Name: plastoglobule lipid droplet isolation from plant leaf tissue and cyanobacteria
Uploaded: 2022-10-06T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria at JoVE.com

يتم دعم البحث في مجموعة مختبر Lundquist بمنح من NSF (MCB-2034631) ووزارة الزراعة الأمريكية (MICL08607) إلى P.K.L. يشكر المؤلفون الدكتورة كاري هيزر (جامعة ولاية ميشيغان) على دعمها في تطوير طريقة عزل البلاستوغلوبول البكتيري الأزرق.

1. عزل البلاستوغلوبول الخام
<ol><li>استخراج البلاستوغلوبول الخام من أنسجة أوراق الذرة غير المجهدة<ol><li>احصل على ست شتلات ذرة صحية يبلغ عمرها حوالي 3 أسابيع وفي مرحلة نمو V5 تقريبا ، وتزن حوالي 120 جم.</li>
		<li>قم بقص جميع الأوراق الموجودة في قاعدة الساق ، ثم اغمسها بسرعة في حمام جليدي ، وانق...

<ol>
	<li>Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+throughout+the+evolutionary+tree.">Lipid droplets throughout the evolutionary tree.</a> Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).</li><li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+network+of+the+Arabidopsis+plastoglobule+proteome+based+on+quantitative+proteomics+and+genome-wide+coexpression+analysis.">The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis.</a> Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).</li><li>Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+of+plastoglobules+in+chloroplasts+and+chromoplasts.+A+surprising+site+for+differential+accumulation+of+metabolic+enzymes.">Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes.</a> Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).</li><li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+plastoglobule+kinases+ABC1K1+and+ABC1K3+causes+conditional+degreening,+modified+prenyl-lipids,+and+recruitment+of+the+jasmonic+acid+pathway.">Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway.</a> The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).</li><li>Vidi, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tocopherol+cyclase+(VTE1)+localization+and+vitamin+E+accumulation+in+chloroplast+plastoglobule+lipoprotein+particles.">Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+and+the+fine+structure+of+plastids.">Plastoglobuli and the fine structure of plastids.</a> Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).</li><li>Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+in+different+types+of+plastids+from+Allium+cepa+L.">Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L.</a> Planta. 72 (1), 1-13 (1966).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Plastoglobuli+von+Spinat,+ihre+Gr&#246;&#946;e,+Isolierung+und+Lipochinonzusammensetzung.">Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gr&#246;&#946;e, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung.</a> Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+and+lipoquinone+content+of+chloroplasts+from+Cereus+peruvianus+(L)+Mill.">Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill.</a> Planta. 87 (4), 304-310 (1969).</li><li>Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromoplast+ultrastructure+of+Capsicum+carotenoid+mutants+I.+Ultrastructure+and+carotenoid+composition+of+a+new+mutant.">Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant.</a> Zeitschrift f&#252;r Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).</li><li>Hansmann, P., Sitte, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+molecular+structure+of+chromoplast+globules+of+Viola+tricolor.">Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor.</a> Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).</li><li>Steinmuller, D., Tevini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+function+of+plastoglobuli+:+I.+Isolation+and+purification+from+chloroplasts+and+chromoplasts.">Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts.</a> Planta. 163 (2), 201-207 (1985).</li><li>Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proteins+associated+with+plastoglobules+isolated+from+pea+(Pisum+sativum+L.)+chloroplasts.">Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts.</a> Planta. 208 (1), 107-113 (1999).</li><li>Grennan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobule+proteome.">Plastoglobule proteome.</a> Plant Physiology. 147 (2), 443-445 (2008).</li><li>Peramuna, A., Summers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+occurrence+of+lipid+droplets+in+the+cyanobacterium+Nostoc+punctiforme.">Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme.</a> Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).</li><li>Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobules+are+lipoprotein+subcompartments+of+the+chloroplast+that+are+permanently+coupled+to+thylakoid+membranes+and+contain+biosynthetic+enzymes.">Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes.</a> The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).</li><li>Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid+lipid+droplets+at+the+crossroads+of+prenylquinone+metabolism.">Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).</li><li>Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plastoglobules+in+metabolite+repair+in+the+tocopherol+redox+cycle.">Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).</li><li>Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+functional+connections+between+cytoplasmic+and+chloroplast+triacylglycerol+storage.">Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage.</a> Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).</li><li>Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+isolation+from+Arabidopsis+thaliana+leaves.">Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves.</a> Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).</li><li>Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+changes+of+Arabidopsis+thaliana+plastoglobules+facilitate+thylakoid+membrane+remodeling+under+high+light+stress.">Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress.</a> Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).</li><li>Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plastoglobule-localized+protein+AtABC1K6+is+a+Mn2+-dependent+kinase+necessary+for+timely+transition+to+reproductive+growth.">The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth.</a> Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).</li><li>Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+topology+and+membrane+interaction+characteristics+of+plastoglobule-localized+AtFBN1a+and+AtLOX2.">Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2.</a> Plant Signalling &amp; Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).</li><li>Besagni, C., Piller, L. E., Br&#233;h&#233;lin, C., Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plastoglobules+from+Arabidopsis+Plastids+for+Proteomic+Analysis+and+Other+Studies.">Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies.</a> Chloroplast Research in Arabidopsis. , 223-239 (2011).</li><li>Yang, H., Murphy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+preparation,+sucrose+density+gradients+and+two-phase+separation+fractionation+from+five-day-old+Arabidopsis+seedlings.">Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings.</a> Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).</li><li>Kelekar, P., Wei, M., Yang, P., Pazour, G. J., King, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Radial+Spoke+Proteins.">Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins.</a> Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. 92, 181-196 (2009).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear-encoded+synthesis+of+the+D1+subunit+of+photosystem+II+increases+photosynthetic+efficiency+and+crop+yield.">Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield.</a> Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy+reveals+that+senescence+induces+in-situ+and+vacuolar+degradation+of+plastoglobules+in+aging+watermelon+leaves.">Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves.</a> Micron. 80, 135-144 (2016).</li><li>Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+FIBRILLIN4+gene+expression+in+apple+decreases+plastoglobule+plastoquinone+content.">Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content.</a> PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).</li><li>Singh, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIBRILLIN4+is+required+for+plastoglobule+development+and+stress+resistance+in+apple+and+Arabidopsis.">FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gardenia+carotenoid+cleavage+dioxygenase+4a+is+an+efficient+tool+for+biotechnological+production+of+crocins+in+green+and+non-green+plant+tissues.">Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues.</a> Plant Biotechnology Journal. , (2022).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian Journal of Biochemistry &amp; Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li></ol>

لتقليل التغيرات الفسيولوجية / الكيميائية الحيوية في المادة وحماية بعض أصباغ الدهون الضوئية والحرارية التي تعد مكونا غنيا في البلاستوغلوبولات ، من الأهمية بمكان إجراء العزل عند 4 درجات مئوية ومحمي من الضوء. كما هو موضح أعلاه ، يتم تنفيذ الخطوات الأولية في الغرفة الباردة تحت مصباح أمان باس?...

ظهر الفهم الحالي لتكوين البلاستوغلوبول ووظيفته من خلال الدراسات التفصيلية للبروتين والدهون1،2،3،4،5. وقد ساعدت مثل هذه الدراسات بشكل كبير من خلال طريقة سريعة وفعالة للعزل تعتمد على كثافتها المنخفضة جدا للفصل الفعال باستخدام تدرجات السكروز. تم تحقيق الطرق الأولية لعزل البلاستوغلوبول من أنواع مثل شجرة الزان (Fagus sylvatica) ، مكنسة سكوتش (Sarothamnus scoparius) ، البصل (Allium cepa) ، السبانخ (Spinacia oleracea) ، بانسي (فيولا الالوان الثلاثة) ، الفلفل (الفليفلة السنوية) ، والبازلاء (Pisum sativum)6،7،8،9،10،11 ، 12،13. تم تقديم طريقة محدثة لعزل البلاستوغلوبولات البلاستوبولية الخضراء بطريقة أكثر كفاءة وأفضل إنتاجية بواسطة Ytterberg et al.3,14. بينما تم توظيفنا في البداية لدراسة البلاستوغلوبولات في البلاستيدات الخضراء لأوراق أرابيدوبسيس ثاليانا ، فقد استخدمنا بنجاح هذه الطريقة المحدثة لأنسجة الأوراق السليمة لأنواع نباتية أخرى ، أحادية الفلقة وثنائية الفلقة ، بما في ذلك الذرة (Zea mays) ، والطماطم (Solanum lycopersicum) ، وعشب الحب (Eragrostis nindensis) ، والبروم الكاذب الأرجواني (Brachypodium distachyon) ، والتبغ البري (Nicotiana benthamiana ; النتائج غير المنشورة). علاوة على ذلك ، تم تكييف طريقة العزل بنجاح مع البلاستوغلوبولات من البكتيريا الزرقاء ، بما في ذلك Synechocystis sp. PCC 6803 و Anabaena sp. PCC 712015 ، وأنسجة الأوراق المجففة لنبات القيامة ، E. nindensis.
ترتبط البلاستيدات الخضراء في أنسجة الأوراق السليمة ماديا بأغشية الثايلاكويد16. على الرغم من هذه الاستمرارية الفيزيائية ، تحافظ المقصورتان الفرعيتان للبلاستيدات الخضراء على تركيبات دهنية وبروتينية مميزة ، على الرغم من اقتراح التبادل المنظم للدهون والبروتين بين الجزأين2،4،17،18،19. في الواقع ، تم اقتراح نموذج نصف نصفي مثير للاهتمام مؤخرا لتهريب الدهون المحايدة بين البلاستيدات الخضراء والسيتوسول19. نظرا للاستمرارية الفيزيائية للبلاستوغلوبولات والثايلاكويدات ، تبدأ طريقة العزل بأنسجة الأوراق السليمة بجمع مستحضر ثايلاكويد خام محبب ، والذي يتم صوتنة لاحقا لفصل البلاستوغلوبولات عن الثايلاكويدات ، وهو ما يتناقض مع الطرق المستخدمة لعزل قطرات الدهون الخلوية20 . ثم يقوم الطرد المركزي الفائق على وسادة السكروز بتعويم البلازموبوليات منخفضة الكثافة عبر السكروز ، مما يفصلها بشكل فعال عن الثايلاكويدات والنوى وغيرها من المواد عالية الكثافة. في المقابل ، من الواضح أن البلاستوغلوبولات في البكتيريا الزرقاء ، وكذلك تلك الموجودة في أنسجة الأوراق المجففة ، موجودة في الجسم الحي في شكل عائم حر. ومن ثم ، فإن عزلتهم تنطوي على الطفو مباشرة على تدرج السكروز. توضح هذه المقالة طريقة العزل عن أنسجة الأوراق السليمة وتوضح كذلك نوعين مختلفين يمكن استخدامهما لعزل البلاستوغلوبولات من أنسجة الأوراق المجففة أو مزارع البكتيريا الزرقاء ، مما يوسع بشكل كبير الاتساع الفسيولوجي والسياق التطوري الذي يمكن فيه دراسة البلاستوغلوبولات.
يمكن لاحقا استخدام البلاستوغلوبولات المعزولة لأي عدد من التحليلات النهائية للتحقيق في الخصائص الجزيئية. لقد استخدمنا البلاستوغلوبولات المعزولة من أنسجة أوراق A. thaliana لإجراء تحليل مكثف للبروتين والدهون في ظل ظروف بيئية أو أنماط وراثية مختلفة ، مما يدل على التعديل الانتقائي لتكوين البروتين والدهون في التكيف مع الإجهاد2،4،21،22. بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء فحوصات كيناز في المختبر التي تظهر نشاط الفسفرة العابرة المرتبط بالبلازموغلوبولات المعزولة 22 ، وتم التحقيق في حالات قلة القسيمات لمكونات البروتين باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي الأصلي 21 ، وتم إجراء فحوصات حلاقة البروتياز23.
الفائدة الأساسية لهذه الطريقة هي السرعة النسبية للإجراء. في تجربتنا ، يمكن إكمال البروتوكولات الموضحة أدناه بالكامل في غضون 4 ساعات تقريبا. تم وصف طريقة بديلة لعزل البلاستوغلوبولات من أنسجة الأوراق ، والتي تسمح بالعزل المتزامن للأجزاء الفرعية الأخرى من البلاستيدات الخضراء24. تقدم هذه الطريقة البديلة بعض المزايا الواضحة عندما تكون المقارنة الكمية مع الأجزاء الفرعية الأخرى للبلاستيدات الخضراء ضرورية أو مرغوبة. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة البديلة هي أيضا أكثر مملة وستوفر عائدا أقل بكثير من plastoglobules المعزولة من كميات مماثلة من أنسجة الأوراق. عندما يكون الهدف هو إجراء دراسة مركزة للبلاستوغلوبولات ، فإن المنهجية الموضحة هنا هي الخيار الأمثل. ومع ذلك، يمكن جمع إجمالي حصص الأوراق والثايلاكويد الخام أثناء تحضير العينة، ويوصى بشدة بالقيام بذلك، للحصول على عينات مرجعية للمقارنة اللاحقة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AEBSF</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antipain.2HCl</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>H-1765.0050BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>A6106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B8385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>35675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Proliant Biological</td>
			<td>68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chymostatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eragrostis nindensis</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-64</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure cell (model FA-079)</td>
			<td>SLM/Aminco</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron shaking incubator</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-ramidon.2 Na</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>M16050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced Cysteine</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>101444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ortho-vanadate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyrophosphate &#183; 10H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18&#34;</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synechocystis sp. PCC 6803</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-TL Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A95761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring Blender (1.2 L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58977-227</td>
			<td>Commercial blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zea mays</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plastoglobule lipid droplet isolation from plant leaf tissue and cyanobacteria

قطرات الدهون Plastoglobule هي مقصورة فرعية ديناميكية من البلاستيدات الخضراء النباتية والبكتيريا الزرقاء. توجد في كل مكان بين أنواع التمثيل الضوئي ، ويعتقد أنها تلعب دورا مركزيا في تكييف وإعادة تشكيل غشاء الثايلاكويد في ظل ظروف بيئية سريعة التغير. سهلت القدرة على عزل البلاستوغلوبولات عالية النقاء دراستها إلى حد كبير من خلال منهجيات البروتين والدهون وغيرها. مع البلاستوغلوبولات ذات النقاء العالي والعائد ، من الممكن التحقيق في تكوين الدهون والبروتين ، والنشاط الأنزيمي ، وطوبولوجيا البروتين ، من بين الخصائص الجزيئية المحتملة الأخرى. تقدم هذه المقالة بروتوكولا سريعا وفعالا لعزل البلاستوغلوبولات من البلاستوبلاستيدات الخضراء لأنسجة الأوراق النباتية وتقدم اختلافات منهجية لعزل البلاستوغلوبولات وهياكل قطرات الدهون ذات الصلة من أوراق الذرة ، وأنسجة الأوراق المجففة لنبات القيامة ، Eragrostis nindensis ، والبكتيريا الزرقاء ، Synechocystis س. PCC 6803. يعتمد العزل على الكثافة المنخفضة لهذه الجسيمات الغنية بالدهون ، مما يسهل تنقيتها عن طريق تعويم كثافة السكروز. ستثبت هذه المنهجية قيمتها في دراسة البلاستوغلوبولات من الأنواع المتنوعة.

عند الانتهاء من الخطوة 1 من البروتوكول ، يجب أن يكون المرء قادرا على رؤية كمية كبيرة من مادة البلاستوغلوبول / قطرات الدهون تطفو على (أو بالقرب من) الطبقة العليا من وسادة السكروز (الشكل 1B-C). يمكن أيضا جمع كسور أخرى في هذه المرحلة. على سبيل المثال ، سيتم تكوير ?...

Watch this Scientific Journal Video about Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria at JoVE.com

Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

يتم تقديم بروتوكول سريع وفعال لعزل قطرات الدهون plastoglobule المرتبطة بالكائنات الحية الضوئية المختلفة. يعد التحضير الناجح للبلازموغلوبولات المعزولة خطوة أولى حاسمة تسبق التحقيقات الجزيئية التفصيلية مثل التحليلات البروتينية والدهون.

عزل قطرات الدهون Plastoglobule من أنسجة أوراق النبات والبكتيريا الزرقاء

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...

عزل البلاستوغلوبولات عالية النقاء أمر بالغ الأهمية لدراستهم. يتم تقديم بروتوكول سريع وفعال لعزلتهم يسهل تحقيقهم الكيميائي الحيوي في المصب. الفائدة الأساسية لهذه الطريقة هي السرعة النسبية للإجراءات وقدرتها على التكيف مع العديد من الأنواع النباتية والظروف البيئية.يجب توخي الحذر بشكل خاص أثناء تعليق صوتنة الثايلاكويد لضمان القوة الكافية لتجريد البلاستوغلوبولات من الثايلاكويدات ومع الاستخراج اللاحق للبلاستوغلوبولات من تدرج السكروز. سيوضح هذا الإجراء الدكتور Elsinraju Devadasu ، باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري ، و Febri Susanto ، طالب الدكتوراه في مختبري. ابدأ بالحصول على شتلات عمرها ثلاثة أسابيع من ستة ذرة صحية ، لها مرحلة نمو V5 وتزن حوالي 120 جراما.قم بقص جميع الأوراق عند قاعدة الساق واغمسها بسرعة في حمام جليدي قبل نقلها إلى الغرفة الباردة. من خلال العمل تحت مصباح أمان أخضر ، قم بإزالة أوراق الذرة من الحمام الجليدي وقم بقصها إلى قطع أصغر بحجم خمسة في خمسة سنتيمترات باستخدام المقص. قم بطحن نصف أنسجة الأوراق المقطوعة برفق ودقة في 350 مل من المخزن المؤقت للطحن على مستوى أقل من سبعة على خلاط تجاري.ابدأ الخلاط وأوقفه خمس إلى ست مرات لضمان قطع جميع الأوراق. قم بتصفية التجانس من خلال طبقة واحدة من قماش نايلون 25 ميكرون على قمع كبير إلى أربع زجاجات طرد مركزي سعة 250 ملليلتر. بعد تكرار خطوة المزج مع أنسجة الأوراق المقطوعة المتبقية ، قسم الراشح بالتساوي بين الزجاجات الأربع.قم بإزالة حصة من مرشح الورقة وضعها جانبا ليتم تخزينها كعينة إجمالية تمثيلية للورقة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للمرشح لمدة ست دقائق عند 1،840 G وأربع درجات مئوية. اسكب المادة الطافية الناتجة ، وبحركات دوامية لطيفة للفرشاة ، أعد تعليق الحبيبات في 12 ملليلتر من R 0.2 المتوسط ، الذي يحتوي على 0.2 سكروز مولار.بعد إعادة تعليق الحبيبات في زجاجة واحدة ، أضف التعليق إلى الزجاجة التالية وكرر إعادة التعليق لتجميع المعلقات في زجاجة واحدة. قم بتوزيع التعليق المجمع بين ستة أنابيب طرد مركزي فائقة سعة ثلاثة ملليلتر ، ليصل الحد الأقصى لحجم 2.5 ملليلتر في كل أنبوب. ثم استخدم صوتنة الطرف بسعة 100٪لسونيكات كل أنبوب أربع مرات لمدة 10 ثوان لكل منهما.تأكد من إبقاء قرن الصوتنة مغمورا وبعيدا عن سطح السائل لمنع الزبد. حرك بوق الصوتنة ببطء لأعلى ولأسفل داخل التعليق خلال كل جولة. أثناء تبديل الأنابيب الأربعة ، أعد كل أنبوب إلى دلو ثلج بعد كل صوتنة للسماح للعينة بالتبريد.بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بالطرد المركزي لتعليق الثايلاكويد الخام الصوتي عند 150،000 G لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة سطح الوسادة باستخدام حقنة وإبرة قياس 22 واحصد الوسادة العائمة الصفراء والزيتية الناتجة من البلاستوغلوبولات الخام من وسادة السكروز. استرجع ما يقرب من 500 ميكرولتر من كل أنبوب وأودعها في أنبوب سعة 2.0 ملليلتر.جمع القسمة الثايلاكويد الخام قبل وبعد صوتنة وإطلاق البلاستوغلوبولات. بمجرد الانتهاء من ذلك ، إما أن تستمر في معالجة الأنسجة النباتية أو تخزين البلاستوغلوبولات الخام عند 80 درجة مئوية تحت الصفر وتنقيتها لاحقا. ينمو 50 ملليلتر من أنواع synechocystis PCC 6802 في وسائط BG11 لمدة 7 إلى 10 أيام للوصول إلى المرحلة الثابتة.باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، اضبط كثافة الخلية على كثافة بصرية تبلغ 2.0 عند 750 نانومتر. لإزالة السكريات ، الطرد المركزي 50 ملليلتر من الثقافة وإزالة المادة الطافية. كرر غسل الخلايا في 50 ملليلتر من المخزن المؤقت A مرتين.أعد تعليق الحبيبات المغسولة في 25 ملليلتر من المخزن المؤقت A وكسر الخلايا باستخدام خلية ضغط فرنسية عند 1،100 رطل بوصة مربعة. كرر العملية ثلاث مرات في الظروف الباردة حتى يتغير اللون المحلل من الأخضر إلى الأحمر والأزرق والأخضر تحت الضوء الأبيض. قم بإزالة حصص تجانس الخلية وضعه جانبا ليتم تخزينه كعينة خلية كلية تمثيلية.توزيع التجانس الناتج في ثمانية أنابيب الطرد المركزي الفائق ثلاثة ملليلتر مملوءة بحد أقصى 2.5 ملليلتر في كل أنبوب. تراكب هذا التجانس مع 400 ميكرولتر من متوسط R ، مما ينتج عنه تدرج خطوة. قم بموازنة الأنابيب بعناية عن طريق إضافة وسيط إضافي R حسب الضرورة قبل الطرد المركزي للأنابيب.تظهر الثايلاكويد والعضيات الأثقل الأخرى، بما في ذلك أي أجسام متعددة هيدروكسي ألكانوات، تكوين الكريات، بينما تشكل البلاستوغلوبولات وسادة زيتية صفراء على قمة تدرج السكروز أو بالقرب منه. حصاد الوسادة العائمة الناتجة من plastoglobules الخام مع حقنة ، كما هو موضح سابقا ، وإيداع الحصاد في أنبوب 2 ملليلتر. اكشط البلاستوغلوبولات من جانب جدار أنبوب الطرد المركزي الفائق بطرف إبرة إذا لزم الأمر.إما أن تستمر في معالجة البكتيريا الزرقاء أو تخزن البلاستوغلوبولات الخام عند 80 درجة مئوية تحت الصفر وتنقيتها لاحقا. لحصاد البلاستوغلوبولات النقية باستخدام طريقة معالجة الأنسجة النباتية ، قم بإعداد تدرج السكروز الموصوف سابقا باستخدام 500 ميكرولتر من البلاستوغلوبولات الخام ، و 400 ميكرولتر من المتوسط R 0.2 ، و 400 ميكرولتر من R.بعد الطرد المركزي ، احصد الوسادة العائمة الناتجة من البلاستوغلوبولات النقية في أنبوب سعة 2 ملليلتر. بعد نقث البلاستوغلوبولات النقية وتجميد القسمة في النيتروجين السائل ، قم إما بتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر أو تجفيفها بالتجميد إلى مسحوق جاف.لحصاد البلاستوغلوبولات النقية من البكتيريا الزرقاء ، قم بإنشاء تدرج السكروز ، كما ذكرنا سابقا ، باستخدام 500 ميكرولتر من البلاستوغلوبول الخام ، و 750 ميكرولتر من الوسط R 0.7 ، و 750 ميكرولتر من الوسط R 0.2. بعد الطرد المركزي ، اجمع البلاستوغلوبولات النقية في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر وقسمة البلاستوغلوبولات النقية. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بتجميد حصص البلاستوغلوبولات النقية في النيتروجين السائل وتخزينها مباشرة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر أو تجفيفها بالتجميد إلى مسحوق جاف.في هذه الطريقة ، شوهدت كمية كبيرة من مادة البلاستوغلوبول أو مادة قطرات الدهون تطفو على الطبقة العليا من وسادة السكروز. بعد الطرد المركزي اللاحق ، تم الحصول على البلاستوغلوبولات المنقاة عند أو بالقرب من سطح تدرج السكروز. بعد العزل الناجح للبلاستوغلوبولات ، أظهرت البقع المناعية التي تم تطويرها لتقييم النقاء باستخدام الأجسام المضادة التي أثيرت ضد أرابيدوبسيس ثاليانا فيبريلين 1 أ والوحدة الفرعية للنظام الضوئي أرابيدوبسيس ثاليانا II D1 أن متماثلات الفيبريلين كانت مرتبطة في المقام الأول بالثايلاكويدات من البلاستوغلوبولات.لضمان الاستخراج الفعال والمركز للوسادة العائمة ، ضع فتحة إبرة المحقنة أسفل السطح السائل للمخزن المؤقت مباشرة أثناء غمرها بالكامل ، ثم اسحبها برفق. عينات البلاستوغلوبول المعزولة قابلة للدراسات البروتينية أو الدهنية اللاحقة وقد استخدمت لإثبات التغيرات في تكوين البروتين والدهون المستهدفة في ظل ظروف بيئية مختلفة. سهلت هذه التقنية دراسات جديدة للبلاستوغلوبول ، بما في ذلك اكتشاف نشاط كيناز البروتين المرتبط ووجود مجمعات البروتين قليل القسيمات من خلال التحقيق الكيميائي الحيوي اللاحق.

Research

JoVE Journal

Biology

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

LeafJ: البرنامج المساعد ليماغيج نصف الآلي ورقة قياس الشكل

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

العزلة الفعالة والسريعة من الأجنة المبكرة مرحلة من<em&gt; thaliana نبات الأرابيدوبسيس</em&gt; بذور

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

العزلة والتركيبية تحليل النبات البشرة الدهن البوليستر مونمرات

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

دهن السريع الحبرية العزلة بروتوكول استخدام عدة عزل عضية الراسخة

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

التشريح وتلطيخ الدهون القطرة من البويضات في يرقات دروفيا

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

إعداد وتربية الحشرات المحورية مع الشتلات المستزرعة في الأنسجة لدراسات تفاعل الميكروبات بين الأمعاء المضيفة لخنفساء الأوراق

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

عزل وتوصيف الفيكوبيليسوم السليم في البكتيريا الزرقاء

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

عزل وتحليل الحويصلات خارج الخلية التي يمكن تتبعها والوظيفية من البلازما والأنسجة الصلبة

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

عزل وتوصيف وتطبيق علاجي للحويصلات خارج الخلية من الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية المستزرعة

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...