuttavia, la caratterizzazione degli eventi di segnalazione cellulare nei globi ex vivo si è rivelata una sfida tecnica.
Imaging cellulare vivo Studi precedenti hanno registrato con successo eventi di segnalazione del calcio da modelli di coltura cellulare in vitro di guarigione della ferita corneale 4,5,6. Lo sviluppo di una metodologia per produrre immagini di alta qualità di questi eventi di segnalazione in tessuto ex vivo è di grande interesse perché consentirebbe lo studio di questi eventi in un sistema più complesso e realistico. Gli approcci precedenti hanno comportato la dissezione della cornea seguita dall'immobilizzazione in un gel PEG indotto dai raggi UV 7,8,9. L'immobilizzazione è un passo essenziale ma impegnativo quando si lavora con tessuti vivi, in quanto deve rimanere vitale e idratato per tutto il corso dell'esperimento. Inoltre, l'immobilizzazione non deve danneggiare il tessuto. Mentre la soluzione PEG immobilizzava il tessuto, la risoluzione e la qualità delle immagini prodotte non erano coerenti. Pertanto, i supporti stampati in 3D sono stati sviluppati per immobilizzare globi intatti per produrre immagini di qualità superiore con meno rischi di danni ai tessuti.
L'approccio È stato sviluppato un esclusivo supporto stampato in 3D per immobilizzare globi ex vivo intatti per l'imaging di cellule vive. Questo supporto previene i danni da due fonti principali: consente l'imaging di un globo enucleato senza la necessità di sezionare la cornea ed elimina l'esposizione alla luce UV. Senza queste fonti di danno, le immagini ottenute rappresentavano più accuratamente la risposta alle lesioni da graffio fatte sperimentalmente. Inoltre, il supporto stampato in 3D è stato calibrato alle dimensioni precise dell'occhio murino. Ciò ha fornito un adattamento molto migliore rispetto all'immobilizzazione nella soluzione PEG, portando a un'immagine di qualità superiore a obiettivi a bassa potenza a causa della diminuzione del movimento dei tessuti. Una barra di copertura attaccata alla parte superiore del supporto assicura che il globo rimanga immobile per tutta la durata dell'esperimento e che non vi sia alcuno spostamento del globo quando vengono applicati terreni di crescita per mantenere l'idratazione e la vitalità. La possibilità di stampare il supporto su dimensioni precise ci consente anche di generare una vestibilità ottimale per occhi murini di diverse dimensioni a causa dell'età o dello stato di malattia. Questa tecnologia può essere applicata in modo più ampio per sviluppare supporti per gli occhi di diverse specie in base alle loro dimensioni.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic</td>
			<td>Creality (Shenzen, China)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Material for holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated</td>
			<td>MatTek Corporation (Ashland, MA)</td>
			<td>P35GC-1.5-14-C</td>
			<td>Well for imaging.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autodesk Fusion 360 software</td>
			<td>Autodesk (San Rafael, CA).</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Software used for printing the holders.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>305124</td>
			<td>For experimentally-induced wounds to the globes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask DeepRed</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>C10046</td>
			<td>Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Home Super Glue</td>
			<td>Walgreens (Deerfield, IL)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For attaching the holder to the imaging well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ender 3 Pro 3D printer&#160;</td>
			<td>Creality (Shenzen, China)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For printing the holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI/ImageJ</td>
			<td>ImageJ (Bethesda, MD)</td>
			<td>License Number: GPL2</td>
			<td>Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte Serum-Free Medium</td>
			<td>Gibco (Waltham, MA)</td>
			<td>17005042</td>
			<td>25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 &#181;g/mL, respectively) added to medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phophate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning, Medlabtech (Manassas, VA)</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>Used to wash excess stain off of corneas before imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>20x magnification objective was used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell imaging of intact ex vivo globes using a novel 3d printed holder

La guarigione della ferita epiteliale corneale è un processo migratorio avviato dall'attivazione dei recettori purinergici espressi sulle cellule epiteliali. Questa attivazione si traduce in eventi di mobilizzazione del calcio che si propagano da cellula a cellula, che sono essenziali per iniziare la motilità cellulare nel letto della ferita, promuovendo un'efficiente guarigione della ferita. Il laboratorio Trinkaus-Randall ha sviluppato una metodologia per l'imaging della risposta di guarigione delle ferite corneali in globi murini ex vivo in tempo reale. Questo approccio prevede l'enucleazione di un globo intatto da un topo che è stato eutanasia secondo protocolli stabiliti e l'incubazione immediata del globo con un colorante indicatore di calcio. Una contromacchia che colora altre caratteristiche della cellula può essere applicata in questa fase per aiutare con l'imaging e mostrare punti di riferimento cellulari. Il protocollo ha funzionato bene con diversi coloranti di cellule vive utilizzati per la controcolorazione, tra cui l'actina SiR per colorare l'actina e la colorazione della membrana plasmatica rosso intenso per colorare la membrana cellulare. Per esaminare la risposta a una ferita, l'epitelio corneale viene ferito utilizzando un ago da 25 G e i globi vengono posizionati in un supporto stampato in 3D. Le dimensioni del supporto stampato in 3D sono calibrate per garantire l'immobilizzazione del globo per tutta la durata dell'esperimento e possono essere modificate per ospitare occhi di diverse dimensioni. L'imaging cellulare vivo della risposta della ferita viene eseguito continuamente a varie profondità in tutto il tessuto nel tempo utilizzando la microscopia confocale. Questo protocollo ci consente di generare immagini ad alta risoluzione e di qualità pubblicativa utilizzando un obiettivo aereo 20x su un microscopio confocale. Altri obiettivi possono essere utilizzati anche per questo protocollo. Rappresenta un miglioramento significativo nella qualità dell'imaging di cellule vive in globi murini ex vivo e consente l'identificazione di nervi ed epitelio.

Questo protocollo è stato utilizzato per produrre costantemente dati e immagini di qualità di pubblicazione10. Le immagini ottenute rappresentano un miglioramento significativo rispetto agli approcci precedenti (Figura 2). Utilizzando il supporto stampato in 3D, le immagini possono essere catturate attraverso gli strati della cornea e si può osservare la mobilizzazione del calcio in diversi piani z (Figura 3). Questo approccio è stato...

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Live-Cell Imaging of Intact Ex Vivo Globes Using a Novel 3D Printed Holder

Il presente lavoro descrive un nuovo protocollo sperimentale che utilizza un supporto stampato in 3D per consentire l'imaging di cellule vive ad alta risoluzione di globi enucleati. Attraverso questo protocollo, l'attività di segnalazione del calcio cellulare nell'epitelio corneale ferito da globi ex vivo può essere osservata in tempo reale.

Imaging di cellule vive di globi ex vivo intatti utilizzando un nuovo supporto stampato in 3D

Corneal epithelial wound healing is a migratory process initiated by the activation of purinergic receptors expressed on epithelial cells. This activation ...

Il supporto stampato in 3D utilizzato in questo protocollo ci consente di monitorare la segnalazione cellulare a breve termine e gli eventi di migrazione cellulare a lungo termine nelle cornee ferite in tempo reale. Mantenendo il globo intatto, vitale e immobile, questo protocollo produce immagini live di alta qualità delle cellule corneali, inclusi l'epitelio e i nervi. Il supporto stampato in 3D potrebbe essere facilmente modificato per globi di varie dimensioni e specie.Possiamo anche orientare gli occhi in modo diverso per visualizzare altre regioni o eseguire esperimenti di nano indentazione. Per iniziare, dopo aver rimosso la testa di un topo eutanasiato, posizionarlo immediatamente sul ghiaccio per preservare la vitalità del tessuto. Quindi enucleare i globi appiandolo, usando una pinzetta.E tagliare il nervo ottico usando le forbici da dissezione appena sotto dove è tenuto dalle pinzette. Incubare i globi in due millilitri del mezzo in un piatto di coltura cellulare P-35, incluso un indicatore di calcio e / o una macchia di membrana cellulare per un'ora in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica in condizioni di scarsa illuminazione, assicurando che i globi siano immersi nel mezzo di colorazione per una colorazione uniforme. Per far aderire i supporti a una linguetta di copertura inferiore in vetro pulito, lavare il supporto in etanolo al 70% e posizionare la colla sul supporto.Quindi, far aderire il supporto alla linguetta del coperchio inferiore in vetro, assicurandosi che non ci sia colla all'interno dell'area interna del supporto, poiché la colla può fluoresce, complicando l'imaging. Dopo che la colla si è solidificata, verificare che il supporto sia saldamente contro il vetrino di copertura. Rimuovere i globi dalla soluzione colorante utilizzando i contagocce sterili, avendo cura di prevenire danni tissutali alla regione di interesse.Lavare i globi per cinque minuti a temperatura ambiente, utilizzando soluzione salina tamponata con fosfato sterile per rimuovere la macchia in eccesso e posizionare i globi nel mezzo per il trasporto al microscopio. Per avvolgere i globi usando un ago sterile di calibro 25 nella regione di interesse, raccogliere e tenere il globo dalla parte posteriore dell'occhio, usando un contagocce sterile per mantenere stabile il globo e impedirgli di rotolare. Per una ferita da graffio, spostare delicatamente un ago sterile da 25 gauge attraverso la cornea esposta o premere delicatamente l'ago direttamente nella cornea centrale per una ferita da puntura, assicurandosi che la ferita non penetri la membrana basale corneale.Posizionare la cornea o la regione limbare sul vetrino nella zona interna del supporto, confermando che il globo sia posizionato correttamente e che il sito di interesse sia in contatto con il vetrino di copertura. Stabilizzare utilizzando la copertina stampata in 3D aderente al supporto, utilizzando la colla. E non cercare di rimuovere il globo, in quanto ciò potrebbe causare danni ai tessuti.Accendere il microscopio e impostare la camera ambientale a 35 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica e verificare la camera umidificata. Posizionare il portavetrino e il globo stabilizzato sul palco del microscopio all'interno della camera ambientale e dell'immagine, utilizzando tecniche di imaging cellulare dal vivo. Mediante vet, ulteriori mezzi di crescita sul vetrino di copertura per prevenire la disidratazione e mantenere la vitalità dei tessuti, assicurando che ci sia abbastanza terreno nel pozzo per coprire il globo nel supporto.Iniziare gli esperimenti utilizzando tecniche di imaging di cellule vive, utilizzando impostazioni laser a bassa potenza per preservare il tessuto e prevenire danni ai tessuti e obiettivi appropriati per esperimenti di lunga durata. Registra e salva i dati nel formato di file preferito dei file CZI per la registrazione dei dati. Dati di imaging di alta qualità della struttura multistrato sono stati ottenuti per la cornea X vivo, stabilizzata con un supporto stampato in 3D, dimostrando eventi di segnalazione del calcio negli strati apicale, basale e stromale della cornea.Sono state ottenute immagini Z-stack di una cornea, immobilizzata nel supporto stampato in 3D, in una ferita da graffio per visualizzare le membrane cellulari e la segnalazione del calcio attraverso gli strati della cornea e la mobilizzazione del calcio in diversi piani Z. È stato eseguito un esperimento di serie temporali di una cornea per studiare la migrazione cellulare nel letto della ferita durante la risposta di guarigione, rivelando poco movimento del globo nelle direzioni X, Y o Z. È stato osservato che posizionando il globo nel supporto, è possibile visualizzare diverse regioni della cornea, sia nella regione limbare centrale che in quella corneale.Questo protocollo ci consente di visualizzare gli occhi da modelli di malattia che mostrano differenze nella guarigione delle ferite. Possiamo caratterizzare le aberrazioni nella segnalazione cellulare e la motilità nei tessuti vivi.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Live-Cell Imaging of Intact Ex Vivo Globes Using a Novel 3D Printed Holder

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