Name: plastoglobule lipid droplet isolation from plant leaf tissue and cyanobacteria
Uploaded: 2022-10-06T14:20:00
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Die Forschung in der Lundquist-Laborgruppe wird durch Zuschüsse der NSF (MCB-2034631) und des USDA (MICL08607) an P.K.L. Die Autoren danken Dr. Carrie Hiser (MSU) für die Unterstützung bei der Entwicklung der cyanobakteriellen Plastoglobulen-Isolationsmethode.

1. Isolierung von groben Plastoglobulen
<ol><li>Rohe Plastoglobulenextraktion aus unbelastetem Maisblattgewebe<ol><li>Erwerben Sie sechs gesunde Maissämlinge, die etwa 3 Wochen alt sind und sich fast im V5-Wachstumsstadium befinden und etwa 120 g wiegen.</li>
		<li>Schneiden Sie alle Blätter an der Basis des Stiels ab, tauchen Sie sie schnell in ein Eisbad und transportieren Sie sie in den Kühlraum.</li>
		<li>Unter einer grünen Sicherheitslampe die Maisblätter aus dem Eisbad nehmen und mit einer ...

<ol>
	<li>Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+throughout+the+evolutionary+tree.">Lipid droplets throughout the evolutionary tree.</a> Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).</li><li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+network+of+the+Arabidopsis+plastoglobule+proteome+based+on+quantitative+proteomics+and+genome-wide+coexpression+analysis.">The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis.</a> Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).</li><li>Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+of+plastoglobules+in+chloroplasts+and+chromoplasts.+A+surprising+site+for+differential+accumulation+of+metabolic+enzymes.">Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes.</a> Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).</li><li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+plastoglobule+kinases+ABC1K1+and+ABC1K3+causes+conditional+degreening,+modified+prenyl-lipids,+and+recruitment+of+the+jasmonic+acid+pathway.">Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway.</a> The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).</li><li>Vidi, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tocopherol+cyclase+(VTE1)+localization+and+vitamin+E+accumulation+in+chloroplast+plastoglobule+lipoprotein+particles.">Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+and+the+fine+structure+of+plastids.">Plastoglobuli and the fine structure of plastids.</a> Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).</li><li>Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+in+different+types+of+plastids+from+Allium+cepa+L.">Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L.</a> Planta. 72 (1), 1-13 (1966).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Plastoglobuli+von+Spinat,+ihre+Gr&#246;&#946;e,+Isolierung+und+Lipochinonzusammensetzung.">Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gr&#246;&#946;e, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung.</a> Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+and+lipoquinone+content+of+chloroplasts+from+Cereus+peruvianus+(L)+Mill.">Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill.</a> Planta. 87 (4), 304-310 (1969).</li><li>Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromoplast+ultrastructure+of+Capsicum+carotenoid+mutants+I.+Ultrastructure+and+carotenoid+composition+of+a+new+mutant.">Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant.</a> Zeitschrift f&#252;r Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).</li><li>Hansmann, P., Sitte, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+molecular+structure+of+chromoplast+globules+of+Viola+tricolor.">Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor.</a> Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).</li><li>Steinmuller, D., Tevini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+function+of+plastoglobuli+:+I.+Isolation+and+purification+from+chloroplasts+and+chromoplasts.">Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts.</a> Planta. 163 (2), 201-207 (1985).</li><li>Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proteins+associated+with+plastoglobules+isolated+from+pea+(Pisum+sativum+L.)+chloroplasts.">Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts.</a> Planta. 208 (1), 107-113 (1999).</li><li>Grennan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobule+proteome.">Plastoglobule proteome.</a> Plant Physiology. 147 (2), 443-445 (2008).</li><li>Peramuna, A., Summers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+occurrence+of+lipid+droplets+in+the+cyanobacterium+Nostoc+punctiforme.">Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme.</a> Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).</li><li>Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobules+are+lipoprotein+subcompartments+of+the+chloroplast+that+are+permanently+coupled+to+thylakoid+membranes+and+contain+biosynthetic+enzymes.">Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes.</a> The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).</li><li>Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid+lipid+droplets+at+the+crossroads+of+prenylquinone+metabolism.">Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).</li><li>Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plastoglobules+in+metabolite+repair+in+the+tocopherol+redox+cycle.">Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).</li><li>Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+functional+connections+between+cytoplasmic+and+chloroplast+triacylglycerol+storage.">Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage.</a> Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).</li><li>Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+isolation+from+Arabidopsis+thaliana+leaves.">Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves.</a> Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).</li><li>Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+changes+of+Arabidopsis+thaliana+plastoglobules+facilitate+thylakoid+membrane+remodeling+under+high+light+stress.">Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress.</a> Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).</li><li>Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plastoglobule-localized+protein+AtABC1K6+is+a+Mn2+-dependent+kinase+necessary+for+timely+transition+to+reproductive+growth.">The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth.</a> Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).</li><li>Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+topology+and+membrane+interaction+characteristics+of+plastoglobule-localized+AtFBN1a+and+AtLOX2.">Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2.</a> Plant Signalling &amp; Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).</li><li>Besagni, C., Piller, L. E., Br&#233;h&#233;lin, C., Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plastoglobules+from+Arabidopsis+Plastids+for+Proteomic+Analysis+and+Other+Studies.">Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies.</a> Chloroplast Research in Arabidopsis. , 223-239 (2011).</li><li>Yang, H., Murphy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+preparation,+sucrose+density+gradients+and+two-phase+separation+fractionation+from+five-day-old+Arabidopsis+seedlings.">Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings.</a> Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).</li><li>Kelekar, P., Wei, M., Yang, P., Pazour, G. J., King, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Radial+Spoke+Proteins.">Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins.</a> Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. 92, 181-196 (2009).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear-encoded+synthesis+of+the+D1+subunit+of+photosystem+II+increases+photosynthetic+efficiency+and+crop+yield.">Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield.</a> Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy+reveals+that+senescence+induces+in-situ+and+vacuolar+degradation+of+plastoglobules+in+aging+watermelon+leaves.">Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves.</a> Micron. 80, 135-144 (2016).</li><li>Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+FIBRILLIN4+gene+expression+in+apple+decreases+plastoglobule+plastoquinone+content.">Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content.</a> PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).</li><li>Singh, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIBRILLIN4+is+required+for+plastoglobule+development+and+stress+resistance+in+apple+and+Arabidopsis.">FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gardenia+carotenoid+cleavage+dioxygenase+4a+is+an+efficient+tool+for+biotechnological+production+of+crocins+in+green+and+non-green+plant+tissues.">Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues.</a> Plant Biotechnology Journal. , (2022).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian Journal of Biochemistry &amp; Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li></ol>

Um physiologische/biochemische Veränderungen des Materials zu minimieren und bestimmte photo- und thermolabile Prenyl-Lipid-Pigmente zu schützen, die ein reicher Bestandteil von Plastoglobuli sind, ist es wichtig, die Isolierung bei 4 °C und vor Licht geschützt durchzuführen. Wie oben angedeutet, werden die ersten Schritte im Kühlraum unter einer Sicherheitslampe mit einer grün emittierenden Glühbirne durchgeführt. Die weiteren Schritte im Labor erfolgen unter gedimmtem Licht und verwenden Eis oder gekühlte Zen...

Das aktuelle Verständnis der Zusammensetzung und Funktion von Plastoglobulen ist durch detaillierte proteomische und lipidomische Studien entstanden 1,2,3,4,5. Solche Studien wurden durch eine schnelle und effektive Isolierungsmethode erheblich unterstützt, die auf ihrer sehr geringen Dichte für eine effiziente Trennung unter Verwendung von Saccharosegradienten beruht. Erste Methoden zur Isolierung von Plastoglobulen wurden von Arten wie Buche (Fagus sylvatica), Ginster (Sarothamnus scoparius), Zwiebel (Allium cepa), Spinat (Spinacia oleracea), Stiefmütterchen (Viola tricolor), Pfeffer (Capsicum annuum) und Erbsen (Pisum sativum) erreicht6,7,8,9,10,11 ,12,13. Eine aktualisierte Methode, um Chloroplasten-Plastoglobuli effizienter und ertragreicher zu isolieren, wurde später von Ytterberg et al.3,14 vorgestellt. Während wir ursprünglich für die Untersuchung der Plastoglobulen von Arabidopsis thaliana Blattchloroplasten eingesetzt wurden, haben wir diese aktualisierte Methode erfolgreich für das gesunde Blattgewebe anderer Pflanzenarten eingesetzt, sowohl für Monokotylen als auch für Dikotylen, einschließlich Mais (Zea mays), Tomate (Solanum lycopersicum), Liebesgras (Eragrostis nindensis), Purpur-Falschbrome (Brachypodium distachyon) und Wildtabak (Nicotiana benthamiana ; unveröffentlichte Ergebnisse). Darüber hinaus wurde die Isolierungsmethode erfolgreich an die Plastoglobulen von Cyanobakterien, einschließlich Synechocystis sp. PCC 6803 und Anabaena sp. PCC 712015, und das ausgetrocknete Blattgewebe der Auferstehungspflanze, E. nindensis, angepasst.
Chloroplasten-Plastoglobuli von gesundem Blattgewebe sind physikalisch mit den Thylakoidmembranenverbunden 16. Trotz dieser physikalischen Kontinuität behalten die beiden Chloroplasten-Unterkompartimente unterschiedliche Lipid- und Proteinzusammensetzungen bei, obwohl der regulierte Austausch von Lipid und Protein zwischen den beiden Kompartimenten vorgeschlagen wurde 2,4,17,18,19. Tatsächlich wurde kürzlich ein interessantes Hemifusionsmodell für den Transport neutraler Lipide zwischen Chloroplasten und Zytosol19 vorgeschlagen. Aufgrund der physikalischen Kontinuität von Plastoglobuli und Thylakoiden beginnt die Isolationsmethode mit gesundem Blattgewebe mit der Entnahme eines pelletierten rohen Thylakoidpräparats, das anschließend beschallt wird, um die Plastoglobulen von den Thylakoiden zu trennen, was im Gegensatz zu Verfahren zur Isolierung zytosolischer Lipidtröpfchensteht 20 . Die Ultrazentrifugation auf einem Saccharosekissen führt dann die Plastoglobuli niedriger Dichte durch die Saccharose nach oben und trennt sie effektiv von den Thylakoiden, Kernen und anderem Material mit hoher Dichte. Im Gegensatz dazu existieren Plastoglobuli in Cyanobakterien, wie auch solche von ausgetrocknetem Blattgewebe, in vivo offenbar in frei schwebender Form. Daher beinhaltet ihre Isolierung ein direktes Schweben auf einem Saccharosegradienten. Dieser Artikel demonstriert die Isolationsmethode aus gesundem Blattgewebe und demonstriert zwei Variationen, die verwendet werden können, um Plastoglobulen aus ausgetrocknetem Blattgewebe oder Cyanobakterienkulturen zu isolieren, was die physiologische Breite und den evolutionären Kontext, in dem Plastoglobulen untersucht werden können, erheblich erweitert.
Isolierte Plastoglobuli können anschließend für beliebig viele nachgeschaltete Analysen zur Untersuchung molekularer Eigenschaften verwendet werden. Wir haben die isolierten Plastoglobuli aus A. thaliana Blattgewebe für umfangreiche proteomische und lipidomische Analysen unter unterschiedlichen Umweltbedingungen oder Genotypen verwendet, um die selektive Modifikation der Protein- und Lipidzusammensetzung bei der Anpassung an Stresszu demonstrieren 2,4,21,22. Darüber hinaus wurden In-vitro-Kinase-Assays durchgeführt, die eine Transphosphorylierungsaktivität im Zusammenhang mit isolierten Plastoglobulen zeigen 22, die oligomeren Zustände von Proteinkomponenten wurden unter Verwendung der nativen Gelelektrophorese untersucht 21 und Protease-Rasier-Assays durchgeführt 23.
Der Hauptvorteil dieser Methode ist die relative Geschwindigkeit des Verfahrens. Unserer Erfahrung nach können die unten beschriebenen Protokolle innerhalb von ca. 4 Stunden vollständig abgeschlossen werden. Es wurde eine alternative Methode zur Isolierung von Plastoglobulen aus Blattgewebe beschrieben, die die gleichzeitige Isolierung anderer Chloroplasten-Unterkompartimenteermöglicht 24. Diese alternative Methode bietet einige klare Vorteile, wenn ein quantitativer Vergleich mit den anderen Chloroplasten-Unterkompartimenten notwendig oder erwünscht ist. Diese alternative Methode ist jedoch auch langwieriger und liefert eine deutlich geringere Ausbeute an isolierten Plastoglobulen aus vergleichbaren Mengen an Blattgewebe. Wenn eine fokussierte Untersuchung von Plastoglobuli das Ziel ist, ist die hier skizzierte Methodik die optimale Wahl. Nichtsdestotrotz können während der Probenvorbereitung Gesamtblatt- und rohe Thylakoid-Aliquots gesammelt werden, und es wird dringend empfohlen, dies zu tun, um Referenzproben für den anschließenden Vergleich zu haben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AEBSF</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antipain.2HCl</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>H-1765.0050BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>A6106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B8385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>35675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Proliant Biological</td>
			<td>68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chymostatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eragrostis nindensis</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-64</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure cell (model FA-079)</td>
			<td>SLM/Aminco</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron shaking incubator</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-ramidon.2 Na</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>M16050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced Cysteine</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>101444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ortho-vanadate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyrophosphate &#183; 10H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18&#34;</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synechocystis sp. PCC 6803</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-TL Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A95761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring Blender (1.2 L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58977-227</td>
			<td>Commercial blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zea mays</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plastoglobule lipid droplet isolation from plant leaf tissue and cyanobacteria

Plastoglobuläre Lipidtröpfchen sind ein dynamisches Unterkompartiment von pflanzlichen Chloroplasten und Cyanobakterien. Es wird angenommen, dass sie ubiquitär unter photosynthetischen Arten vorkommen und eine zentrale Rolle bei der Anpassung und dem Umbau der Thylakoidmembran unter sich schnell ändernden Umweltbedingungen spielen. Die Fähigkeit, Plastoglobulen von hoher Reinheit zu isolieren, hat ihre Untersuchung durch proteomische, lipidomische und andere Methoden erheblich erleichtert. Mit Plastoglobuli von hoher Reinheit und Ausbeute ist es möglich, ihre Lipid- und Proteinzusammensetzung, enzymatische Aktivität und Proteintopologie sowie andere mögliche molekulare Eigenschaften zu untersuchen. Dieser Artikel stellt ein schnelles und effektives Protokoll für die Isolierung von Plastoglobuli aus Chloroplasten von pflanzlichem Blattgewebe vor und stellt methodische Variationen für die Isolierung von Plastoglobulen und verwandten Lipidtröpfchenstrukturen aus Maisblättern, dem ausgetrockneten Blattgewebe der Auferstehungspflanze, Eragrostis nindensis, und dem Cyanobakterium, Synechocystis , vor PCC 6803. Die Isolierung beruht auf der geringen Dichte dieser lipidreichen Partikel, was ihre Reinigung durch Saccharosedichteflotation erleichtert. Diese Methodik wird sich bei der Untersuchung von Plastoglobuli verschiedener Arten als wertvoll erweisen.

Nach Abschluss von Schritt 1 des Protokolls sollte man in der Lage sein, eine beträchtliche Menge an Plastoglobulen-/Lipidtröpfchenmaterial auf (oder in der Nähe) der obersten Schicht des Saccharosekissens zu sehen (Abbildung 1B-C). In dieser Phase könnten auch andere Fraktionen gesammelt werden. Zum Beispiel werden die Thylakoide pelletiert und können für nachfolgende Analysen mit dem Medium R 0,2 resuspendiert werden. Nach anschließender Zentrifugat...

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Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

Es wird ein schnelles und effizientes Protokoll für die Isolierung von Plastoglobulen-Lipidtröpfchen vorgestellt, die mit verschiedenen photosynthetischen Organismen assoziiert sind. Die erfolgreiche Herstellung isolierter Plastoglobuli ist ein entscheidender erster Schritt, der detaillierten molekularen Untersuchungen wie proteomischen und lipidomischen Analysen vorausgeht.

Isolierung von Plastoglobulen-Lipidtröpfchen aus pflanzlichem Blattgewebe und Cyanobakterien

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...

Die Isolierung hochreiner Plastoglobuli ist für ihre Untersuchung entscheidend. Ein schnelles und effektives Protokoll für ihre Isolierung, das ihre nachgelagerte biochemische Untersuchung erleichtert, wird hier vorgestellt. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt in der relativen Geschwindigkeit des Verfahrens und ihrer Anpassungsfähigkeit an zahlreiche Pflanzenarten und Umweltbedingungen.Bei der Beschallung von Thylakoid-Resuspensionen ist besondere Vorsicht geboten, um eine ausreichende Kraft zum Entfernen von Plastoglobulen aus Thylakoiden und bei der anschließenden Extraktion von Plastoglobulen aus dem Saccharosegradienten zu gewährleisten. Dieses Verfahren wird von Dr. Elsinraju Devadasu, einem Postdoktoranden in meinem Labor, und Febri Susanto, einem Doktoranden in meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie mit dem Erwerb von drei Wochen alten Sämlingen von sechs gesunden Maissorten mit V5-Wachstumsstadium und einem Gewicht von etwa 120 Gramm.Schneiden Sie alle Blätter an der Basis des Stängels ab und tauchen Sie sie schnell in ein Eisbad, bevor Sie sie in den Kühlraum transportieren. Unter einer grünen Sicherheitslampe die Maisblätter aus dem Eisbad nehmen und mit einer Schere in kleinere, fünf mal fünf Zentimeter große Stücke schneiden. Mahlen Sie vorsichtig und gründlich die Hälfte des abgeschnittenen Blattgewebes in 350 Milliliter des Mahlpuffers auf einem Niveau von weniger als sieben auf einem handelsüblichen Mixer.Starten und stoppen Sie den Mixer fünf- bis sechsmal, um sicherzustellen, dass alle Blätter geschnitten sind. Filtrieren Sie das Homogenat durch eine Schicht 25-Mikron-Nylontuch auf einem großen Trichter zu vier 250-Milliliter-Zentrifugenflaschen. Nachdem Sie den Mischschritt mit dem verbleibenden abgeschnittenen Blattgewebe wiederholt haben, verteilen Sie das Filtrat gleichmäßig auf die vier Flaschen.Ein aliquoter Teil des Blattfiltrats wird entfernt und beiseite gestellt, um als repräsentative Gesamtblattprobe aufbewahrt zu werden. Anschließend wird das Filtrat sechs Minuten lang bei 1,840 g und vier Grad Celsius zentrifugiert. Gießen Sie den resultierenden Überstand ab und resuspendieren Sie das Pellet mit sanften Wirbelbewegungen der Bürste in 12 Milliliter Medium R 0,2, das 0,2 molare Saccharose enthält.Nachdem Sie das Pellet in einer Flasche resuspendiert haben, geben Sie die Suspension in die nächste Flasche und wiederholen Sie die Resuspension, um die Suspensionen in einer Flasche zu sammeln. Verteilen Sie die gepoolte Suspension auf sechs Drei-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen, wobei in jedem Röhrchen ein maximales Volumen von 2,5 Millilitern erreicht wird. Verwenden Sie dann den Spitzenbeschaller mit einer Amplitude von 100%, um jede Röhre viermal für jeweils 10 Sekunden zu beschallen.Stellen Sie sicher, dass das Ultraschallhorn unter Wasser und von der Flüssigkeitsoberfläche ferngehalten wird, um ein Aufschäumen zu vermeiden. Bewegen Sie das Ultraschallhorn während jeder Runde langsam innerhalb der Aufhängung auf und ab. Während Sie die vier Röhrchen abwechseln, geben Sie jedes Röhrchen nach jeder Beschallung in einen Eiskübel zurück, damit die Probe abkühlen kann.Anschließend wird die beschallte rohe Thylakoidsuspension bei 150.000 G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Schöpfen Sie die Kissenoberfläche mit einer Spritze und einer 22-Gauge-Nadel ab und entnehmen Sie das resultierende gelbe und ölige Schwimmkissen aus rohen Plastoglobulen aus dem Saccharosekissen. Gewinnen Sie ca. 500 Mikroliter aus jedem Röhrchen zurück und geben Sie sie in ein 2,0-Milliliter-Röhrchen.Sammeln Sie rohe Thylakoid-Aliquots vor und nach der Beschallung und Freisetzung von Plastoglobuli. Danach setzen Sie entweder die Verarbeitung des Pflanzengewebes fort oder lagern Sie die rohen Plastoglobuli bei minus 80 Grad Celsius und reinigen Sie sie später. Züchten Sie 50 Milliliter Synechocystis-Spezies PCC 6802-Kultur in BG11-Medien für 7 bis 10 Tage, um die stationäre Phase zu erreichen.Stellen Sie die Zelldichte mit einem Spektralphotometer auf eine optische Dichte von 2,0 bei 750 Nanometern ein. Um die Polysaccharide zu entfernen, zentrifugieren Sie 50 Milliliter Kultur und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie das Waschen der Zellen in 50 Milliliter Puffer A zweimal.Resuspendieren Sie das gewaschene Pellet in 25 Milliliter Puffer A und brechen Sie die Zellen mit einer französischen Druckzelle bei 1, 100 Pfund Quadratzoll. Wiederholen Sie den Vorgang dreimal unter kalten Bedingungen, bis die lysierte Farbe unter weißem Licht von grün zu rot, blau, grün wechselt. Das aliquot des Zellhomogenats wird entfernt und beiseite gestellt, um es als repräsentative Gesamtzellprobe aufzubewahren.Verteilen Sie das resultierende Homogenat in acht Drei-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen, die in jedem Röhrchen maximal 2,5 Milliliter gefüllt sind. Dieses Homogenat wird mit 400 Mikrolitern Medium R überlagert, wodurch ein Stufengradient entsteht. Die Röhrchen sorgfältig ausbalancieren, indem Sie bei Bedarf zusätzliches Medium R hinzufügen, bevor Sie die Röhrchen zentrifugieren.Das Thylakoid und andere schwerere Organellen, einschließlich aller Polyhydroxyalkanoatkörper, zeigen eine Pelletbildung, während Plastoglobulen ein gelbes öliges Pad auf oder nahe der Oberseite des Saccharosegradienten bilden. Ernten Sie das resultierende schwimmende Pad aus rohen Plastoglobulen mit einer Spritze, wie bereits gezeigt, und legen Sie die Ernte in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen. Kratzen Sie die Plastoglobuli bei Bedarf mit einer Nadelspitze seitlich von der Wand des Ultrazentrifugenröhrchens ab.Entweder mit der Cyanobakterien-Verarbeitung fortfahren oder rohe Plastoglobuli bei minus 80 Grad Celsius lagern und später reinigen. Um die reinen Plastoglobulen unter Verwendung der Methode der Pflanzengewebeverarbeitung zu ernten, bereiten Sie den zuvor beschriebenen Saccharosegradienten unter Verwendung von 500 Mikrolitern roher Plastoglobuli, 400 Mikrolitern Medium R 0,2 und 400 Mikrolitern Medium R vor.Nach der Zentrifugation wird das resultierende schwimmende Pad aus reinen Plastoglobulen in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen geerntet. Nach dem Aliquotieren der reinen Plastoglobuli und dem Schockgefrieren der Aliquoten in flüssigem Stickstoff lagern Sie sie entweder bei minus 80 Grad Celsius oder lyophilisieren Sie sie zu einem trockenen Pulver.Um reine Plastoglobulen aus Cyanobakterien zu ernten, erzeugen Sie, wie bereits erwähnt, einen Saccharosegradienten unter Verwendung von 500 Mikrolitern der rohen Plastoglobuli, 750 Mikroliter Medium R 0,7 und 750 Mikroliter Medium R 0,2. Nach der Zentrifugation werden die reinen Plastoglobuli in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen gesammelt und die reinen Plastoglobuli aliquotiert. Anschließend die reinen Plastoglobuli aliquot in flüssigem Stickstoff schockgefrieren und direkt bei minus 80 Grad Celsius lagern oder zu einem trockenen Pulver gefrieren.Bei dieser Methode wurde eine signifikante Menge an Plastoglobulen- oder Lipidtröpfchenmaterial auf der obersten Schicht des Saccharosekissens schwimmend gesehen. Nach anschließender Zentrifugation wurden gereinigte Plastoglobulen an oder nahe der Oberfläche des Saccharosegradienten erhalten. Nach der erfolgreichen Isolierung von Plastoglobuli zeigten Immunoblots, die zur Reinheitsbeurteilung mit Antikörpern gegen Arabidopsis thaliana Fibrillin 1a und Arabidopsis thaliana Photosystem II Untereinheit D1 entwickelt wurden, dass die Fibrillin-Homologe primär mit Thylakoiden assoziiert waren als die Plastoglobuli.Um eine effiziente und konzentrierte Extraktion des schwimmenden Pads zu gewährleisten, platzieren Sie die Spritzennadelöffnung direkt unter der Flüssigkeitsoberfläche des Puffers, während Sie vollständig eingetaucht sind, und ziehen Sie sie dann vorsichtig nach oben. Isolierte Plastoglobulenproben sind für nachfolgende proteomische oder lipidomische Studien geeignet und wurden verwendet, um die Veränderungen in der angestrebten Protein-Lipid-Zusammensetzung unter verschiedenen Umweltbedingungen nachzuweisen. Diese Technik hat neue Studien der Plastoglobule ermöglicht, einschließlich der Entdeckung der assoziierten Proteinkinaseaktivität und des Vorhandenseins von oligomeren Proteinkomplexen durch nachfolgende biochemische Untersuchungen.

Research

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