Name: plastoglobule lipid droplet isolation from plant leaf tissue and cyanobacteria
Uploaded: 2022-10-06T14:20:00
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La ricerca nel gruppo di laboratorio di Lundquist è supportata da sovvenzioni NSF (MCB-2034631) e USDA (MICL08607) a P.K.L. Gli autori ringraziano la dott.ssa Carrie Hiser (MSU) per il supporto nello sviluppo del metodo di isolamento dei plastoglobuli cianobatterici.

1. Isolamento dei plastoglobuli grezzi
<ol><li>Estrazione di plastoglobuli grezzi da tessuto fogliare di mais non stressato<ol><li>Acquisire sei piantine di mais sane di circa 3 settimane e quasi nella fase di crescita V5, del peso di circa 120 g.</li>
		<li>Ritagliare tutte le foglie alla base del gambo, immergerle rapidamente in un bagno di ghiaccio e trasportarle nella cella frigorifera.</li>
		<li>Lavorando sotto una lampada di sicurezza verde, rimuovere le foglie di mais dal bagno di ghiaccio e ta...

<ol>
	<li>Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+throughout+the+evolutionary+tree.">Lipid droplets throughout the evolutionary tree.</a> Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).</li><li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+network+of+the+Arabidopsis+plastoglobule+proteome+based+on+quantitative+proteomics+and+genome-wide+coexpression+analysis.">The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis.</a> Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).</li><li>Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+of+plastoglobules+in+chloroplasts+and+chromoplasts.+A+surprising+site+for+differential+accumulation+of+metabolic+enzymes.">Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes.</a> Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).</li><li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+plastoglobule+kinases+ABC1K1+and+ABC1K3+causes+conditional+degreening,+modified+prenyl-lipids,+and+recruitment+of+the+jasmonic+acid+pathway.">Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway.</a> The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).</li><li>Vidi, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tocopherol+cyclase+(VTE1)+localization+and+vitamin+E+accumulation+in+chloroplast+plastoglobule+lipoprotein+particles.">Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+and+the+fine+structure+of+plastids.">Plastoglobuli and the fine structure of plastids.</a> Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).</li><li>Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+in+different+types+of+plastids+from+Allium+cepa+L.">Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L.</a> Planta. 72 (1), 1-13 (1966).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Plastoglobuli+von+Spinat,+ihre+Gr&#246;&#946;e,+Isolierung+und+Lipochinonzusammensetzung.">Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gr&#246;&#946;e, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung.</a> Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+and+lipoquinone+content+of+chloroplasts+from+Cereus+peruvianus+(L)+Mill.">Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill.</a> Planta. 87 (4), 304-310 (1969).</li><li>Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromoplast+ultrastructure+of+Capsicum+carotenoid+mutants+I.+Ultrastructure+and+carotenoid+composition+of+a+new+mutant.">Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant.</a> Zeitschrift f&#252;r Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).</li><li>Hansmann, P., Sitte, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+molecular+structure+of+chromoplast+globules+of+Viola+tricolor.">Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor.</a> Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).</li><li>Steinmuller, D., Tevini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+function+of+plastoglobuli+:+I.+Isolation+and+purification+from+chloroplasts+and+chromoplasts.">Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts.</a> Planta. 163 (2), 201-207 (1985).</li><li>Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proteins+associated+with+plastoglobules+isolated+from+pea+(Pisum+sativum+L.)+chloroplasts.">Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts.</a> Planta. 208 (1), 107-113 (1999).</li><li>Grennan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobule+proteome.">Plastoglobule proteome.</a> Plant Physiology. 147 (2), 443-445 (2008).</li><li>Peramuna, A., Summers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+occurrence+of+lipid+droplets+in+the+cyanobacterium+Nostoc+punctiforme.">Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme.</a> Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).</li><li>Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobules+are+lipoprotein+subcompartments+of+the+chloroplast+that+are+permanently+coupled+to+thylakoid+membranes+and+contain+biosynthetic+enzymes.">Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes.</a> The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).</li><li>Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid+lipid+droplets+at+the+crossroads+of+prenylquinone+metabolism.">Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).</li><li>Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plastoglobules+in+metabolite+repair+in+the+tocopherol+redox+cycle.">Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).</li><li>Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+functional+connections+between+cytoplasmic+and+chloroplast+triacylglycerol+storage.">Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage.</a> Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).</li><li>Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+isolation+from+Arabidopsis+thaliana+leaves.">Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves.</a> Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).</li><li>Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+changes+of+Arabidopsis+thaliana+plastoglobules+facilitate+thylakoid+membrane+remodeling+under+high+light+stress.">Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress.</a> Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).</li><li>Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plastoglobule-localized+protein+AtABC1K6+is+a+Mn2+-dependent+kinase+necessary+for+timely+transition+to+reproductive+growth.">The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth.</a> Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).</li><li>Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+topology+and+membrane+interaction+characteristics+of+plastoglobule-localized+AtFBN1a+and+AtLOX2.">Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2.</a> Plant Signalling &amp; Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).</li><li>Besagni, C., Piller, L. E., Br&#233;h&#233;lin, C., Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plastoglobules+from+Arabidopsis+Plastids+for+Proteomic+Analysis+and+Other+Studies.">Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies.</a> Chloroplast Research in Arabidopsis. , 223-239 (2011).</li><li>Yang, H., Murphy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+preparation,+sucrose+density+gradients+and+two-phase+separation+fractionation+from+five-day-old+Arabidopsis+seedlings.">Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings.</a> Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).</li><li>Kelekar, P., Wei, M., Yang, P., Pazour, G. J., King, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Radial+Spoke+Proteins.">Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins.</a> Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. 92, 181-196 (2009).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear-encoded+synthesis+of+the+D1+subunit+of+photosystem+II+increases+photosynthetic+efficiency+and+crop+yield.">Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield.</a> Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy+reveals+that+senescence+induces+in-situ+and+vacuolar+degradation+of+plastoglobules+in+aging+watermelon+leaves.">Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves.</a> Micron. 80, 135-144 (2016).</li><li>Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+FIBRILLIN4+gene+expression+in+apple+decreases+plastoglobule+plastoquinone+content.">Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content.</a> PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).</li><li>Singh, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIBRILLIN4+is+required+for+plastoglobule+development+and+stress+resistance+in+apple+and+Arabidopsis.">FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gardenia+carotenoid+cleavage+dioxygenase+4a+is+an+efficient+tool+for+biotechnological+production+of+crocins+in+green+and+non-green+plant+tissues.">Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues.</a> Plant Biotechnology Journal. , (2022).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian Journal of Biochemistry &amp; Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li></ol>

Per ridurre al minimo le alterazioni fisiologiche/biochimiche del materiale e proteggere alcuni pigmenti foto- e termo-labili-lipidici che sono un ricco componente dei plastoglobuli, è fondamentale eseguire l'isolamento a 4 °C e al riparo dalla luce. Come indicato sopra, i passaggi iniziali vengono eseguiti nella cella frigorifera sotto una lampada di sicurezza utilizzando una lampadina a emissione verde. Le fasi successive eseguite in laboratorio sono sotto luci soffuse e utilizzano ghiaccio o centrifugazione refriger...

L'attuale comprensione della composizione e della funzione dei plastoglobuli è emersa attraverso studi proteomici e lipidomici dettagliati 1,2,3,4,5. Tali studi sono stati notevolmente aiutati da un metodo rapido ed efficace di isolamento che si basa sulla loro bassissima densità per una separazione efficiente utilizzando gradienti di saccarosio. I metodi iniziali di isolamento dei plastoglobuli sono stati ottenuti da specie come il faggio (Fagus sylvatica), la ginestra scozzese (Sarothamnus scoparius), la cipolla (Allium cepa), gli spinaci (Spinacia oleracea), la viola del pensiero (Viola tricolor), il pepe (Capsicum annuum) e il pisello (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. Un metodo aggiornato per isolare i plastoglobuli cloroplasti in modo più efficiente e con un rendimento migliore è stato successivamente presentato da Ytterberg et al.3,14. Mentre inizialmente impiegato per lo studio dei plastoglobuli dei cloroplasti fogliari di Arabidopsis thaliana, abbiamo impiegato con successo questo metodo aggiornato per il tessuto fogliare sano di altre specie vegetali, sia monocotiledoni che dicotiledoni, tra cui mais (Zea mays), pomodoro (Solanum lycopersicum), erba d'amore (Eragrostis nindensis), falso bromo viola (Brachypodium distachyon) e tabacco selvatico (Nicotiana benthamiana) ; risultati non pubblicati). Inoltre, il metodo di isolamento è stato adattato con successo ai plastoglobuli dei cianobatteri, tra cui Synechocystis sp. PCC 6803 e Anabaena sp. PCC 712015, e al tessuto fogliare essiccato della pianta di resurrezione, E. nindensis.
I plastoglobuli cloroplasti del tessuto fogliare sano sono fisicamente collegati alle membrane tilacoidi16. Nonostante questa continuità fisica, i due sottocompartimenti cloroplasti mantengono composizioni lipidiche e proteiche distinte, sebbene sia stato proposto lo scambio regolato di lipidi e proteine tra i due compartimenti 2,4,17,18,19. Infatti, è stato recentemente proposto un interessante modello di emifusione per il traffico di lipidi neutri tra cloroplasti e citosol19. A causa della continuità fisica dei plastoglobuli e dei tilacoidi, il metodo di isolamento con tessuto fogliare sano inizia con la raccolta di un preparato di tilacoidi grezzi pellettati, che viene successivamente sonicato per separare i plastoglobuli dai tilacoidi, che è in contrasto con i metodi utilizzati per isolare le goccioline lipidiche citosoliche20 . L'ultracentrifugazione su un cuscino di saccarosio fa quindi galleggiare i plastoglobuli a bassa densità attraverso il saccarosio, separandoli efficacemente dai tilacoidi, dai nuclei e da altro materiale ad alta densità. Al contrario, i plastoglobuli nei cianobatteri, così come quelli del tessuto fogliare essiccato, esistono evidentemente in vivo in una forma fluttuante. Quindi, il loro isolamento comporta direttamente il galleggiamento su un gradiente di saccarosio. Questo articolo dimostra il metodo di isolamento dal tessuto fogliare sano e dimostra ulteriormente due varianti che possono essere utilizzate per isolare plastoglobuli da tessuto fogliare essiccato o colture cianobatteriche, espandendo notevolmente l'ampiezza fisiologica e il contesto evolutivo in cui i plastoglobuli possono essere studiati.
I plastoglobuli isolati possono successivamente essere utilizzati per qualsiasi numero di analisi a valle per studiare le caratteristiche molecolari. Abbiamo utilizzato i plastoglobuli isolati dal tessuto fogliare di A. thaliana per estese analisi proteomiche e lipidomiche in diverse condizioni ambientali o genotipi, dimostrando la modificazione selettiva della composizione proteica e lipidica in adattamento allo stress 2,4,21,22. Inoltre, sono stati eseguiti saggi chinasici in vitro che dimostrano attività di trans-fosforilazione associata a plastoglobuli isolati 22, gli stati oligomerici dei componenti proteici sono stati studiati utilizzando l'elettroforesi su gel nativa 21 e sono stati eseguiti saggi di rasatura della proteasi23.
Il vantaggio principale di questo metodo è la velocità relativa della procedura. Nella nostra esperienza, i protocolli descritti di seguito possono essere completati completamente entro circa 4 ore. È stato descritto un metodo alternativo per isolare i plastoglobuli dal tessuto fogliare, che consente l'isolamento simultaneo di altri sottocompartimenti del cloroplasto24. Questo metodo alternativo offre alcuni chiari vantaggi quando è necessario o desiderato un confronto quantitativo con gli altri sottocompartimenti del cloroplasto. Tuttavia, questo metodo alternativo è anche più noioso e fornirà una resa significativamente inferiore di plastoglobuli isolati da quantità comparabili di tessuto fogliare. Quando l'obiettivo è uno studio mirato dei plastoglobuli, la metodologia qui delineata è la scelta ottimale. Tuttavia, durante la preparazione del campione è possibile raccogliere aliquote totali di foglie e tilacoidi grezzi ed è altamente raccomandato di farlo, per avere campioni di riferimento per il successivo confronto.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AEBSF</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antipain.2HCl</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>H-1765.0050BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>A6106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B8385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>35675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Proliant Biological</td>
			<td>68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chymostatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eragrostis nindensis</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-64</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure cell (model FA-079)</td>
			<td>SLM/Aminco</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron shaking incubator</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-ramidon.2 Na</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>M16050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced Cysteine</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>101444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ortho-vanadate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyrophosphate &#183; 10H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18&#34;</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synechocystis sp. PCC 6803</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-TL Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A95761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring Blender (1.2 L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58977-227</td>
			<td>Commercial blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zea mays</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plastoglobule lipid droplet isolation from plant leaf tissue and cyanobacteria

Le goccioline lipidiche dei plastoglobuli sono un sottocompartimento dinamico dei cloroplasti vegetali e dei cianobatteri. Trovati ovunque tra le specie fotosintetiche, si ritiene che svolgano un ruolo centrale nell'adattamento e nel rimodellamento della membrana tilacoide in condizioni ambientali in rapida evoluzione. La capacità di isolare plastoglobuli di elevata purezza ha notevolmente facilitato il loro studio attraverso metodologie proteomiche, lipidomiche e di altro tipo. Con plastoglobuli di elevata purezza e resa, è possibile studiare la loro composizione lipidica e proteica, l'attività enzimatica e la topologia proteica, tra le altre possibili caratteristiche molecolari. Questo articolo presenta un protocollo rapido ed efficace per l'isolamento dei plastoglobuli dai cloroplasti del tessuto fogliare delle piante e presenta variazioni metodologiche per l'isolamento dei plastoglobuli e delle relative strutture di goccioline lipidiche dalle foglie di mais, dal tessuto fogliare essiccato della pianta della resurrezione, Eragrostis nindensis, e dal cianobatterio, Synechocystis PCC 6803. L'isolamento si basa sulla bassa densità di queste particelle ricche di lipidi, che facilita la loro purificazione mediante flottazione della densità del saccarosio. Questa metodologia si rivelerà preziosa nello studio dei plastoglobuli di diverse specie.

Al completamento della fase 1 del protocollo, si dovrebbe essere in grado di vedere facilmente una notevole quantità di materiale di goccioline plastoglobulare / lipidiche galleggiare sopra (o vicino) allo strato superiore del cuscino di saccarosio (Figura 1B-C). Altre frazioni potrebbero anche essere raccolte in questa fase. Ad esempio, i tilacoidi saranno pellettati e potranno essere risospesi con R 0,2 medio per analisi successive. Dopo successiva centri...

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Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

Viene presentato un protocollo rapido ed efficiente per l'isolamento delle goccioline lipidiche di plastoglobulo associate a vari organismi fotosintetici. Il successo della preparazione di plastoglobuli isolati è un primo passo cruciale che precede indagini molecolari dettagliate come analisi proteomiche e lipidomiche.

Isolamento di goccioline lipidiche plastoglobule dal tessuto fogliare vegetale e cianobatteri

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...

L'isolamento di plastoglobuli altamente puri è fondamentale per il loro studio. Un protocollo rapido ed efficace per il loro isolamento che facilita la loro indagine biochimica a valle è presentato qui. Il vantaggio principale di questo metodo è la relativa velocità di procedura e la sua adattabilità a numerose specie vegetali e condizioni ambientali.Particolare attenzione deve essere prestata durante la sonicazione delle risospensioni tilacoidi per garantire una forza sufficiente a rimuovere i plastoglobuli dai tilacoidi e con successiva estrazione di plastoglobuli dal gradiente di saccarosio. A dimostrare questa procedura saranno il Dr.Elsinraju Devadasu, un ricercatore post-dottorato nel mio laboratorio, e Febri Susanto, uno studente di dottorato nel mio laboratorio. Inizia acquistando piantine di tre settimane di sei mais sano, con stadio di crescita V5 e del peso di circa 120 grammi.Ritagliare tutte le foglie alla base del gambo e immergerle rapidamente in un bagno di ghiaccio prima di trasportarle nella cella frigorifera. Lavorando sotto una lampada di sicurezza verde, rimuovere le foglie di mais dal bagno di ghiaccio e tagliarle in pezzi più piccoli di cinque centimetri per cinque usando le forbici. Macinare delicatamente e accuratamente metà del tessuto fogliare tagliato in 350 millilitri del tampone di macinazione a un livello inferiore a sette su un frullatore commerciale.Avviare e arrestare il frullatore da cinque a sei volte per assicurarsi che tutte le foglie siano tagliate. Filtrare l'omogenato attraverso uno strato di panno di nylon da 25 micron su un grande imbuto fino a quattro bottiglie di centrifuga da 250 millilitri. Dopo aver ripetuto la fase di miscelazione con il tessuto fogliare tagliato rimanente, dividere uniformemente il filtrato tra le quattro bottiglie.Prelevare un'aliquota del filtrato fogliare e metterlo da parte per essere conservato come campione rappresentativo totale di foglie. Quindi, centrifugare il filtrato per sei minuti a 1.840 G e quattro gradi Celsius. Versare il surnatante risultante e, con delicati movimenti vorticosi del pennello, risospendere il pellet in 12 millilitri di R 0,2 medio, contenente 0,2 molari di saccarosio.Dopo aver risospeso il pellet in una bottiglia, aggiungere la sospensione alla bottiglia successiva e ripetere la risospensione per raggruppare le sospensioni in una bottiglia. Distribuire la sospensione in pool tra sei tubi ultracentrifuga da tre millilitri, raggiungendo un volume massimo di 2,5 millilitri in ciascun tubo. Quindi utilizzare il sonicatore di punta ad un'ampiezza del 100% per sonicare ogni tubo quattro volte per 10 secondi ciascuno.Assicurarsi di mantenere il corno del sonicatore immerso e lontano dalla superficie del liquido per evitare schiuma. Muovi lentamente il corno del sonicatore su e giù all'interno della sospensione durante ogni round. Mentre si alternano i quattro tubi, riportare ogni tubo in un secchiello del ghiaccio dopo ogni sonicazione per consentire al campione di raffreddarsi.Una volta fatto, centrifugare la sospensione tilacoide grezza sonicata a 150.000 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Scremare la superficie del cuscino usando una siringa e un ago calibro 22 e raccogliere il tampone galleggiante giallo e oleoso risultante di plastoglobuli grezzi dal cuscino di saccarosio. Recuperare circa 500 microlitri da ogni tubo e depositarli in un tubo da 2,0 millilitri.Raccogliere aliquote tilacoidi grezze prima e dopo la sonicazione e il rilascio di plastoglobuli. Una volta fatto, continuare la lavorazione del tessuto vegetale o conservare i plastoglobuli grezzi a meno 80 gradi Celsius e purificarli in seguito. Coltivare 50 millilitri di coltura PCC 6802 della specie di Synechocystis in terreni BG11 per 7-10 giorni per raggiungere la fase stazionaria.Utilizzando uno spettrofotometro, regolare la densità della cella a una densità ottica di 2,0 a 750 nanometri. Per rimuovere i polisaccaridi, centrifugare 50 millilitri di coltura e rimuovere il surnatante. Ripetere il lavaggio delle celle in 50 millilitri di tampone A due volte.Risospendere il pellet lavato in 25 millilitri di tampone A e rompere le celle utilizzando una cella di pressione francese a 1.100 pollici quadrati di libbra. Ripetere il processo tre volte in condizioni fredde fino a quando il colore lisato cambia da verde a rosso, blu, verde sotto luce bianca. Rimuovere l'aliquota dell'omogenato cellulare e metterla da parte per essere conservata come campione rappresentativo totale di cellule.Distribuire l'omogenato risultante in otto tubi ultracentrifuga da tre millilitri riempiti fino a un massimo di 2,5 millilitri in ciascun tubo. Sovrapporre questo omogenato con 400 microlitri di R medio, producendo un gradiente di gradini. Bilanciare attentamente i tubi aggiungendo ulteriore mezzo R se necessario prima di centrifugare i tubi.Il tilacoide e altri organelli più pesanti, compresi i corpi poliidrossialcanoati, mostrano la formazione di pellet, mentre i plastoglobuli formano un cuscinetto oleoso giallo sopra o vicino alla parte superiore del gradiente di saccarosio. Raccogliere il tampone galleggiante risultante di plastoglobuli grezzi con una siringa, come dimostrato in precedenza, e depositare il raccolto in un tubo da due millilitri. Raschiare i plastoglobuli dal lato della parete del tubo ultracentrifuga con una punta dell'ago, se necessario.Continuare con la lavorazione dei cianobatteri o conservare plastoglobuli grezzi a meno 80 gradi Celsius e purificarli in seguito. Per raccogliere i plastoglobuli puri utilizzando il metodo di lavorazione del tessuto vegetale, preparare il gradiente di saccarosio descritto in precedenza utilizzando 500 microlitri di plastoglobuli grezzi, 400 microlitri di R 0,2 medio e 400 microlitri di R. medio. Dopo aver aliquotato i plastoglobuli puri e congelato le aliquote in azoto liquido, conservarle a meno 80 gradi Celsius o liofilizzarle in una polvere secca.Per raccogliere plastoglobuli puri dai cianobatteri, creare un gradiente di saccarosio, come accennato in precedenza, utilizzando 500 microlitri di plastoglobuli grezzi, 750 microlitri di R 0,7 medio e 750 microlitri di R 0,2 medio. Dopo la centrifugazione, raccogliere i plastoglobuli puri in un tubo da 1,5 millilitri e aliquotare i plastoglobuli puri. Una volta fatto, congelare le aliquote dei plastoglobuli puri in azoto liquido e conservarle direttamente a meno 80 gradi Celsius o liofilizzarle in una polvere secca.In questo metodo, una quantità significativa di plastoglobulo o materiale di goccioline lipidiche è stata vista galleggiare sullo strato superiore del cuscino di saccarosio. Dopo successiva centrifugazione, sono stati ottenuti plastoglobuli purificati in corrispondenza o vicino alla superficie del gradiente di saccarosio. Dopo il successo dell'isolamento dei plastoglobuli, gli immunoblot sviluppati per la valutazione della purezza utilizzando anticorpi generati contro la fibrillina 1a di arabidopsis thaliana e la subunità D1 del fotosistema di arabidopsis thaliana II hanno mostrato che gli omologhi della fibrillina erano principalmente associati ai tilacoidi rispetto ai plastoglobuli.Per garantire l'estrazione efficiente e concentrata del tampone galleggiante, posizionare l'orifizio dell'ago della siringa appena sotto la superficie liquida del tampone mentre è completamente immerso, quindi tirare delicatamente verso l'alto. Campioni di plastoglobulo isolati sono suscettibili di successivi studi proteomici o lipidomici e sono stati utilizzati per dimostrare i cambiamenti nella composizione proteica-lipidica mirata in diverse condizioni ambientali. Questa tecnica ha facilitato nuovi studi sul plastoglobulo, compresa la scoperta dell'attività proteico-chinasica associata e la presenza di complessi proteici oligomerici attraverso successive indagini biochimiche.

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