Name: plastoglobule lipid droplet isolation from plant leaf tissue and cyanobacteria
Uploaded: 2022-10-06T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria at JoVE.com

Forskningen i laboratoriegruppen Lundquist er støttet af bevillinger fra NSF (MCB-2034631) og USDA (MICL08607) til P.K.L. Forfatterne takker Dr. Carrie Hiser (MSU) for støtte i udviklingen af den cyanobakterielle plastoglobule isolationsmetode.

1. Rå plastoglobuleisolering
<ol><li>Ekstraktion af rå plastoglobule fra ubelastet majsbladvæv<ol><li>Anskaf seks sunde majsplanter, der er ca. 3 uger gamle og næsten på V5-vækststadiet, vejer ca. 120 g.</li>
		<li>Klip alle bladene i bunden af stilken af, dunk dem hurtigt i et isbad og transporter til det kolde rum.</li>
		<li>Fjern majsbladene fra isbadet under en grøn sikkerhedslampe, og klip dem i mindre stykker (ca. 5 cm x 5 cm) med en saks.</li>
		<li>Slip forsigtigt men grundigt halvdelen...

<ol>
	<li>Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+throughout+the+evolutionary+tree.">Lipid droplets throughout the evolutionary tree.</a> Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).</li><li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+network+of+the+Arabidopsis+plastoglobule+proteome+based+on+quantitative+proteomics+and+genome-wide+coexpression+analysis.">The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis.</a> Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).</li><li>Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+of+plastoglobules+in+chloroplasts+and+chromoplasts.+A+surprising+site+for+differential+accumulation+of+metabolic+enzymes.">Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes.</a> Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).</li><li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+plastoglobule+kinases+ABC1K1+and+ABC1K3+causes+conditional+degreening,+modified+prenyl-lipids,+and+recruitment+of+the+jasmonic+acid+pathway.">Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway.</a> The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).</li><li>Vidi, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tocopherol+cyclase+(VTE1)+localization+and+vitamin+E+accumulation+in+chloroplast+plastoglobule+lipoprotein+particles.">Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+and+the+fine+structure+of+plastids.">Plastoglobuli and the fine structure of plastids.</a> Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).</li><li>Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+in+different+types+of+plastids+from+Allium+cepa+L.">Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L.</a> Planta. 72 (1), 1-13 (1966).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Plastoglobuli+von+Spinat,+ihre+Gr&#246;&#946;e,+Isolierung+und+Lipochinonzusammensetzung.">Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gr&#246;&#946;e, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung.</a> Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+and+lipoquinone+content+of+chloroplasts+from+Cereus+peruvianus+(L)+Mill.">Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill.</a> Planta. 87 (4), 304-310 (1969).</li><li>Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromoplast+ultrastructure+of+Capsicum+carotenoid+mutants+I.+Ultrastructure+and+carotenoid+composition+of+a+new+mutant.">Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant.</a> Zeitschrift f&#252;r Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).</li><li>Hansmann, P., Sitte, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+molecular+structure+of+chromoplast+globules+of+Viola+tricolor.">Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor.</a> Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).</li><li>Steinmuller, D., Tevini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+function+of+plastoglobuli+:+I.+Isolation+and+purification+from+chloroplasts+and+chromoplasts.">Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts.</a> Planta. 163 (2), 201-207 (1985).</li><li>Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proteins+associated+with+plastoglobules+isolated+from+pea+(Pisum+sativum+L.)+chloroplasts.">Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts.</a> Planta. 208 (1), 107-113 (1999).</li><li>Grennan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobule+proteome.">Plastoglobule proteome.</a> Plant Physiology. 147 (2), 443-445 (2008).</li><li>Peramuna, A., Summers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+occurrence+of+lipid+droplets+in+the+cyanobacterium+Nostoc+punctiforme.">Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme.</a> Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).</li><li>Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobules+are+lipoprotein+subcompartments+of+the+chloroplast+that+are+permanently+coupled+to+thylakoid+membranes+and+contain+biosynthetic+enzymes.">Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes.</a> The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).</li><li>Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid+lipid+droplets+at+the+crossroads+of+prenylquinone+metabolism.">Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).</li><li>Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plastoglobules+in+metabolite+repair+in+the+tocopherol+redox+cycle.">Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).</li><li>Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+functional+connections+between+cytoplasmic+and+chloroplast+triacylglycerol+storage.">Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage.</a> Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).</li><li>Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+isolation+from+Arabidopsis+thaliana+leaves.">Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves.</a> Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).</li><li>Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+changes+of+Arabidopsis+thaliana+plastoglobules+facilitate+thylakoid+membrane+remodeling+under+high+light+stress.">Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress.</a> Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).</li><li>Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plastoglobule-localized+protein+AtABC1K6+is+a+Mn2+-dependent+kinase+necessary+for+timely+transition+to+reproductive+growth.">The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth.</a> Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).</li><li>Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+topology+and+membrane+interaction+characteristics+of+plastoglobule-localized+AtFBN1a+and+AtLOX2.">Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2.</a> Plant Signalling &amp; Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).</li><li>Besagni, C., Piller, L. E., Br&#233;h&#233;lin, C., Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plastoglobules+from+Arabidopsis+Plastids+for+Proteomic+Analysis+and+Other+Studies.">Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies.</a> Chloroplast Research in Arabidopsis. , 223-239 (2011).</li><li>Yang, H., Murphy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+preparation,+sucrose+density+gradients+and+two-phase+separation+fractionation+from+five-day-old+Arabidopsis+seedlings.">Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings.</a> Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).</li><li>Kelekar, P., Wei, M., Yang, P., Pazour, G. J., King, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Radial+Spoke+Proteins.">Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins.</a> Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. 92, 181-196 (2009).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear-encoded+synthesis+of+the+D1+subunit+of+photosystem+II+increases+photosynthetic+efficiency+and+crop+yield.">Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield.</a> Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy+reveals+that+senescence+induces+in-situ+and+vacuolar+degradation+of+plastoglobules+in+aging+watermelon+leaves.">Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves.</a> Micron. 80, 135-144 (2016).</li><li>Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+FIBRILLIN4+gene+expression+in+apple+decreases+plastoglobule+plastoquinone+content.">Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content.</a> PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).</li><li>Singh, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIBRILLIN4+is+required+for+plastoglobule+development+and+stress+resistance+in+apple+and+Arabidopsis.">FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gardenia+carotenoid+cleavage+dioxygenase+4a+is+an+efficient+tool+for+biotechnological+production+of+crocins+in+green+and+non-green+plant+tissues.">Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues.</a> Plant Biotechnology Journal. , (2022).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian Journal of Biochemistry &amp; Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li></ol>

For at minimere fysiologiske/biokemiske ændringer i materialet og beskytte visse foto- og termolabile prenyllipidpigmenter, der er en rig bestanddel af plastoglobuler, er det afgørende at udføre isoleringen ved 4 °C og beskyttet mod lys. Som angivet ovenfor udføres de indledende trin i kølerummet under en sikkerhedslampe ved hjælp af en grøn emitterende pære. De efterfølgende trin, der udføres i laboratoriet, er under dæmpet lys og bruger is eller kølet centrifugering. Af lignende årsager er inkluderingen a...

Den nuværende forståelse af plastoglobulesammensætning og funktion er fremkommet gennem detaljerede proteomiske og lipidomiske undersøgelser 1,2,3,4,5. Sådanne undersøgelser er i høj grad blevet hjulpet af en hurtig og effektiv isolationsmetode, der er afhængig af deres meget lave densitet for effektiv adskillelse ved hjælp af saccharosegradienter. Indledende metoder til plastoglobuleisolering blev opnået fra arter som bøgetræet (Fagus sylvatica), skotsk kost (Sarothamnus scoparius), løg (Allium cepa), spinat (Spinacia oleracea), stedmoderblomst (Viola tricolor), peber (Capsicum annuum) og ærter (Pisum sativum) 6,7,8,9,10,11 ,12,13. En opdateret metode til at isolere kloroplastplastplastlobuler på en mere effektiv og bedre eftergivende måde blev senere præsenteret af Ytterberg et al.3,14. Mens vi oprindeligt blev anvendt til undersøgelse af plastoglobuler af Arabidopsis thaliana bladkloroplaster, har vi med succes anvendt denne opdaterede metode til det sunde bladvæv fra andre plantearter, både monocot og dicot, herunder majs (Zea mays), tomat (Solanum lycopersicum), kærlighedsgræs (Eragrostis nindensis), lilla falsk brom (Brachypodium distachyon) og vild tobak (Nicotiana benthamiana ; ikke-offentliggjorte resultater). Desuden er isolationsmetoden med succes blevet tilpasset plastoglobulerne af cyanobakterier, herunder Synechocystis sp. PCC 6803 og Anabaena sp. PCC 712015, og det udtørrede bladvæv fra opstandelsesplanten, E. nindensis.
Chloroplast plastoglobuler af sundt bladvæv er fysisk forbundet med thylakoidmembranerne16. På trods af denne fysiske kontinuitet opretholder de to kloroplastunderrum forskellige lipid- og proteinsammensætninger, selvom den regulerede udveksling af lipid og protein mellem de to rum er blevet foreslået 2,4,17,18,19. Faktisk er der for nylig blevet foreslået en interessant hemifusionsmodel til handel med neutrale lipider mellem kloroplaster og cytosol19. På grund af den fysiske kontinuitet af plastoglobuler og thylakoider begynder isolationsmetoden med sundt bladvæv med opsamlingen af et pelleteret råt thylakoidpræparat, som efterfølgende sonikeres for at adskille plastoglobulerne fra thylakoiderne, hvilket er i modsætning til metoder, der anvendes til isolering af cytosoliske lipiddråber20 . Ultracentrifugering på en saccharosepude flyder derefter plastoglobulerne med lav densitet op gennem saccharose, hvilket effektivt adskiller dem fra thylakoiderne, kernerne og andet materiale med høj densitet. I modsætning hertil findes plastoglobuler i cyanobakterier såvel som i udtørret bladvæv åbenbart in vivo i en fritflydende form. Derfor involverer deres isolering direkte flydende på en saccharosegradient. Denne artikel demonstrerer isolationsmetoden fra sundt bladvæv og demonstrerer yderligere to variationer, der kan bruges til at isolere plastoglobuler fra udtørret bladvæv eller cyanobakterielle kulturer, hvilket i høj grad udvider den fysiologiske bredde og evolutionære kontekst, hvori plastoglobuler kan studeres.
Isolerede plastoglobuler kan efterfølgende anvendes til et vilkårligt antal downstream-analyser for at undersøge molekylære egenskaber. Vi har brugt de isolerede plastoglobuler fra A. thaliana bladvæv til omfattende proteomisk og lipidomisk analyse under forskellige miljøforhold eller genotyper, hvilket demonstrerer den selektive modifikation af protein- og lipidsammensætning i tilpasning til stress 2,4,21,22. Derudover er in vitro-kinaseassays, der demonstrerer transphosphoryleringsaktivitet forbundet med isolerede plastoglobuler, blevet udført22, de oligomere tilstande af proteinkomponenter er blevet undersøgt under anvendelse af native gelelektroforese 21, og proteasebarberingsassays er blevet udført23.
Den primære fordel ved denne metode er procedurens relative hastighed. Efter vores erfaring kan nedenstående protokoller være fuldt ud afsluttet inden for ca. 4 timer. En alternativ metode til isolering af plastoglobuler fra bladvæv er blevet beskrevet, hvilket muliggør samtidig isolering af andre chloroplastunderrum24. Denne alternative metode giver nogle klare fordele, når kvantitativ sammenligning med de andre kloroplastunderrum er nødvendig eller ønsket. Denne alternative metode er imidlertid også mere kedelig og vil give et signifikant lavere udbytte af isolerede plastoglobuler fra sammenlignelige mængder bladvæv. Når en fokuseret undersøgelse af plastoglobuler er målet, er den metode, der er skitseret her, det optimale valg. Ikke desto mindre kan der indsamles totale blad- og rå thylakoidalikvoter under prøveforberedelsen, og det anbefales stærkt at gøre det for at have referenceprøver til efterfølgende sammenligning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AEBSF</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antipain.2HCl</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>H-1765.0050BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>A6106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B8385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>35675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Proliant Biological</td>
			<td>68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chymostatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eragrostis nindensis</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-64</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure cell (model FA-079)</td>
			<td>SLM/Aminco</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron shaking incubator</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-ramidon.2 Na</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>M16050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced Cysteine</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>101444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ortho-vanadate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyrophosphate &#183; 10H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18&#34;</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synechocystis sp. PCC 6803</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-TL Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A95761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring Blender (1.2 L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58977-227</td>
			<td>Commercial blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zea mays</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plastoglobule lipid droplet isolation from plant leaf tissue and cyanobacteria

Plastoglobulelipiddråber er et dynamisk underrum af plantekloroplaster og cyanobakterier. Fundet allestedsnærværende blandt fotosyntetiske arter, menes de at tjene en central rolle i tilpasningen og ombygningen af thylakoidmembranen under hurtigt skiftende miljøforhold. Kapaciteten til at isolere plastoglobuler af høj renhed har i høj grad lettet deres undersøgelse gennem proteomiske, lipidomiske og andre metoder. Med plastoglobuler med høj renhed og udbytte er det muligt at undersøge deres lipid- og proteinsammensætning, enzymatisk aktivitet og proteintopologi, blandt andre mulige molekylære egenskaber. Denne artikel præsenterer en hurtig og effektiv protokol til isolering af plastoglobuler fra kloroplaster af plantebladvæv og præsenterer metodologiske variationer til isolering af plastoglobuler og beslægtede lipiddråbestrukturer fra majsblade, det udtørrede bladvæv fra opstandelsesplanten, Eragrostis nindensis, og cyanobakterien, Synechocystis sp. PCC 6803. Isolering er afhængig af den lave densitet af disse lipidrige partikler, hvilket letter deres oprensning ved flotation af saccharosedensitet. Denne metode vil vise sig værdifuld i undersøgelsen af plastoglobuler fra forskellige arter.

Efter afslutningen af trin 1 i protokollen skal man let kunne se en betydelig mængde plastoglobule / lipiddråbemateriale flyde på (eller nær) det øverste lag af saccharosepuden (figur 1B-C). Andre fraktioner kunne også indsamles på dette stadium. For eksempel vil thylakoiderne blive pelleteret og kan resuspenderes med medium R 0,2 til efterfølgende analyser. Efter efterfølgende centrifugering opnås rensede plastoglobuler på eller nær overfladen a...

Watch this Scientific Journal Video about Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria at JoVE.com

Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

En hurtig og effektiv protokol præsenteres til isolering af plastoglobulelipiddråber forbundet med forskellige fotosyntetiske organismer. Den vellykkede forberedelse af isolerede plastoglobuler er et afgørende første skridt, der går forud for detaljerede molekylære undersøgelser såsom proteomiske og lipidomiske analyser.

Plastoglobule lipiddråbeisolering fra plantebladvæv og cyanobakterier

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...

Isoleringen af meget rene plastoglobuler er afgørende for deres undersøgelse. En hurtig og effektiv protokol for deres isolering, der letter deres nedstrøms biokemiske undersøgelse, præsenteres her. Den primære fordel ved denne metode er den relative procedurehastighed og dens tilpasningsevne til mange plantearter og miljøforhold.Der skal udvises særlig forsigtighed under sonikering af thylakoidresuspensioner for at sikre tilstrækkelig kraft til at strippe plastoglobuler fra thylakoider og med efterfølgende ekstraktion af plastoglobuler fra saccharosegradient. Dr. Elsinraju Devadasu, en postdoc-forsker i mit laboratorium, og Febri Susanto, en ph.d.-studerende i mit laboratorium, vil demonstrere denne procedure. Begynd med at erhverve tre uger gamle frøplanter af seks sunde majs, der har V5-vækststadium og vejer ca. 120 gram.Klip alle bladene i bunden af stilken af, og dyp dem hurtigt i et isbad, før du transporterer dem til kølerummet. Arbejd under en grøn sikkerhedslampe, fjern majsbladene fra isbadet og klip dem i mindre stykker på fem gange fem centimeter ved hjælp af en saks. Slib forsigtigt og grundigt halvdelen af det klippede bladvæv i 350 ml af slibebufferen på et niveau lavere end syv på en kommerciel blender.Start og stop blenderen fem til seks gange for at sikre, at alle blade skæres. Filtrer homogenatet gennem et lag 25 mikron nylonklud på en stor tragt til fire 250 ml centrifugeflasker. Efter gentagelse af blandingstrinnet med det resterende klippede bladvæv fordeles filtratet jævnt mellem de fire flasker.En delprøve af bladfiltratet fjernes, og den sættes til side for at blive opbevaret som en repræsentativ samlet bladprøve. Derefter centrifugeres filtratet i seks minutter ved 1.840 G og fire grader Celsius. Den resulterende supernatant hældes af, og pelletsen resuspenderes med børstens blide hvirvlende bevægelser i 12 ml medium R 0,2, der indeholder 0,2 molær saccharose.Efter resuspendering af pellet i en flaske, tilsæt suspensionen til den næste flaske og gentag resuspensionen for at samle suspensionerne i en flaske. Fordel den poolede suspension mellem seks tre milliliter ultracentrifugerør og nå et maksimalt volumen på 2,5 ml i hvert rør. Brug derefter tip sonikatoren ved en amplitude på 100%at sonikere hvert rør fire gange i 10 sekunder hver.Sørg for at holde sonikatorhornet nedsænket og væk fra væskeoverfladen for at forhindre skumning. Bevæg langsomt sonikatorhornet op og ned i suspensionen under hver runde. Mens du skifter de fire rør, skal du returnere hvert rør til en isspand efter hver sonikering for at lade prøven afkøle.Når det er gjort, centrifugeres den sonikerede rå thylakoidsuspension ved 150.000 G i 30 minutter ved fire grader Celsius. Skum pudeoverfladen ved hjælp af en sprøjte og 22 gauge nål og høst den resulterende gule og olieagtige flydende pude af rå plastoglobuler fra saccharosepuden. Genvinde ca. 500 mikroliter fra hvert rør og deponere dem i et 2,0 ml rør.Saml rå thylakoid alikvoter før og efter sonikering og frigivelse af plastoglobuler. Når du er færdig, skal du enten fortsætte plantevævsbehandlingen eller opbevare de rå plastoglobuler ved minus 80 grader Celsius og rense dem senere. Dyrk 50 ml synechocystisarter PCC 6802-kultur i BG11-medier i 7 til 10 dage for at nå den stationære fase.Brug et spektrofotometer til at justere celletætheden til en optisk tæthed på 2,0 ved 750 nanometer. For at fjerne polysacchariderne centrifugeres 50 ml kultur, og supernatanten fjernes. Gentag vask af cellerne i 50 ml buffer A to gange.Resuspender den vaskede pellet i 25 ml buffer A og bryd cellerne ved hjælp af en fransk trykcelle ved 1.100 pund kvadrattommer. Gentag processen tre gange under kolde forhold, indtil den lyserede farve skifter fra grøn til rød, blå, grøn under hvidt lys. Alikvoten af cellehomogenatet fjernes, og den sættes til side for at blive opbevaret som en repræsentativ samlet celleprøve.Fordel det resulterende homogenat i otte tre-milliliter ultracentrifugerør fyldt til maksimalt 2,5 ml i hvert rør. Overlejr dette homogenat med 400 mikroliter medium R, hvilket giver en tringradient. Reagensglassene afbalanceres forsigtigt ved at tilsætte yderligere medium R efter behov, før glassene centrifugeres.Thylakoid og andre tungere organeller, herunder eventuelle polyhydroxyalkanoatlegemer, viser pelletdannelse, mens plastoglobuler danner en gul olieagtig pude på eller nær toppen af saccharosegradienten. Høst den resulterende flydende pude af rå plastoglobuler med en sprøjte, som tidligere demonstreret, og deponer høsten i et to-milliliter rør. Skrab plastoglobuler af siden af ultracentrifugerørets væg med en nålespids, hvis det er nødvendigt.Fortsæt enten med cyanobakteriebehandling eller opbevar rå plastoglobuler ved minus 80 grader Celsius og rens senere. For at høste de rene plastoglobuler ved hjælp af plantevævsbehandlingsmetoden fremstilles den tidligere beskrevne saccharosegradient ved anvendelse af 500 mikroliter rå plastoglobuler, 400 mikroliter medium R 0,2 og 400 mikroliter medium R.Efter centrifugering høstes den resulterende flydende pude af rene plastoglobuler i et to-milliliter rør. Efter aliquoting af de rene plastoglobuler og flashfrysning af alikvoterne i flydende nitrogen, opbevares de enten ved minus 80 grader Celsius eller frysefryses til et tørt pulver.For at høste rene plastoglobuler fra cyanobakterier oprettes en saccharosegradient som tidligere nævnt ved anvendelse af 500 mikroliter af de rå plastoglobuler, 750 mikroliter medium R 0,7 og 750 mikroliter medium R 0,2. Efter centrifugering samles de rene plastoglobuler i et 1,5 ml rør og alikvote de rene plastoglobuler. Når det er gjort, lynfryses de rene plastoglobuler alikvoter i flydende nitrogen og opbevares direkte ved minus 80 grader Celsius eller frysetørres til et tørt pulver.I denne metode blev en betydelig mængde plastoglobule eller lipiddråbemateriale set flydende på det øverste lag af saccharosepuden. Efter efterfølgende centrifugering blev der opnået rensede plastoglobuler ved eller nær overfladen af saccharosegradienten. Efter den vellykkede isolering af plastoglobuler viste immunoblots udviklet til renhedsvurdering ved hjælp af antistoffer hævet mod arabidopsis thaliana fibrillin 1a og arabidopsis thaliana fotosystem II underenhed D1, at fibrillinhomologerne primært var forbundet med thylakoider end plastoglobulerne.For at sikre effektiv og koncentreret ekstraktion af flydepuden skal du placere sprøjtekanyleåbningen lige under bufferens væskeoverflade, mens den er helt nedsænket, og derefter forsigtigt trække op. Isolerede plastoglobulusprøver kan underkastes efterfølgende proteomiske eller lipidomiske undersøgelser og er blevet anvendt til at påvise ændringer i den målrettede protein-lipidsammensætning under forskellige miljøforhold. Denne teknik har lettet nye undersøgelser af plastoglobule, herunder opdagelsen af associeret proteinkinaseaktivitet og tilstedeværelsen af oligomere proteinkomplekser gennem efterfølgende biokemisk undersøgelse.

Research

JoVE Journal

Biology

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

LeafJ: En ImageJ Plugin til Semi-automatiseret Leaf Shape Måling

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Effektiv og hurtig Isolering af Debuterende embryoner fra<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Frø

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Isolering og analyse af sammensætningen af ​​Plant neglebånd Lipid Polyester Monomerer

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Hurtig Lipid Droplet Isolation protokollen ved hjælp af en almindelig Organelle isolering Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Dissektion og lipid dråbe farvning af Oenocytter i Drosophila larver

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

Forberedelse og opdræt af axeniske insekter med vævskulturerede frøplanter til værts-tarm-mikrobiotainteraktionsundersøgelser af bladbaglen

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

Isolering og karakterisering af intakt Phycobilisome i cyanobakterier

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Isolering og analyse af sporbare og funktionaliserede ekstracellulære vesikler fra plasma og fast væv

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Isolering, karakterisering og terapeutisk anvendelse af ekstracellulære vesikler fra dyrkede humane mesenkymale stamceller

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...