Name: plastoglobule lipid droplet isolation from plant leaf tissue and cyanobacteria
Uploaded: 2022-10-06T14:20:00
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La recherche dans le groupe de laboratoire Lundquist est soutenue par des subventions de la NSF (MCB-2034631) et de l’USDA (MICL08607) à P.K.L. Les auteurs remercient la Dre Carrie Hiser (MSU) pour son soutien dans le développement de la méthode d’isolement des plastoglobules cyanobactériens.

1. Isolement brut de plastoglobules
<ol><li>Extraction brute de plastoglobule à partir de tissus foliaires de maïs non stressés<ol><li>Acquérir six plants de maïs sains âgés d’environ 3 semaines et presque au stade de croissance V5, pesant environ 120 g.</li>
		<li>Coupez toutes les feuilles à la base de la tige, plongez-les rapidement dans un bain de glace et transportez-les dans la chambre froide.</li>
		<li>En travaillant sous une lampe de sécurité verte, retirez les feuilles de maïs du...

<ol>
	<li>Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+throughout+the+evolutionary+tree.">Lipid droplets throughout the evolutionary tree.</a> Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).</li><li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+network+of+the+Arabidopsis+plastoglobule+proteome+based+on+quantitative+proteomics+and+genome-wide+coexpression+analysis.">The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis.</a> Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).</li><li>Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+of+plastoglobules+in+chloroplasts+and+chromoplasts.+A+surprising+site+for+differential+accumulation+of+metabolic+enzymes.">Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes.</a> Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).</li><li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+plastoglobule+kinases+ABC1K1+and+ABC1K3+causes+conditional+degreening,+modified+prenyl-lipids,+and+recruitment+of+the+jasmonic+acid+pathway.">Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway.</a> The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).</li><li>Vidi, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tocopherol+cyclase+(VTE1)+localization+and+vitamin+E+accumulation+in+chloroplast+plastoglobule+lipoprotein+particles.">Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+and+the+fine+structure+of+plastids.">Plastoglobuli and the fine structure of plastids.</a> Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).</li><li>Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+in+different+types+of+plastids+from+Allium+cepa+L.">Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L.</a> Planta. 72 (1), 1-13 (1966).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Plastoglobuli+von+Spinat,+ihre+Gr&#246;&#946;e,+Isolierung+und+Lipochinonzusammensetzung.">Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gr&#246;&#946;e, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung.</a> Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+and+lipoquinone+content+of+chloroplasts+from+Cereus+peruvianus+(L)+Mill.">Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill.</a> Planta. 87 (4), 304-310 (1969).</li><li>Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromoplast+ultrastructure+of+Capsicum+carotenoid+mutants+I.+Ultrastructure+and+carotenoid+composition+of+a+new+mutant.">Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant.</a> Zeitschrift f&#252;r Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).</li><li>Hansmann, P., Sitte, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+molecular+structure+of+chromoplast+globules+of+Viola+tricolor.">Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor.</a> Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).</li><li>Steinmuller, D., Tevini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+function+of+plastoglobuli+:+I.+Isolation+and+purification+from+chloroplasts+and+chromoplasts.">Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts.</a> Planta. 163 (2), 201-207 (1985).</li><li>Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proteins+associated+with+plastoglobules+isolated+from+pea+(Pisum+sativum+L.)+chloroplasts.">Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts.</a> Planta. 208 (1), 107-113 (1999).</li><li>Grennan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobule+proteome.">Plastoglobule proteome.</a> Plant Physiology. 147 (2), 443-445 (2008).</li><li>Peramuna, A., Summers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+occurrence+of+lipid+droplets+in+the+cyanobacterium+Nostoc+punctiforme.">Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme.</a> Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).</li><li>Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobules+are+lipoprotein+subcompartments+of+the+chloroplast+that+are+permanently+coupled+to+thylakoid+membranes+and+contain+biosynthetic+enzymes.">Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes.</a> The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).</li><li>Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid+lipid+droplets+at+the+crossroads+of+prenylquinone+metabolism.">Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).</li><li>Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plastoglobules+in+metabolite+repair+in+the+tocopherol+redox+cycle.">Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).</li><li>Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+functional+connections+between+cytoplasmic+and+chloroplast+triacylglycerol+storage.">Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage.</a> Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).</li><li>Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+isolation+from+Arabidopsis+thaliana+leaves.">Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves.</a> Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).</li><li>Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+changes+of+Arabidopsis+thaliana+plastoglobules+facilitate+thylakoid+membrane+remodeling+under+high+light+stress.">Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress.</a> Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).</li><li>Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plastoglobule-localized+protein+AtABC1K6+is+a+Mn2+-dependent+kinase+necessary+for+timely+transition+to+reproductive+growth.">The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth.</a> Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).</li><li>Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+topology+and+membrane+interaction+characteristics+of+plastoglobule-localized+AtFBN1a+and+AtLOX2.">Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2.</a> Plant Signalling &amp; Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).</li><li>Besagni, C., Piller, L. E., Br&#233;h&#233;lin, C., Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plastoglobules+from+Arabidopsis+Plastids+for+Proteomic+Analysis+and+Other+Studies.">Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies.</a> Chloroplast Research in Arabidopsis. , 223-239 (2011).</li><li>Yang, H., Murphy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+preparation,+sucrose+density+gradients+and+two-phase+separation+fractionation+from+five-day-old+Arabidopsis+seedlings.">Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings.</a> Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).</li><li>Kelekar, P., Wei, M., Yang, P., Pazour, G. J., King, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Radial+Spoke+Proteins.">Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins.</a> Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. 92, 181-196 (2009).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear-encoded+synthesis+of+the+D1+subunit+of+photosystem+II+increases+photosynthetic+efficiency+and+crop+yield.">Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield.</a> Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy+reveals+that+senescence+induces+in-situ+and+vacuolar+degradation+of+plastoglobules+in+aging+watermelon+leaves.">Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves.</a> Micron. 80, 135-144 (2016).</li><li>Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+FIBRILLIN4+gene+expression+in+apple+decreases+plastoglobule+plastoquinone+content.">Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content.</a> PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).</li><li>Singh, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIBRILLIN4+is+required+for+plastoglobule+development+and+stress+resistance+in+apple+and+Arabidopsis.">FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gardenia+carotenoid+cleavage+dioxygenase+4a+is+an+efficient+tool+for+biotechnological+production+of+crocins+in+green+and+non-green+plant+tissues.">Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues.</a> Plant Biotechnology Journal. , (2022).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian Journal of Biochemistry &amp; Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li></ol>

Pour minimiser les changements physiologiques / biochimiques du matériau et protéger certains pigments prényl-lipidiques photo- et thermo-labiles qui sont un composant riche des plastoglobules, il est essentiel d’effectuer l’isolement à 4 ° C et à l’abri de la lumière. Comme indiqué ci-dessus, les étapes initiales sont effectuées en chambre froide sous une lampe de sécurité à l’aide d’une ampoule à émission verte. Les étapes suivantes effectuées en laboratoire sont sous des lumières tamisées ...

La compréhension actuelle de la composition et de la fonction des plastoglobules a émergé grâce à des études protéomiques et lipidomiques détaillées 1,2,3,4,5. De telles études ont été grandement facilitées par une méthode d’isolement rapide et efficace qui repose sur leur très faible densité pour une séparation efficace à l’aide de gradients de saccharose. Les méthodes initiales d’isolement des plastoglobules ont été réalisées à partir d’espèces telles que le hêtre (Fagus sylvatica), le genêt à balais (Sarothamnus scoparius), l’oignon (Allium cepa), les épinards (Spinacia oleracea), la pensée (Viola tricolor), le poivre (Capsicum annuum) et le pois (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. Une méthode mise à jour pour isoler les plastoglobules chloroplastiques d’une manière plus efficace et plus efficace a été présentée plus tard par Ytterberg et coll.3,14. Alors qu’initialement utilisé pour l’étude des plastoglobules des chloroplastes des feuilles d’Arabidopsis thaliana, nous avons utilisé avec succès cette méthode mise à jour pour les tissus foliaires sains d’autres espèces végétales, à la fois monocotylédones et dicotylédones, y compris le maïs (Zea mays), la tomate (Solanum lycopersicum), l’herbe d’amour (Eragrostis nindensis), le faux brome pourpre (Brachypodium distachyon) et le tabac sauvage (Nicotiana benthamiana ; résultats non publiés). De plus, la méthode d’isolement a été adaptée avec succès aux plastoglobules des cyanobactéries, y compris Synechocystis sp. PCC 6803 et Anabaena sp. PCC 712015, et au tissu foliaire desséché de la plante de résurrection, E. nindensis.
Les plastoglobules chloroplastiques du tissu foliaire sain sont physiquement connectés aux membranes thylakoïdes16. Malgré cette continuité physique, les deux sous-compartiments chloroplastiques conservent des compositions lipidiques et protéiques distinctes, bien que l’échange régulé de lipides et de protéines entre les deux compartiments ait été proposé 2,4,17,18,19. En fait, un modèle d’hémifusion intéressant a récemment été proposé pour le trafic de lipides neutres entre les chloroplastes et le cytosol19. En raison de la continuité physique des plastoglobules et des thylakoïdes, la méthode d’isolement avec du tissu foliaire sain commence par la collecte d’une préparation de thylakoïdes bruts en granulés, qui est ensuite soniquée pour séparer les plastoglobules des thylakoïdes, contrairement aux méthodes utilisées pour isoler les gouttelettes lipidiques cytosoliques20 . L’ultracentrifugation sur un coussin de saccharose fait ensuite flotter les plastoglobules de faible densité à travers le saccharose, les séparant efficacement des thylakoïdes, des noyaux et d’autres matériaux à haute densité. En revanche, les plastoglobules dans les cyanobactéries, ainsi que ceux des tissus foliaires desséchés, existent évidemment in vivo sous une forme flottante librement. Par conséquent, leur isolement implique de flotter directement sur un gradient de saccharose. Cet article démontre la méthode d’isolement à partir de tissus foliaires sains et démontre en outre deux variantes qui peuvent être utilisées pour isoler des plastoglobules à partir de tissus foliaires desséchés ou de cultures de cyanobactéries, élargissant considérablement l’étendue physiologique et le contexte évolutif dans lequel les plastoglobules peuvent être étudiés.
Les plastoglobules isolés peuvent ensuite être utilisés pour un certain nombre d’analyses en aval afin d’étudier les caractéristiques moléculaires. Nous avons utilisé les plastoglobules isolés du tissu foliaire d’A. thaliana pour une analyse protéomique et lipidomique approfondie dans différentes conditions environnementales ou génotypes, démontrant la modification sélective de la composition protéique et lipidique en adaptation au stress 2,4,21,22. En outre, des essais in vitro kinases démontrant une activité de transphosphorylation associée à des plastoglobules isolés ont été effectués22, les états oligomères des composants protéiques ont été étudiés à l’aide de l’électrophorèse sur gel natif 21 et des tests de rasage de protéase ont été effectués23.
Le principal avantage de cette méthode est la vitesse relative de la procédure. D’après notre expérience, les protocoles décrits ci-dessous peuvent être entièrement complétés en environ 4 heures. Une autre méthode pour isoler les plastoglobules du tissu foliaire a été décrite, ce qui permet l’isolement simultané d’autres sous-compartiments chloroplastiques24. Cette méthode alternative offre des avantages évidents lorsque la comparaison quantitative avec les autres sous-compartiments chloroplastiques est nécessaire ou souhaitée. Cependant, cette méthode alternative est également plus fastidieuse et fournira un rendement significativement plus faible de plastoglobules isolés à partir de quantités comparables de tissu foliaire. Lorsqu’une étude ciblée des plastoglobules est l’objectif, la méthodologie décrite ici est le choix optimal. Néanmoins, des aliquotes totales de feuilles et de thylakoïdes bruts peuvent être recueillies pendant la préparation de l’échantillon, et il est fortement recommandé de le faire, afin de disposer d’échantillons de référence pour une comparaison ultérieure.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AEBSF</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antipain.2HCl</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>H-1765.0050BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>A6106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B8385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>35675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Proliant Biological</td>
			<td>68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chymostatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eragrostis nindensis</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-64</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure cell (model FA-079)</td>
			<td>SLM/Aminco</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron shaking incubator</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-ramidon.2 Na</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>M16050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced Cysteine</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>101444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ortho-vanadate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyrophosphate &#183; 10H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18&#34;</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synechocystis sp. PCC 6803</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-TL Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A95761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring Blender (1.2 L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58977-227</td>
			<td>Commercial blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zea mays</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plastoglobule lipid droplet isolation from plant leaf tissue and cyanobacteria

Les gouttelettes lipidiques de Plastoglobule sont un sous-compartiment dynamique des chloroplastes et des cyanobactéries des plantes. Présents partout parmi les espèces photosynthétiques, on pense qu’ils jouent un rôle central dans l’adaptation et le remodelage de la membrane thylakoïde dans des conditions environnementales en évolution rapide. La capacité d’isoler des plastoglobules de haute pureté a grandement facilité leur étude grâce à des méthodologies protéomiques, lipidomiques et autres. Avec des plastoglobules de grande pureté et de rendement, il est possible d’étudier leur composition lipidique et protéique, leur activité enzymatique et leur topologie protéique, entre autres caractéristiques moléculaires possibles. Cet article présente un protocole rapide et efficace pour l’isolement des plastoglobules à partir de chloroplastes de tissus foliaires végétaux et présente des variations méthodologiques pour l’isolement des plastoglobules et des structures de gouttelettes lipidiques apparentées à partir de feuilles de maïs, du tissu foliaire desséché de la plante de résurrection, Eragrostis nindensis, et de la cyanobactérie, Synechocystis . sp. PCC 6803. L’isolement repose sur la faible densité de ces particules riches en lipides, ce qui facilite leur purification par flottation de densité saccharose. Cette méthodologie s’avérera utile dans l’étude des plastoglobules de diverses espèces.

À la fin de l’étape 1 du protocole, on devrait être en mesure de voir facilement une quantité considérable de plastoglobules/gouttelettes lipidiques flottant sur (ou à proximité) de la couche supérieure du coussin de saccharose (figure 1B-C). D’autres fractions pourraient également être collectées à ce stade. Par exemple, les thylakoïdes seront granulés et pourront être remis en suspension avec un milieu R 0,2 pour des analyses ultérieure...

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Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

Un protocole rapide et efficace est présenté pour l’isolement des gouttelettes lipidiques plastoglobules associées à divers organismes photosynthétiques. La préparation réussie de plastoglobules isolés est une première étape cruciale qui précède les investigations moléculaires détaillées telles que les analyses protéomiques et lipidomiques.

Isolement de gouttelettes lipidiques de plastoglobule à partir de tissus foliaires végétaux et de cyanobactéries

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...

L’isolement de plastoglobules très purs est essentiel à leur étude. Un protocole rapide et efficace pour leur isolement qui facilite leur étude biochimique en aval est présenté ici. Le principal avantage de cette méthode est la rapidité relative de la procédure et son adaptabilité à de nombreuses espèces végétales et conditions environnementales.Des précautions particulières doivent être prises lors de la sonication des resuspensions de thylakoïdes pour assurer une force suffisante pour enlever les plastoglobules des thylakoïdes et avec l’extraction ultérieure des plastoglobules du gradient de saccharose. Le Dr Elsinraju Devadasu, chercheur postdoctoral dans mon laboratoire, et Febri Susanto, doctorant dans mon laboratoire, feront la démonstration de cette procédure. Commencez par acquérir des plants de six maïs sains, âgés de trois semaines, ayant un stade de croissance V5 et pesant environ 120 grammes.Coupez toutes les feuilles à la base de la tige et plongez-les rapidement dans un bain de glace avant de les transporter dans la chambre froide. En travaillant sous une lampe de sécurité verte, retirez les feuilles de maïs du bain de glace et coupez-les en petits morceaux de cinq centimètres sur cinq à l’aide de ciseaux. Broyer doucement et soigneusement la moitié du tissu foliaire coupé dans 350 millilitres du tampon de broyage à un niveau inférieur à sept sur un mélangeur commercial.Démarrez et arrêtez le mélangeur cinq à six fois pour vous assurer que toutes les feuilles sont coupées. Filtrer l’homogénat à travers une couche de tissu en nylon de 25 microns sur un grand entonnoir jusqu’à quatre bouteilles centrifugeuses de 250 millilitres. Après avoir répété l’étape de mélange avec le reste du tissu foliaire coupé, répartir uniformément le filtrat entre les quatre bouteilles.Retirer une partie aliquote du filtrat foliaire et la mettre de côté pour qu’elle soit conservée en tant qu’échantillon total représentatif de la feuille. Ensuite, centrifugez le filtrat pendant six minutes à 1 840 G et quatre degrés Celsius. Versez le surnageant résultant et, avec de doux mouvements tourbillonnants de la brosse, remettez en suspension la pastille dans 12 millilitres de milieu R 0,2, contenant 0,2 molaire de saccharose.Après avoir remis en suspension la pastille dans une bouteille, ajoutez la suspension à la bouteille suivante et répétez la remise en suspension pour regrouper les suspensions dans une bouteille. Répartir la suspension groupée entre six tubes ultracentrifuges de trois millilitres, atteignant un volume maximal de 2,5 millilitres dans chaque tube. Utilisez ensuite le sonicateur de pointe à une amplitude de 100% pour sonifier chaque tube quatre fois pendant 10 secondes chacun.Assurez-vous de garder la corne du sonicateur immergée et éloignée de la surface du liquide pour éviter la mousse. Déplacez lentement la corne du sonicateur de haut en bas dans la suspension pendant chaque tour. Tout en alternant les quatre tubes, remettre chaque tube dans un seau à glace après chaque sonication pour permettre à l’échantillon de refroidir.Une fois cela fait, centrifuger la suspension de thylakoïdes bruts soniqués à 150 000 G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Écumer la surface du coussin à l’aide d’une seringue et d’une aiguille de calibre 22 et récolter le tampon flottant jaune et huileux résultant de plastoglobules bruts du coussin de saccharose. Récupérez environ 500 microlitres de chaque tube et déposez-les dans un tube de 2,0 millilitres.Recueillir les aliquotes thylakoïdes brutes avant et après la sonication et la libération de plastoglobules. Une fois cela fait, continuez le traitement des tissus végétaux ou stockez les plastoglobules bruts à moins 80 degrés Celsius et purifiez-les plus tard. Cultiver 50 millilitres de culture de l’espèce PCC 6802 de synechocystis dans un milieu BG11 pendant 7 à 10 jours pour atteindre la phase stationnaire.À l’aide d’un spectrophotomètre, ajustez la densité cellulaire à une densité optique de 2,0 à 750 nanomètres. Pour éliminer les polysaccharides, centrifuger 50 millilitres de culture et retirer le surnageant. Répétez le lavage des cellules dans 50 millilitres de tampon A deux fois.Remettez en suspension la pastille lavée dans 25 millilitres de tampon A et brisez les cellules à l’aide d’une cellule de pression française à 1 100 livres de pouces carrés. Répétez le processus trois fois par temps froid jusqu’à ce que la couleur lysée passe du vert au rouge, bleu, vert sous lumière blanche. Retirer la partie aliquote de l’homogénat cellulaire et la mettre de côté pour la conserver en tant qu’échantillon cellulaire total représentatif.Répartir l’homogénat obtenu dans huit tubes ultracentrifugés de trois millilitres remplis à un maximum de 2,5 millilitres dans chaque tube. Superposez cet homogénat avec 400 microlitres de milieu R, produisant un gradient progressif. Équilibrez soigneusement les tubes en ajoutant un milieu R supplémentaire si nécessaire avant de centrifuger les tubes.Le thylakoïde et d’autres organites plus lourds, y compris les corps polyhydroxyalcanoates, montrent la formation de granulés, tandis que les plastoglobules forment un tampon huileux jaune sur ou près du sommet du gradient de saccharose. Récoltez la plaquette flottante résultante de plastoglobules bruts avec une seringue, comme démontré précédemment, et déposez la récolte dans un tube de deux millilitres. Grattez les plastoglobules du côté de la paroi du tube ultracentrifuge avec une pointe d’aiguille si nécessaire.Continuez le traitement des cyanobactéries ou stockez les plastoglobules bruts à moins 80 degrés Celsius et purifiez plus tard. Pour récolter les plastoglobules purs en utilisant la méthode de traitement des tissus végétaux, préparez le gradient de saccharose décrit précédemment en utilisant 500 microlitres de plastoglobules bruts, 400 microlitres de milieu R 0,2 et 400 microlitres de milieu R.Après centrifugation, récoltez le tampon flottant résultant de plastoglobules purs dans un tube de deux millilitres. Après avoir aliquote les plastoglobules purs et congelé les aliquotes dans de l’azote liquide, stockez-les à moins 80 degrés Celsius ou lyophilisez-les en une poudre sèche.Pour récolter des plastoglobules purs de cyanobactéries, créez un gradient de saccharose, comme mentionné précédemment, en utilisant 500 microlitres de plastoglobules bruts, 750 microlitres de milieu R 0,7 et 750 microlitres de milieu R 0,2. Après centrifugation, recueillir les plastoglobules purs dans un tube de 1,5 millilitre et aliquoter les plastoglobules purs. Une fois cela fait, congelez les aliquotes de plastoglobules purs dans de l’azote liquide et stockez-les directement à moins 80 degrés Celsius ou lyophilisez en une poudre sèche.Dans cette méthode, une quantité importante de plastoglobule ou de gouttelettes lipidiques a été observée flottant sur la couche supérieure du coussin de saccharose. Après centrifugation ultérieure, des plastoglobules purifiés ont été obtenus à la surface ou près de la surface du gradient de saccharose. Après l’isolement réussi des plastoglobules, les immunoblots développés pour l’évaluation de la pureté en utilisant des anticorps élevés contre arabidopsis thaliana fibrillin 1a et arabidopsis thaliana photosystem II sous-unité D1 ont montré que les homologues de la fibrilline étaient principalement associés aux thylakoïdes que les plastoglobules.Pour assurer l’extraction efficace et concentrée du tampon flottant, placez l’orifice de l’aiguille de la seringue juste en dessous de la surface liquide du tampon tout en étant complètement immergé, puis tirez doucement vers le haut. Des échantillons isolés de plastoglobules se prêtent à des études protéomiques ou lipidomiques ultérieures et ont été utilisés pour démontrer les changements dans la composition protéine-lipidique ciblée dans différentes conditions environnementales. Cette technique a facilité de nouvelles études sur les plastoglobules, y compris la découverte de l’activité protéique kinase associée et la présence de complexes protéiques oligomères grâce à des études biochimiques ultérieures.

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