Name: plastoglobule lipid droplet isolation from plant leaf tissue and cyanobacteria
Uploaded: 2022-10-06T14:20:00
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ルンドキスト研究室グループの研究は、NSF(MCB-2034631)およびUSDA(MICL08607)からP.K.L.への助成金によってサポートされています。著者らは、シアノバクテリアプラストグロビュール分離法の開発を支援してくれたキャリー・ハイザー博士(MSU)に感謝の意を表します。

1.粗いプラストグロビュールの分離
<ol><li>ストレスを受けていないトウモロコシ葉組織からの粗プラストグロビュール抽出<ol><li>約3週齢で、ほぼV5の成長段階にあり、重さ約120gの健康なトウモロコシの苗6本を取得します。</li>
		<li>茎の根元にあるすべての葉を切り取り、氷浴にすばやく浸して、冷蔵室に運びます。</li>
		<li>緑色の安全ランプの下で作業し、氷浴からトウモロコ...

<ol>
	<li>Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+throughout+the+evolutionary+tree.">Lipid droplets throughout the evolutionary tree.</a> Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).</li><li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+network+of+the+Arabidopsis+plastoglobule+proteome+based+on+quantitative+proteomics+and+genome-wide+coexpression+analysis.">The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis.</a> Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).</li><li>Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+of+plastoglobules+in+chloroplasts+and+chromoplasts.+A+surprising+site+for+differential+accumulation+of+metabolic+enzymes.">Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes.</a> Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).</li><li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+plastoglobule+kinases+ABC1K1+and+ABC1K3+causes+conditional+degreening,+modified+prenyl-lipids,+and+recruitment+of+the+jasmonic+acid+pathway.">Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway.</a> The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).</li><li>Vidi, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tocopherol+cyclase+(VTE1)+localization+and+vitamin+E+accumulation+in+chloroplast+plastoglobule+lipoprotein+particles.">Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+and+the+fine+structure+of+plastids.">Plastoglobuli and the fine structure of plastids.</a> Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).</li><li>Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+in+different+types+of+plastids+from+Allium+cepa+L.">Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L.</a> Planta. 72 (1), 1-13 (1966).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Plastoglobuli+von+Spinat,+ihre+Gr&#246;&#946;e,+Isolierung+und+Lipochinonzusammensetzung.">Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gr&#246;&#946;e, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung.</a> Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+and+lipoquinone+content+of+chloroplasts+from+Cereus+peruvianus+(L)+Mill.">Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill.</a> Planta. 87 (4), 304-310 (1969).</li><li>Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromoplast+ultrastructure+of+Capsicum+carotenoid+mutants+I.+Ultrastructure+and+carotenoid+composition+of+a+new+mutant.">Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant.</a> Zeitschrift f&#252;r Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).</li><li>Hansmann, P., Sitte, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+molecular+structure+of+chromoplast+globules+of+Viola+tricolor.">Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor.</a> Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).</li><li>Steinmuller, D., Tevini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+function+of+plastoglobuli+:+I.+Isolation+and+purification+from+chloroplasts+and+chromoplasts.">Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts.</a> Planta. 163 (2), 201-207 (1985).</li><li>Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proteins+associated+with+plastoglobules+isolated+from+pea+(Pisum+sativum+L.)+chloroplasts.">Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts.</a> Planta. 208 (1), 107-113 (1999).</li><li>Grennan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobule+proteome.">Plastoglobule proteome.</a> Plant Physiology. 147 (2), 443-445 (2008).</li><li>Peramuna, A., Summers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+occurrence+of+lipid+droplets+in+the+cyanobacterium+Nostoc+punctiforme.">Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme.</a> Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).</li><li>Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobules+are+lipoprotein+subcompartments+of+the+chloroplast+that+are+permanently+coupled+to+thylakoid+membranes+and+contain+biosynthetic+enzymes.">Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes.</a> The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).</li><li>Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid+lipid+droplets+at+the+crossroads+of+prenylquinone+metabolism.">Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).</li><li>Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plastoglobules+in+metabolite+repair+in+the+tocopherol+redox+cycle.">Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).</li><li>Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+functional+connections+between+cytoplasmic+and+chloroplast+triacylglycerol+storage.">Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage.</a> Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).</li><li>Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+isolation+from+Arabidopsis+thaliana+leaves.">Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves.</a> Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).</li><li>Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+changes+of+Arabidopsis+thaliana+plastoglobules+facilitate+thylakoid+membrane+remodeling+under+high+light+stress.">Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress.</a> Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).</li><li>Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plastoglobule-localized+protein+AtABC1K6+is+a+Mn2+-dependent+kinase+necessary+for+timely+transition+to+reproductive+growth.">The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth.</a> Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).</li><li>Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+topology+and+membrane+interaction+characteristics+of+plastoglobule-localized+AtFBN1a+and+AtLOX2.">Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2.</a> Plant Signalling &amp; Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).</li><li>Besagni, C., Piller, L. E., Br&#233;h&#233;lin, C., Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plastoglobules+from+Arabidopsis+Plastids+for+Proteomic+Analysis+and+Other+Studies.">Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies.</a> Chloroplast Research in Arabidopsis. , 223-239 (2011).</li><li>Yang, H., Murphy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+preparation,+sucrose+density+gradients+and+two-phase+separation+fractionation+from+five-day-old+Arabidopsis+seedlings.">Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings.</a> Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).</li><li>Kelekar, P., Wei, M., Yang, P., Pazour, G. J., King, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Radial+Spoke+Proteins.">Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins.</a> Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. 92, 181-196 (2009).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear-encoded+synthesis+of+the+D1+subunit+of+photosystem+II+increases+photosynthetic+efficiency+and+crop+yield.">Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield.</a> Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy+reveals+that+senescence+induces+in-situ+and+vacuolar+degradation+of+plastoglobules+in+aging+watermelon+leaves.">Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves.</a> Micron. 80, 135-144 (2016).</li><li>Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+FIBRILLIN4+gene+expression+in+apple+decreases+plastoglobule+plastoquinone+content.">Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content.</a> PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).</li><li>Singh, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIBRILLIN4+is+required+for+plastoglobule+development+and+stress+resistance+in+apple+and+Arabidopsis.">FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gardenia+carotenoid+cleavage+dioxygenase+4a+is+an+efficient+tool+for+biotechnological+production+of+crocins+in+green+and+non-green+plant+tissues.">Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues.</a> Plant Biotechnology Journal. , (2022).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian Journal of Biochemistry &amp; Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li></ol>

材料に対する生理学的/生化学的変化を最小限に抑え、プラストグロビュールの豊富な成分である特定の光および熱に不安定なプレニル脂質色素を保護するには、4°Cで光から保護するために分離を行うことが重要です。上記のように、最初のステップは、緑色に発光する電球を使用して、安全ランプの下の冷蔵室で実行されます。実験室で行われる後続のステップは、薄暗い照明の下で行わ?...

プラストグロビュールの組成と機能の現在の理解は、詳細なプロテオミクスおよびリピドミクス研究を通じて明らかになりました1,2,3,4,5。このような研究は、スクロース勾配を使用した効率的な分離のために非常に低い密度に依存する迅速かつ効果的な単離方法によって大いに助けられてきました。プラストグロビュールの分離の初期方法は、ブナの木(Fagus sylvatica)、スコッチほうき(Sarothamnus scoparius)、タマネギ(アリウムセパ)、ほうれん草(Spinacia oleracea)、パンジー(Viola tricolor)、コショウ(トウガラシ)、エンドウ豆(Pisum sativum)などの種から達成されました6,7,8,9,10,11 、12、13。葉緑体プラストグロビュールをより効率的かつより良い収量で単離するための更新された方法は、後にYtterbergらによって提示されました3,14。当初はシロイヌナズナの葉葉緑体のプラストグロビュールの研究に採用されていましたが、トウモロコシ(Zea mays)、トマト(Solanum lycopersicum)、ラブグラス(Eragrostis nindensis)、紫色の偽ブロム(Brachypodium distachyon)、野生のタバコ(Nicotiana benthamiana)など、単子葉植物と双子葉植物の両方の健康な葉組織にこの更新された方法を採用することに成功しました。;未発表の結果)。さらに、この分離法は、Synechocystis sp. PCC 6803およびAnabaena sp. PCC 712015を含むシアノバクテリアのプラスト小球、および復活植物E. nindensisの乾燥葉組織に適応することに成功しています。
健康な葉組織の葉緑体プラストグロビュールは、チラコイド膜16に物理的に接続されている。この物理的連続性にもかかわらず、2つの葉緑体サブコンパートメントは異なる脂質およびタンパク質組成を維持するが、2つのコンパートメント間の脂質およびタンパク質の調節された交換が提案されている2,4,17,18,19。実際、葉緑体と細胞質ゾルの間の中性脂質の輸送について、興味深い半融合モデルが最近提案されています19。プラストグロビュールおよびチラコイドの物理的連続性のために、健康な葉組織を有する単離方法は、ペレット化された粗チラコイド調製物の収集から始まり、その後、細胞質ゾル脂肪滴を単離するために使用される方法とは対照的に、チラコイドからプラストグロビュールを分離するために超音波処理される20.次に、スクロースクッション上での超遠心分離により、低密度プラストグロビュールがスクロースを通って浮遊し、チラコイド、核、およびその他の高密度材料から効果的に分離されます。対照的に、シアノバクテリアのプラストグロビュールは、乾燥した葉組織のプラストグロビュールと同様に、明らかに自由に浮遊する形で生体内に存在する。したがって、それらの単離は、スクロース勾配に直接浮遊することを含む。この記事では、健康な葉組織からの分離方法を示し、さらに、乾燥した葉組織またはシアノバクテリア培養物からプラストグロビュールを分離するために使用できる2つのバリエーションを示し、プラストグロビュールを研究できる生理学的幅と進化のコンテキストを大幅に拡大します。
単離されたプラストグロビュールは、その後、分子特性を調査するための任意の数のダウンストリーム分析に使用できます。我々は、A. thaliana葉組織から単離されたプラストグロビュールを、異なる環境条件または遺伝子型の下での広範なプロテオミクスおよびリピドミクス解析に使用し、ストレスに適応したタンパク質および脂質組成の選択的修飾を実証しました2,4,21,22。さらに、単離されたプラストグロビュールに関連するトランスリン酸化活性を示すインビトロキナーゼアッセイが実施されており22、タンパク質成分のオリゴマー状態が天然ゲル電気泳動を使用して調査されており21、プロテアーゼシェービングアッセイが実施されています23。
この方法の主な利点は、手順の相対的な速度です。私たちの経験では、以下に概説するプロトコルは約4時間以内に完全に完了することができます。葉組織からプラストグロビュールを単離する代替方法が記載されており、これにより、他の葉緑体サブ区画の同時単離が可能になる24。この代替方法は、他の葉緑体サブコンパートメントとの定量的比較が必要または望ましい場合に、いくつかの明確な利点を提供します。しかしながら、この代替方法もまたより面倒であり、そして同量の葉組織から単離されたプラスト小球の有意に低い収量を提供するであろう。プラストグロビュースの焦点を絞った研究が目的である場合、ここで概説する方法論が最適な選択です。それにもかかわらず、全葉および粗チラコイドアリコートはサンプル調製中に収集することができ、その後の比較のために参照サンプルを用意することを強くお勧めします。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AEBSF</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antipain.2HCl</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>H-1765.0050BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>A6106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B8385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>35675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Proliant Biological</td>
			<td>68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chymostatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eragrostis nindensis</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-64</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure cell (model FA-079)</td>
			<td>SLM/Aminco</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron shaking incubator</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-ramidon.2 Na</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>M16050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced Cysteine</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>101444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ortho-vanadate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyrophosphate &#183; 10H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18&#34;</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synechocystis sp. PCC 6803</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-TL Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A95761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring Blender (1.2 L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58977-227</td>
			<td>Commercial blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zea mays</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plastoglobule lipid droplet isolation from plant leaf tissue and cyanobacteria

プラストグロビュール脂肪滴は、植物の葉緑体とシアノバクテリアの動的なサブコンパートメントです。光合成種に遍在しており、急速に変化する環境条件下でのチラコイド膜の適応とリモデリングにおいて中心的な役割を果たすと考えられています。高純度のプラストグロビュールを単離する能力は、プロテオミクス、リピドミック、およびその他の方法論による研究を大幅に促進しました。高純度と高収率のプラストグロビュールを使用すると、脂質やタンパク質の組成、酵素活性、タンパク質トポロジーなどの分子特性を調べることができます。この記事では、植物の葉組織の葉緑体からプラストグロビュールを分離するための迅速かつ効果的なプロトコルを提示し、トウモロコシの葉、復活植物の乾燥葉組織、 エラグロスチスニンデンシス、およびシアノバクテリウム、 シネコシスティス からプラストグロビュールおよび関連する脂肪滴構造を単離するための方法論的バリエーションを提示します PCC 6803。単離は、これらの脂質に富む粒子の低密度に依存しており、スクロース密度浮遊選鉱による精製を容易にします。この方法論は、多様な種からのプラストグロビュールの研究において有用であることが証明されます。

プロトコルのステップ1が完了すると、かなりの量のプラストグロビュール/脂質液滴物質がスクロースクッションの最上層(またはその近く)に浮かんでいるのを容易に見ることができるはずです(図1B-C)。この段階で他の画分も収集できます。例えば、チラコイドはペレット化され、その後の分析のために培地R 0.2で再懸濁することができる。その...

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Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

様々な光合成生物に関連するプラストグロビュール脂肪滴を単離するための迅速かつ効率的なプロトコルが提示されています。単離されたプラストグロビュールの調製を成功させることは、プロテオミクス解析やリピドミック解析などの詳細な分子調査に先立つ重要な第一歩です。

プラストグロビュール 植物葉組織およびシアノバクテリアからの脂肪滴分離

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...

高純度のプラストグロビュールの単離は、彼らの研究にとって重要です。ここでは、下流の生化学的調査を容易にする、それらの分離のための迅速かつ効果的なプロトコルを紹介します。この方法の主な利点は、手順の相対的な速度と、多数の植物種および環境条件への適応性です。チラコイドからプラストグロビュールを除去するのに十分な力を確保し、その後スクロース勾配からプラストグロビューを抽出するために、チラコイド再懸濁液を超音波処理する際に特別な注意を払う必要があります。この手順を実演するのは、私の研究室のポスドク研究員であるエルシンラジュ・デヴァダス博士と、私の研究室の博士課程の学生であるフェブリ・スサント博士です。V5の成長段階を持ち、重さ約120グラムの6つの健康なトウモロコシの3週齢の苗を取得することから始めます。茎の付け根にあるすべての葉を切り取り、氷浴にすばやく浸してから冷蔵室に運びます。緑色の安全ランプの下で作業し、氷浴からトウモロコシの葉を取り除き、はさみを使用してそれらを小さな5×5センチメートルの断片に切り取ります。クリップされた葉組織の半分を350ミリリットルの粉砕バッファーで、市販のブレンダーで7未満のレベルで穏やかかつ徹底的に粉砕します。ブレンダーを5〜6回起動および停止して、すべての葉が確実にカットされるようにします。ホモジネートを大きな漏斗上の25ミクロンナイロン布の1層を通して4本の250ミリリットルの遠心分離機ボトルにろ過します。残りの切り取られた葉組織でブレンド工程を繰り返した後、濾液を4本のボトルの間で均等に分ける。葉のろ液のアリコートを取り除き、代表的な総葉サンプルとして保存するために取っておきます。次に、ろ液を1, 840 Gおよび摂氏4度で6分間遠心分離する。得られた上清を注ぎ、ブラシを穏やかに旋回させながら、0.2モルのスクロースを含む12ミリリットルの培地R 0.2にペレットを再懸濁します。ペレットを1本のボトルに再懸濁した後、懸濁液を次のボトルに追加し、再懸濁を繰り返して懸濁液を1本のボトルにプールします。プールされた懸濁液を6本の3ミリリットルの超遠心チューブに分配し、各チューブの最大容量2.5ミリリットルに達する。次に、100%の振幅でチップ超音波処理器を使用して、各チューブをそれぞれ10秒間4回超音波処理します。泡立ちを防ぐために、超音波処理器ホーンを水没させ、液面から遠ざけてください。各ラウンド中にサスペンション内で超音波処理器ホーンをゆっくりと上下に動かします。4本のチューブを交互にしながら、各超音波処理後に各チューブをアイスバケットに戻し、サンプルを冷却します。完了したら、超音波処理された粗チラコイド懸濁液を摂氏4度で30分間150, 000Gで遠心分離します。シリンジと22ゲージの針を使用してクッション表面をすくい取り、得られた黄色と油性の粗プラストグロビュールのフローティングパッドをショ糖クッションから採取します。各チューブから約500マイクロリットルを回収し、2.0ミリリットルのチューブに入れます。プラストグロビュールの超音波処理と放出の前後に粗チラコイドアリコートを収集します。完了したら、植物組織の処理を続けるか、粗プラストグロビュールを摂氏マイナス80度で保管し、後で精製します。50ミリリットルのシネコシスチス種PCC 6802培養物をBG11培地で7〜10日間成長させて、固定期に到達します。分光光度計を使用して、細胞密度を750ナノメートルで2.0の光学密度に調整します。多糖類を除去するには、50ミリリットルの培養液を遠心分離し、上清を除去する。50ミリリットルの緩衝液Aで細胞の洗浄を2回繰り返す。洗浄したペレットを25ミリリットルの緩衝液Aに再懸濁し、1, 100ポンド平方インチのフレンチ圧力セルを使用して細胞を破砕する。白色光の下で溶解した色が緑から赤、青、緑に変わるまで、寒い条件でこのプロセスを3回繰り返します。細胞ホモジネートのアリコートを除去し、代表的な全細胞サンプルとして保存するために取っておきます。得られたホモジネートを、各チューブに最大2.5ミリリットルまで充填された8本の3ミリリットルの超遠心チューブに分配します。このホモジネートを400マイクロリットルの培地Rと重ね合わせ、ステップグラジエントを生成します。チューブを遠心分離する前に、必要に応じて培地Rを追加して、チューブのバランスを慎重にとってください。チラコイドおよびポリヒドロキシアルカノエート体を含む他のより重い細胞小器官はペレット形成を示し、プラストグロビュールはスクロース勾配の上部またはその近くに黄色の油性パッドを形成します。前に示したように、得られた粗プラストグロビュールのフローティングパッドを注射器で収穫し、収穫物を2ミリリットルのチューブに入れます。必要に応じて、針先で超遠心管壁の側面からプラストグロビュールをこすり落とします。シアノバクテリアの処理を続けるか、粗プラストグロビュールを摂氏マイナス80度で保存し、後で精製します。植物組織処理法を用いて純粋なプラストグロビュールを収穫するには、500マイクロリットルの粗プラストグロビュール、400マイクロリットルの培地R 0.2、および400マイクロリットルの培地Rを用いて前述のスクロース勾配を調製し、遠心分離後、得られた純粋なプラストグロビュールのフローティングパッドを2ミリリットルのチューブに収穫する。純粋なプラストグロビュールを分注し、液体窒素でアリコートを瞬間凍結した後、摂氏マイナス80度で保管するか、凍結乾燥して乾燥粉末にします。シアノバクテリアから純粋なプラストグロビュールを収穫するには、前述のように、500マイクロリットルの粗プラストグロビュール、750マイクロリットルの培地R 0.7、および750マイクロリットルの培地R 0.2を使用してスクロース勾配を作成します。遠心分離後、純粋なプラストグロビュールを1.5ミリリットルのチューブに集め、純粋なプラストグロビュールを分注します。完了したら、液体窒素でアリコートした純粋なプラストグロビュールを瞬間凍結し、摂氏マイナス80度で直接保管するか、凍結乾燥して乾燥粉末にします。この方法では、かなりの量のプラストグロビュールまたは脂肪滴物質がスクロースクッションの最上層に浮遊しているのが見られた。その後の遠心分離後、スクロース勾配の表面またはその近くで精製プラストグロビュールが得られた。プラストグロビュールの単離に成功した後、シロイヌナズナフィブリリン1aおよびシロイヌナズナ光化学系IIサブユニットD1に対して産生された抗体を用いて純度評価のために開発されたイムノブロットは、フィブリリンホモログがプラストグロビュールよりもチラコイドと主に関連していることを示しました。フローティングパッドを効率的かつ濃縮して抽出するには、シリンジニードルオリフィスを完全に水没させた状態でバッファーの液面のすぐ下に置き、ゆっくりと引き上げます。単離されたプラストグロビュールサンプルは、その後のプロテオミクスまたはリピドミクス研究に適しており、さまざまな環境条件下での標的タンパク質-脂質組成の変化を実証するために使用されています。この技術は、その後の生化学的調査を通じて、関連するプロテインキナーゼ活性の発見やオリゴマータンパク質複合体の存在など、プラストグロビュールの新しい研究を促進しました。

Research

JoVE Journal

Biology

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

LeafJ：半自動化された葉の形状計測のためのImageJのプラグイン

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

から初期段階の胚の効率的かつ迅速な単離<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;種子

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

植物キューティクル脂質ポリエステルモノマーの単離と組成分析

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

老舗のオルガネラの分離キットを使用して急速な脂質液滴の隔離のプロトコル

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

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ショウジョウバエ幼虫における大鼻細胞の解剖と脂質液滴染色

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

葉甲虫の宿主 - 腸内微生物叢相互作用研究のための組織培養苗木を用いた軸状昆虫の調製および飼育

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

シアノバクテリアにおけるインタクトフィコビリソームの分離と特徴付け

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

血漿および固体組織からのトレーサブルおよび機能化された細胞外小胞の単離と分析

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

培養ヒト間葉系幹細胞からの細胞外小胞の単離、特性評価、および治療応用

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

プラストグロビュール 植物葉組織およびシアノバクテリアからの脂肪滴分離

プラストグロビュール植物葉組織およびシアノバクテリアからの脂肪滴分離