Name: plastoglobule lipid droplet isolation from plant leaf tissue and cyanobacteria
Uploaded: 2022-10-06T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria at JoVE.com

המחקר בקבוצת המעבדה של לונדקוויסט נתמך על ידי מענקים מה-NSF (MCB-2034631) ו-USDA (MICL08607) ל-P.K.L. המחברים מודים לד"ר קארי הייזר (MSU) על התמיכה בפיתוח שיטת הבידוד של פלסטוגלובול ציאנובקטריאלי.

1. בידוד פלסטוגלובול גולמי
<ol><li>מיצוי פלסטוגלובול גולמי מרקמת עלי תירס לא מתוחים<ol><li>רכשו שישה שתילי תירס בריאים כבני 3 שבועות וכמעט בשלב הצמיחה של V5, במשקל של כ-120 גרם.</li>
		<li>חותכים את כל העלים שבבסיס הגבעול, מטביעים אותם במהירות באמבט קרח, ומעבירים לחדר הקר.</li>
		<li>עובדים תחת מנורת ...

<ol>
	<li>Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+throughout+the+evolutionary+tree.">Lipid droplets throughout the evolutionary tree.</a> Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).</li><li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+network+of+the+Arabidopsis+plastoglobule+proteome+based+on+quantitative+proteomics+and+genome-wide+coexpression+analysis.">The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis.</a> Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).</li><li>Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+of+plastoglobules+in+chloroplasts+and+chromoplasts.+A+surprising+site+for+differential+accumulation+of+metabolic+enzymes.">Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes.</a> Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).</li><li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+plastoglobule+kinases+ABC1K1+and+ABC1K3+causes+conditional+degreening,+modified+prenyl-lipids,+and+recruitment+of+the+jasmonic+acid+pathway.">Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway.</a> The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).</li><li>Vidi, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tocopherol+cyclase+(VTE1)+localization+and+vitamin+E+accumulation+in+chloroplast+plastoglobule+lipoprotein+particles.">Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+and+the+fine+structure+of+plastids.">Plastoglobuli and the fine structure of plastids.</a> Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).</li><li>Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+in+different+types+of+plastids+from+Allium+cepa+L.">Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L.</a> Planta. 72 (1), 1-13 (1966).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Plastoglobuli+von+Spinat,+ihre+Gr&#246;&#946;e,+Isolierung+und+Lipochinonzusammensetzung.">Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gr&#246;&#946;e, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung.</a> Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+and+lipoquinone+content+of+chloroplasts+from+Cereus+peruvianus+(L)+Mill.">Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill.</a> Planta. 87 (4), 304-310 (1969).</li><li>Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromoplast+ultrastructure+of+Capsicum+carotenoid+mutants+I.+Ultrastructure+and+carotenoid+composition+of+a+new+mutant.">Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant.</a> Zeitschrift f&#252;r Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).</li><li>Hansmann, P., Sitte, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+molecular+structure+of+chromoplast+globules+of+Viola+tricolor.">Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor.</a> Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).</li><li>Steinmuller, D., Tevini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+function+of+plastoglobuli+:+I.+Isolation+and+purification+from+chloroplasts+and+chromoplasts.">Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts.</a> Planta. 163 (2), 201-207 (1985).</li><li>Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proteins+associated+with+plastoglobules+isolated+from+pea+(Pisum+sativum+L.)+chloroplasts.">Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts.</a> Planta. 208 (1), 107-113 (1999).</li><li>Grennan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobule+proteome.">Plastoglobule proteome.</a> Plant Physiology. 147 (2), 443-445 (2008).</li><li>Peramuna, A., Summers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+occurrence+of+lipid+droplets+in+the+cyanobacterium+Nostoc+punctiforme.">Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme.</a> Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).</li><li>Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobules+are+lipoprotein+subcompartments+of+the+chloroplast+that+are+permanently+coupled+to+thylakoid+membranes+and+contain+biosynthetic+enzymes.">Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes.</a> The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).</li><li>Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid+lipid+droplets+at+the+crossroads+of+prenylquinone+metabolism.">Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).</li><li>Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plastoglobules+in+metabolite+repair+in+the+tocopherol+redox+cycle.">Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).</li><li>Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+functional+connections+between+cytoplasmic+and+chloroplast+triacylglycerol+storage.">Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage.</a> Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).</li><li>Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+isolation+from+Arabidopsis+thaliana+leaves.">Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves.</a> Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).</li><li>Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+changes+of+Arabidopsis+thaliana+plastoglobules+facilitate+thylakoid+membrane+remodeling+under+high+light+stress.">Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress.</a> Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).</li><li>Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plastoglobule-localized+protein+AtABC1K6+is+a+Mn2+-dependent+kinase+necessary+for+timely+transition+to+reproductive+growth.">The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth.</a> Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).</li><li>Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+topology+and+membrane+interaction+characteristics+of+plastoglobule-localized+AtFBN1a+and+AtLOX2.">Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2.</a> Plant Signalling &amp; Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).</li><li>Besagni, C., Piller, L. E., Br&#233;h&#233;lin, C., Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plastoglobules+from+Arabidopsis+Plastids+for+Proteomic+Analysis+and+Other+Studies.">Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies.</a> Chloroplast Research in Arabidopsis. , 223-239 (2011).</li><li>Yang, H., Murphy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+preparation,+sucrose+density+gradients+and+two-phase+separation+fractionation+from+five-day-old+Arabidopsis+seedlings.">Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings.</a> Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).</li><li>Kelekar, P., Wei, M., Yang, P., Pazour, G. J., King, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Radial+Spoke+Proteins.">Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins.</a> Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. 92, 181-196 (2009).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear-encoded+synthesis+of+the+D1+subunit+of+photosystem+II+increases+photosynthetic+efficiency+and+crop+yield.">Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield.</a> Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy+reveals+that+senescence+induces+in-situ+and+vacuolar+degradation+of+plastoglobules+in+aging+watermelon+leaves.">Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves.</a> Micron. 80, 135-144 (2016).</li><li>Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+FIBRILLIN4+gene+expression+in+apple+decreases+plastoglobule+plastoquinone+content.">Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content.</a> PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).</li><li>Singh, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIBRILLIN4+is+required+for+plastoglobule+development+and+stress+resistance+in+apple+and+Arabidopsis.">FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gardenia+carotenoid+cleavage+dioxygenase+4a+is+an+efficient+tool+for+biotechnological+production+of+crocins+in+green+and+non-green+plant+tissues.">Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues.</a> Plant Biotechnology Journal. , (2022).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian Journal of Biochemistry &amp; Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li></ol>

כדי למזער את השינויים הפיזיולוגיים/ביוכימיים בחומר ולהגן על פיגמנטים מסוימים של פרניל ליפידים פוטו-לביליים ותרמו-לביליים שהם מרכיב עשיר של פלסטוגלובולים, חיוני לבצע את הבידוד בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ומוגן מפני אור. כפי שצוין לעיל, הצעדים הראשונים מבוצעים בחדר הקירור תחת מנורת בטיחות ...

ההבנה הנוכחית של הרכב ותפקוד הפלסטוגלובול התפתחה באמצעות מחקרים פרוטאומיים וליפידומיים מפורטים 1,2,3,4,5. מחקרים כאלה נעזרו רבות בשיטת בידוד מהירה ויעילה המסתמכת על צפיפותם הנמוכה מאוד להפרדה יעילה באמצעות שיפועים של סוכרוז. שיטות ראשוניות לבידוד פלסטוגלובול הושגו ממינים כגון עץ האשור (Fagus sylvatica), מטאטא סקוטי (Sarothamnus scoparius), בצל (Allium cepa), תרד (Spinacia oleracea), פאנסי (ויולה טריקולור), פלפל (Capsicum annuum) ואפונה (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. שיטה מעודכנת לבידוד פלסטוגלובולים של כלורופלסט בצורה יעילה יותר ומניבה טוב יותר הוצגה מאוחר יותר על ידי Ytterberg et al.3,14. בעוד שבתחילה נעשה שימוש במחקר של פלסטוגלובולים של כלורופלסטים מעלי אראבידופסיס טליאנה, השתמשנו בהצלחה בשיטה מעודכנת זו לרקמת העלים הבריאה של מיני צמחים אחרים, הן מונוקוט והן דיקוט, כולל תירס (Zea mays), עגבנייה (Solanum lycopersicum), עשב אהבה (Eragrostis nindensis)), ברום מזויף סגול (Brachypodium distachyon) וטבק בר (Nicotiana benthamiana) ; תוצאות שלא פורסמו). יתר על כן, שיטת הבידוד הותאמה בהצלחה לפלסטוגלובולים של ציאנובקטריה, כולל Synechocystis sp. PCC 6803 ו- Anabaena sp. PCC 712015, ורקמת העלה המיובשת של צמח התחייה, E. nindensis.
פלסטוגלובולים של כלורופלסט של רקמת עלים בריאה מחוברים פיזית לקרום התילקואיד16. למרות ההמשכיות הפיזיקלית הזו, שני תתי-התאים של כלורופלסט שומרים על הרכבי שומנים וחלבונים נפרדים, אם כי חילופי השומנים והחלבון המוסדרים בין שני התאים הוצעו 2,4,17,18,19. למעשה, מודל hemifusion מעניין הוצע לאחרונה לסחר של שומנים ניטרליים בין chloroplasts ו cytosol19. בשל ההמשכיות הפיזית של פלסטוגלובולים ותילאקואידים, שיטת הבידוד עם רקמת עלה בריאה מתחילה באיסוף של הכנת thylakoid גולמית כדורית, אשר לאחר מכן sonicated כדי להפריד את plastoglobules מן thylakoids, אשר בניגוד לשיטות המשמשות לבידוד טיפות שומנים ציטוזוליים20 . לאחר מכן, האולטרה-צנטריפוגציה על כרית סוכרוז מרחפת את הפלסטוגלובולים בעלי הצפיפות הנמוכה כלפי מעלה דרך הסורוז, ומפרידה אותם למעשה מהתילקואידים, הגרעינים וחומרים אחרים בעלי צפיפות גבוהה. לעומת זאת, פלסטוגלובולים בציאנובקטריה, כמו גם אלה של רקמת עלים מיובשים, קיימים ככל הנראה in vivo בצורה צפה חופשית. לפיכך, הבידוד שלהם כרוך בציפה ישירה על שיפוע סוכרוז. מאמר זה מדגים את שיטת הבידוד מרקמת עלה בריאה ומדגים עוד יותר שתי וריאציות שניתן להשתמש בהן כדי לבודד פלסטוגלובולים מרקמת עלים מיובשים או מתרביות ציאנובקטריאליות, ומרחיב מאוד את הרוחב הפיזיולוגי ואת ההקשר האבולוציוני שבו ניתן לחקור פלסטוגלובולים.
לאחר מכן ניתן להשתמש בפלסטוגלובולים מבודדים לכל מספר של ניתוחים במורד הזרם כדי לחקור מאפיינים מולקולריים. השתמשנו בפלסטוגלובולים המבודדים מרקמת עלי A. thaliana לניתוח פרוטאומי וליפידומי נרחב בתנאי סביבה או גנוטיפים שונים, המדגימים את השינוי הסלקטיבי של הרכב החלבון והשומנים בהתאמה ללחץ 2,4,21,22. בנוסף, בוצעו מבחני קינאז במבחנה המדגימים פעילות טרנס-זרחון הקשורה לפלסטוגלובולים מבודדים 22, המצבים האוליגומריים של רכיבי חלבון נחקרו באמצעות אלקטרופורזה מקומית בג'ל 21, ומבחני גילוח פרוטאז בוצעו23.
היתרון העיקרי של שיטה זו הוא המהירות היחסית של ההליך. מניסיוננו, ניתן להשלים את הפרוטוקולים המפורטים להלן במלואם תוך כ-4 שעות. תוארה שיטה חלופית לבידוד פלסטוגלובולים מרקמת העלה, המאפשרת בידוד סימולטני של תת-תאים אחרים של כלורופלסט24. שיטה חלופית זו מציעה כמה יתרונות ברורים כאשר יש צורך או רצוי בהשוואה כמותית לשאר תתי-תאי הכלורופלסט. עם זאת, שיטה חלופית זו היא גם מייגעת יותר ותספק תשואה נמוכה משמעותית של פלסטוגלובולים מבודדים מכמויות דומות של רקמת עלה. כאשר מחקר ממוקד של פלסטוגלובולים הוא המטרה, המתודולוגיה המתוארת כאן היא הבחירה האופטימלית. עם זאת, ניתן לאסוף את סך כל העלים ואת האליקוטים הגולמיים של thylakoid במהלך הכנת הדגימה, ומומלץ מאוד לעשות זאת, כדי לקבל דגימות ייחוס להשוואה הבאה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AEBSF</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antipain.2HCl</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>H-1765.0050BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>A6106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B8385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>35675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Proliant Biological</td>
			<td>68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chymostatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eragrostis nindensis</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-64</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure cell (model FA-079)</td>
			<td>SLM/Aminco</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron shaking incubator</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-ramidon.2 Na</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>M16050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced Cysteine</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>101444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ortho-vanadate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyrophosphate &#183; 10H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18&#34;</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synechocystis sp. PCC 6803</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-TL Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A95761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring Blender (1.2 L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58977-227</td>
			<td>Commercial blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zea mays</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plastoglobule lipid droplet isolation from plant leaf tissue and cyanobacteria

טיפות שומנים פלסטוגלובול הן תת-תא דינמי של כלורופלסטים צמחיים וציאנובקטריה. הם נמצאים בכל מקום בקרב מינים פוטוסינתטיים, ומאמינים שהם ממלאים תפקיד מרכזי בהסתגלות ובשיפוץ של קרום התילקואיד בתנאי סביבה המשתנים במהירות. היכולת לבודד פלסטוגלובולים בעלי טוהר גבוה הקלה מאוד על מחקרם באמצעות מתודולוגיות פרוטאומיות, ליפידומיות ואחרות. עם plastoglobules של טוהר גבוה ותשואה, ניתן לחקור את הרכב השומנים והחלבונים שלהם, פעילות אנזימטית, טופולוגיה חלבון, בין מאפיינים מולקולריים אפשריים אחרים. מאמר זה מציג פרוטוקול מהיר ויעיל לבידוד פלסטוגלובולים מכלורופלסטים של רקמת עלה צמחי ומציג וריאציות מתודולוגיות לבידוד של פלסטוגלובולים ומבני טיפות שומנים קשורים מעלי תירס, רקמת העלה המיובשת של צמח התחייה, Eragrostis nindensis, והציאנובקטריום, סינכוציסטיס sp. PCC 6803. הבידוד מסתמך על הצפיפות הנמוכה של חלקיקים עשירים בשומנים אלה, מה שמקל על טיהורם על ידי ציפה בצפיפות סוכרוז. מתודולוגיה זו תוכיח את עצמה כבעלת ערך בחקר פלסטוגלובולים ממינים מגוונים.

עם השלמת שלב 1 של הפרוטוקול, יש לראות בקלות כמות ניכרת של חומר טיפות פלסטוגלובול/שומנים שצף על השכבה העליונה של כרית הסוכרוז (או בסמוך לה) (איור 1B-C). ניתן לאסוף גם שברים אחרים בשלב זה. לדוגמה, thylakoids יהיה גלולה וניתן להשעות מחדש עם בינוני R 0.2 עבור ניתוחים הבאי?...

Watch this Scientific Journal Video about Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria at JoVE.com

Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

פרוטוקול מהיר ויעיל מוצג לבידוד של טיפות שומנים plastoglobule הקשורים אורגניזמים פוטוסינתטיים שונים. הכנה מוצלחת של פלסטוגלובולים מבודדים היא צעד ראשון מכריע שקדם למחקרים מולקולריים מפורטים כגון ניתוחים פרוטאומיים וליפידומיים.

בידוד טיפות שומנים פלסטוגלובול מרקמת עלי הצמח וציאנובקטריה

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...

הבידוד של פלסטוגלובולים טהורים מאוד הוא קריטי למחקר שלהם. פרוטוקול מהיר ויעיל לבידודם המאפשר את חקירתם הביוכימית במורד הזרם מוצג כאן. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא המהירות היחסית של ההליך והתאמתו למיני צמחים רבים ולתנאי הסביבה.יש לנקוט זהירות מיוחדת בעת סוניקציה של מתלי תילאקואיד כדי להבטיח כוח מספיק כדי להסיר פלסטוגלובולים מתילאקואידים ועם מיצוי לאחר מכן של פלסטוגלובולים משיפוע סוכרוז. מי שידגימו את התהליך הזה יהיו ד"ר אלסינרג'ו דבדסו, חוקר פוסט-דוקטורט במעבדה שלי, ופברי סוזנטו, דוקטורנט במעבדה שלי. התחילו ברכישת שתילים בני שלושה שבועות של שישה תירס בריאים, בעלי שלב צמיחה V5 ובמשקל של כ -120 גרם.גזרו את כל העלים שבבסיס הגבעול והטבילו אותם במהירות באמבט קרח לפני העברתם לחדר הקר. עבודה תחת מנורת בטיחות ירוקה, מוציאים את עלי התירס מאמבט הקרח וחותכים אותם לחתיכות קטנות יותר של חמישה על חמישה סנטימטרים באמצעות מספריים. טוחנים בעדינות וביסודיות מחצית מרקמת העלה החתוכה ב-350 מיליליטר של חיץ הטחינה ברמה נמוכה משבע בבלנדר מסחרי.התחל ועצור את הבלנדר חמש עד שש פעמים כדי להבטיח שכל העלים נחתכים. מסננים את ההומוגנט דרך שכבה אחת של בד ניילון 25 מיקרון על משפך גדול לארבעה בקבוקי צנטריפוגות 250 מיליליטר. לאחר חזרה על שלב הערבוב עם רקמת העלה החתוכה הנותרת, חלקו את התסנין באופן שווה בין ארבעת הבקבוקים.הסר אליציטוט של תסנין העלה והניחו אותו בצד לאחסון כדגימת עלה כוללת מייצגת. לאחר מכן, צנטריפוגה את התסנין במשך שש דקות ב 1, 840 גרם וארבע מעלות צלזיוס. יוצקים את הסופרנאטנט המתקבל, ובתנועות מערבולות עדינות של המברשת, משעים מחדש את הגלולה ב-12 מיליליטר של R 0.2 בינוני, המכיל 0.2 סוכרוז טוחן.לאחר השעיית הגלולה בבקבוק אחד, מוסיפים את המתלה לבקבוק הבא וחוזרים על המתלים כדי לאגד את המתלים לבקבוק אחד. מפזרים את המתלה המשולב בין שישה צינורות אולטרה-צנטריפוגות של שלושה מיליליטר, ומגיעים לנפח מרבי של 2.5 מיליליטר בכל צינור. לאחר מכן השתמש בסוניקטור החוד באמפליטודה של 100% כדי לסניק כל צינור ארבע פעמים למשך 10 שניות כל אחת.הקפד לשמור על קרן הסוניקטור שקועה והרחק מפני השטח הנוזליים כדי למנוע הקצפה. הזיזו באיטיות את קרן הסוניקטור מעלה ומטה בתוך המתלה במהלך כל סיבוב. תוך כדי חילופין בין ארבעת הצינורות, החזירו כל צינור לדלי קרח לאחר כל סוניקציה כדי לאפשר לדגימה להתקרר.לאחר שתסיים, צנטריפוגו את המתלה התילקואיד הגולמי הסוניק ב 150, 000 G למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. רפרף על משטח הכרית באמצעות מזרק ומחט מד 22 וקצור את כרית הציפה הצהובה והשמנונית המתקבלת של פלסטוגלובולים גולמיים מכרית הסוכרוז. לשחזר כ 500 מיקרוליטר מכל צינור ולהפקיד אותם לתוך צינור 2.0 מיליליטר.לאסוף aliquots thylakoid גס לפני ואחרי סוניקציה ושחרור של plastoglobules. לאחר שתסיים, או להמשיך את עיבוד רקמות הצמח או לאחסן את הפלסטוגלובולים הגולמי במינוס 80 מעלות צלזיוס ולטהר אותם מאוחר יותר. לגדל 50 מיליליטר של מיני סינכוציסטיס PCC 6802 תרבית במדיה BG11 במשך 7 עד 10 ימים כדי להגיע לשלב נייח.באמצעות ספקטרופוטומטר, להתאים את צפיפות התא לצפיפות אופטית של 2.0 ב 750 ננומטר. כדי להסיר את הרב-סוכרים, צנטריפוגה 50 מיליליטר של תרבית ולהסיר את supernatant. שטיפה חוזרת של התאים ב 50 מיליליטר של חיץ A פעמיים.להשהות מחדש את הגלולה שטופה ב 25 מיליליטר של חיץ A ולשבור את התאים באמצעות תא לחץ צרפתי ב 1, 100 פאונד אינץ 'מרובע. חזור על התהליך שלוש פעמים בתנאי קור עד שצבע הליזה משתנה מירוק לאדום, כחול, ירוק תחת אור לבן. הסר את aliquot של הומוגנט התא ולשים אותו בצד לאחסון כדגימת תא כוללת מייצגת.להפיץ את ההומוגנט שנוצר בשמונה צינורות אולטרה-צנטריפוגה של שלושה מיליליטר מלאים עד למקסימום של 2.5 מיליליטר בכל צינור. לכסות הומוגנט זה עם 400 מיקרוליטר של R בינוני, לייצר שיפוע צעד. אזנו בזהירות את הצינורות על ידי הוספת R בינוני נוסף לפי הצורך לפני צנטריפוגת הצינורות.הזאב הטסמני ואברונים כבדים אחרים, כולל גופים פוליהידרוקסיאלקנואטים, מראים היווצרות כדוריות, בעוד שפלסטוגלובולים יוצרים פד שמנוני צהוב על או בסמוך לחלק העליון של שיפוע הסוכרוז. קצרו את הכרית הצפה המתקבלת של פלסטוגלובולים גולמיים עם מזרק, כפי שהודגם קודם לכן, והפקידו את הקציר בצינור של שני מיליליטר. יש לגרד פלסטוגלובולים מהצד של דופן צינור האולטרה-צנטריפוגה בעזרת קצה מחט במידת הצורך.או להמשיך עם עיבוד ציאנובקטריה או לאחסן פלסטוגלובולים גולמיים במינוס 80 מעלות צלזיוס ולטהר מאוחר יותר. כדי לקצור את הפלסטוגלובולים הטהורים בשיטת עיבוד רקמות הצמח, הכינו את שיפוע הסוכרוז שתואר קודם לכן באמצעות 500 מיקרוליטר של פלסטוגלובולים גולמיים, 400 מיקרוליטר של מדיום R 0.2, ו-400 מיקרוליטר של R בינוני. לאחר צנטריפוגה, קצרו את המשטח הצף שנוצר של פלסטוגלובולים טהורים לתוך צינור של שני מיליליטר. לאחר ציטוט הפלסטוגלובולים הטהורים והקפאת הבזק של האליציטוטים בחנקן נוזלי, יש לאחסן אותם בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס או להפוך אותם לאבקה יבשה.כדי לקצור פלסטוגלובולים טהורים מציאנובקטריה, צור שיפוע סוכרוז, כפי שהוזכר קודם לכן, באמצעות 500 מיקרוליטר של פלסטוגלובולים גולמיים, 750 מיקרוליטר של בינוני R 0.7, ו 750 מיקרוליטר של בינוני R 0.2. לאחר צנטריפוגה, לאסוף את plastoglobules טהור בצינור 1.5 מיליליטר aliquot פלסטוגלובולים טהורים. לאחר שתסיים, הקפיאו את הפלסטוגלובולים הטהורים בחנקן נוזלי ואחסנו אותם ישירות במינוס 80 מעלות צלזיוס או ליופיליזציה לאבקה יבשה.בשיטה זו נצפתה כמות משמעותית של פלסטוגלובול או חומר טיפתי שומני צף על השכבה העליונה של כרית הסוכרוז. לאחר הצנטריפוגה שלאחר מכן, פלסטוגלובולים מטוהרים התקבלו על או בסמוך לפני השטח של שיפוע הסוכרוז. לאחר הבידוד המוצלח של פלסטוגלובולים, אימונובלוטים שפותחו להערכת טוהר באמצעות נוגדנים שהועלו כנגד Arabidopsis thaliana fibrillin 1a ו- Arabidopsis thaliana photosystem II subunit D1 הראו כי הומולוגים פיברילין היו קשורים בעיקר לתילקואידים מאשר לפלסטוגלובולים.כדי להבטיח מיצוי יעיל ומרוכז של הפד הצף, הניחו את פתח מחט המזרק ממש מתחת לפני השטח הנוזליים של החיץ בעודכם שקועים לחלוטין, ואז משכו בעדינות כלפי מעלה. דגימות פלסטוגלובול מבודדות מקובלות על מחקרים פרוטאומיים או ליפידומיים מאוחרים יותר ושימשו להדגמת השינויים בהרכב החלבון-שומנים הממוקד בתנאים סביבתיים שונים. טכניקה זו אפשרה מחקרים חדשים של פלסטוגלובול, כולל גילוי של פעילות קינאז חלבון הקשורים נוכחות של קומפלקסים חלבונים אוליגומריים באמצעות חקירה ביוכימית לאחר מכן.

Research

JoVE Journal

Biology

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

LeafJ: תוסף ImageJ למדידת צורת עלה חצי אוטומטית

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

בידוד יעיל ומהיר של עוברים משלבים מוקדמים<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; זרעים

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

בידוד והלחנת ניתוח של צמח מונומרים פוליאסטר שומנים ציפורן

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

השומנים מהירה Droplet בידוד פרוטוקול באמצעות ערכת בידוד להקציע אברון

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

לחיתוך וליפיד Droplet כתמים של Oenocytes בתוך דרוזופילה הזחלים

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

הכנה וגידול של חרקים אקסניים עם שתילים מתרבית רקמה למחקרי אינטראקציה של מיקרוביוטה של המעי המארח של חיפושית העלים

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

בידוד ואפיון של פיקוביליזום שלם בציאנובקטריה

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

בידוד וניתוח של שלפוחיות חוץ-תאיות ניתנות למעקב ומתפקדות מהפלזמה והרקמות המוצקות

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

בידוד, אפיון ויישום טיפולי של שלפוחיות חוץ-תאיות מתאי גזע מזנכימליים אנושיים בתרבית

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...