Name: plastoglobule lipid droplet isolation from plant leaf tissue and cyanobacteria
Uploaded: 2022-10-06T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria at JoVE.com

Lundquist 실험실 그룹의 연구는 NSF (MCB-2034631) 및 USDA (MICL08607)에서 PKL에 대한 보조금으로 지원됩니다. 저자는 시아노박테리아 플라스토글로불 분리 방법의 개발에 대한 지원에 대해 Dr. Carrie Hiser(MSU)에게 감사를 표합니다.

1. 원유 플라스토글로블 분리
<ol><li>스트레스를받지 않은 옥수수 잎 조직에서 추출한 원유 플라스토글로블 추출<ol><li>약 3 주 된 6 개의 건강한 옥수수 묘목을 획득하고 거의 V5 성장 단계에 있으며 무게는 약 120g입니다.</li>
		<li>줄기 바닥에있는 모든 잎을 잘라 내고 얼음 욕조에 빠르게 담그고 차가운 방으로 옮깁니다.</li>
		<li>녹색 안전 램프 아래에서 작업하면서 얼음 욕조에서 옥?...

<ol>
	<li>Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+throughout+the+evolutionary+tree.">Lipid droplets throughout the evolutionary tree.</a> Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).</li><li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+network+of+the+Arabidopsis+plastoglobule+proteome+based+on+quantitative+proteomics+and+genome-wide+coexpression+analysis.">The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis.</a> Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).</li><li>Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+of+plastoglobules+in+chloroplasts+and+chromoplasts.+A+surprising+site+for+differential+accumulation+of+metabolic+enzymes.">Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes.</a> Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).</li><li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+plastoglobule+kinases+ABC1K1+and+ABC1K3+causes+conditional+degreening,+modified+prenyl-lipids,+and+recruitment+of+the+jasmonic+acid+pathway.">Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway.</a> The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).</li><li>Vidi, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tocopherol+cyclase+(VTE1)+localization+and+vitamin+E+accumulation+in+chloroplast+plastoglobule+lipoprotein+particles.">Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+and+the+fine+structure+of+plastids.">Plastoglobuli and the fine structure of plastids.</a> Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).</li><li>Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+in+different+types+of+plastids+from+Allium+cepa+L.">Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L.</a> Planta. 72 (1), 1-13 (1966).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Plastoglobuli+von+Spinat,+ihre+Gr&#246;&#946;e,+Isolierung+und+Lipochinonzusammensetzung.">Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gr&#246;&#946;e, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung.</a> Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+and+lipoquinone+content+of+chloroplasts+from+Cereus+peruvianus+(L)+Mill.">Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill.</a> Planta. 87 (4), 304-310 (1969).</li><li>Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromoplast+ultrastructure+of+Capsicum+carotenoid+mutants+I.+Ultrastructure+and+carotenoid+composition+of+a+new+mutant.">Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant.</a> Zeitschrift f&#252;r Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).</li><li>Hansmann, P., Sitte, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+molecular+structure+of+chromoplast+globules+of+Viola+tricolor.">Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor.</a> Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).</li><li>Steinmuller, D., Tevini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+function+of+plastoglobuli+:+I.+Isolation+and+purification+from+chloroplasts+and+chromoplasts.">Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts.</a> Planta. 163 (2), 201-207 (1985).</li><li>Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proteins+associated+with+plastoglobules+isolated+from+pea+(Pisum+sativum+L.)+chloroplasts.">Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts.</a> Planta. 208 (1), 107-113 (1999).</li><li>Grennan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobule+proteome.">Plastoglobule proteome.</a> Plant Physiology. 147 (2), 443-445 (2008).</li><li>Peramuna, A., Summers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+occurrence+of+lipid+droplets+in+the+cyanobacterium+Nostoc+punctiforme.">Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme.</a> Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).</li><li>Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobules+are+lipoprotein+subcompartments+of+the+chloroplast+that+are+permanently+coupled+to+thylakoid+membranes+and+contain+biosynthetic+enzymes.">Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes.</a> The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).</li><li>Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid+lipid+droplets+at+the+crossroads+of+prenylquinone+metabolism.">Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).</li><li>Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plastoglobules+in+metabolite+repair+in+the+tocopherol+redox+cycle.">Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).</li><li>Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+functional+connections+between+cytoplasmic+and+chloroplast+triacylglycerol+storage.">Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage.</a> Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).</li><li>Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+isolation+from+Arabidopsis+thaliana+leaves.">Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves.</a> Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).</li><li>Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+changes+of+Arabidopsis+thaliana+plastoglobules+facilitate+thylakoid+membrane+remodeling+under+high+light+stress.">Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress.</a> Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).</li><li>Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plastoglobule-localized+protein+AtABC1K6+is+a+Mn2+-dependent+kinase+necessary+for+timely+transition+to+reproductive+growth.">The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth.</a> Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).</li><li>Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+topology+and+membrane+interaction+characteristics+of+plastoglobule-localized+AtFBN1a+and+AtLOX2.">Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2.</a> Plant Signalling &amp; Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).</li><li>Besagni, C., Piller, L. E., Br&#233;h&#233;lin, C., Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plastoglobules+from+Arabidopsis+Plastids+for+Proteomic+Analysis+and+Other+Studies.">Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies.</a> Chloroplast Research in Arabidopsis. , 223-239 (2011).</li><li>Yang, H., Murphy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+preparation,+sucrose+density+gradients+and+two-phase+separation+fractionation+from+five-day-old+Arabidopsis+seedlings.">Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings.</a> Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).</li><li>Kelekar, P., Wei, M., Yang, P., Pazour, G. J., King, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Radial+Spoke+Proteins.">Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins.</a> Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. 92, 181-196 (2009).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear-encoded+synthesis+of+the+D1+subunit+of+photosystem+II+increases+photosynthetic+efficiency+and+crop+yield.">Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield.</a> Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy+reveals+that+senescence+induces+in-situ+and+vacuolar+degradation+of+plastoglobules+in+aging+watermelon+leaves.">Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves.</a> Micron. 80, 135-144 (2016).</li><li>Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+FIBRILLIN4+gene+expression+in+apple+decreases+plastoglobule+plastoquinone+content.">Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content.</a> PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).</li><li>Singh, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIBRILLIN4+is+required+for+plastoglobule+development+and+stress+resistance+in+apple+and+Arabidopsis.">FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gardenia+carotenoid+cleavage+dioxygenase+4a+is+an+efficient+tool+for+biotechnological+production+of+crocins+in+green+and+non-green+plant+tissues.">Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues.</a> Plant Biotechnology Journal. , (2022).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian Journal of Biochemistry &amp; Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li></ol>

재료의 생리적/생화학적 변화를 최소화하고 플라스토글로불의 풍부한 성분인 특정 광학적 및 열에 불안정한 프레닐 지질 안료를 보호하려면 4°C에서 분리를 수행하고 빛으로부터 보호하는 것이 중요합니다. 위에서 지적한 바와 같이, 초기 단계는 녹색 발광 전구를 사용하여 안전 램프 아래의 냉장실에서 수행됩니다. 실험실에서 수행되는 후속 단계는 희미한 조명 아래에서 얼음 또는 냉장 원심 ?...

플라스토글로불 구성 및 기능에 대한 현재의 이해는 상세한 단백질체학 및 지질체 연구 1,2,3,4,5를 통해 나타났습니다. 이러한 연구는 자당 구배를 사용하여 효율적인 분리를 위해 매우 낮은 밀도에 의존하는 신속하고 효과적인 분리 방법에 의해 크게 도움이되었습니다. 너도밤 나무 (Fagus sylvatica), 스카치 빗자루 (Sarothamnus scoparius), 양파 (부추 속 세파), 시금치 (Spinacia oleracea), 팬지 (비올라 삼색), 후추 (고추 일년) 및 완두콩 (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. 엽록체 플라스토글로블을 보다 효율적이고 더 나은 수율 방식으로 분리하는 업데이트된 방법이 나중에 Ytterberg et al.3,14에 의해 제시되었습니다. 처음에는 Arabidopsis thaliana 잎 엽록체의 플라스토글로블 연구에 사용되었지만 옥수수(Zea mays), 토마토(Solanum lycopersicum), 러브그래스(Eragrostis nindensis), 보라색 거짓 브롬(Brachypodium distachyon) 및 야생 담배(Nicotiana benthamiana)를 포함한 다른 식물 종의 건강한 잎 조직에 이 업데이트된 방법을 성공적으로 사용했습니다. ; 미공개 결과). 또한, 분리 방법은 Synechocystis sp. PCC 6803 및 Anabaena sp. PCC 712015를 포함한 시아 노 박테리아의 플라 스토 글로 블과 부활 식물 인 E. nindensis의 건조 된 잎 조직에 성공적으로 적용되었습니다.
건강한 잎 조직의 엽록체 플라스토글로블은 틸라코이드 막(16)에 물리적으로 연결되어 있다. 이러한 물리적 연속성에도 불구하고, 2개의 엽록체 서브-구획은 뚜렷한 지질 및 단백질 조성을 유지하지만, 2개의 구획 사이의 지질과 단백질의 조절된 교환이 제안되었다 2,4,17,18,19. 사실, 흥미로운 반 융합 모델이 최근 엽록체와 세포질19 사이의 중성 지질 밀매에 대해 제안되었습니다. 플라스토글로블과 틸라코이드의 물리적 연속성으로 인해, 건강한 잎 조직을 이용한 분리 방법은 펠렛화된 조잡한 틸라코이드 제제의 수집으로 시작되며, 이어서 초음파 처리되어 플라스토글로블을 틸라코이드로부터 분리하는데, 이는 세포질 지질 방울을 분리하는 데 사용되는 방법과 대조된다20 . 그런 다음 자당 쿠션에서 초원심분리하면 저밀도 플라스토글로블이 자당을 통해 위로 떠올라 틸라코이드, 핵 및 기타 고밀도 물질에서 효과적으로 분리됩니다. 대조적으로, 시아노박테리아의 플라스토글로구와 건조된 잎 조직의 플라스토글로불은 생체 내에서 자유롭게 떠다니는 형태로 존재하는 것 같습니다. 따라서 이들의 격리에는 자당 구배에 직접 떠 있는 것이 포함됩니다. 이 기사는 건강한 잎 조직에서 분리 방법을 보여주고 건조 된 잎 조직 또는 시아 노 박테리아 배양에서 플라 스토 글로 블을 분리하는 데 사용할 수있는 두 가지 변형을 보여 주어 플라 스토 글로 불을 연구 할 수있는 생리 학적 폭과 진화 적 맥락을 크게 확장합니다.
분리된 플라스토글로불은 분자 특성을 조사하기 위해 여러 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다. 우리는 다양한 환경 조건 또는 유전자형에서 광범위한 단백질체 및 지질체 분석을 위해 A. thaliana 잎 조직에서 분리된 플라스토글로불을 사용하여 스트레스 2,4,21,22에 적응하여 단백질 및 지질 조성의 선택적 변형을 입증했습니다. 또한, 단리된 플라스토글로불과의 연관된 트랜스-인산화 활성을 입증하는 시험관내 키나아제 분석이 수행되었고(22), 단백질 성분의 올리고머 상태가 천연 겔 전기영동(21)을 사용하여 조사되었으며, 프로테아제-면도 분석(23)이 수행되었다.
이 방법의 주요 이점은 절차의 상대적 속도입니다. 경험상 아래에 설명된 프로토콜은 약 4시간 이내에 완전히 완료될 수 있습니다. 잎 조직으로부터 플라스토글로불을 단리하는 대안적인 방법이 설명되었으며, 이는 다른 엽록체 하위구획(24)의 동시 단리를 허용한다. 이 대안적인 방법은 다른 엽록체 하위 구획과의 정량적 비교가 필요하거나 원할 때 몇 가지 분명한 이점을 제공합니다. 그러나,이 대체 방법은 또한 더 지루하며 비슷한 양의 잎 조직으로부터 분리 된 플라스토 글로 블의 수율을 상당히 낮출 것이다. plastoglobules에 대한 집중적 인 연구가 목표 인 경우 여기에 설명 된 방법론이 최적의 선택입니다. 그럼에도 불구하고 샘플 준비 중에 총 잎 및 미정제 틸라코이드 분취량을 수집할 수 있으며 후속 비교를 위해 참조 샘플을 확보하는 것이 좋습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AEBSF</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antipain.2HCl</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>H-1765.0050BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>A6106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B8385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>35675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Proliant Biological</td>
			<td>68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chymostatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eragrostis nindensis</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-64</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure cell (model FA-079)</td>
			<td>SLM/Aminco</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron shaking incubator</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-ramidon.2 Na</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>M16050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced Cysteine</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>101444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ortho-vanadate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyrophosphate &#183; 10H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18&#34;</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synechocystis sp. PCC 6803</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-TL Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A95761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring Blender (1.2 L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58977-227</td>
			<td>Commercial blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zea mays</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plastoglobule lipid droplet isolation from plant leaf tissue and cyanobacteria

Plastoglobule 지질 방울은 식물 엽록체와 시아 노 박테리아의 동적 하위 구획입니다. 광합성 종들 사이에서 유비쿼터스로 발견되는 그들은 빠르게 변화하는 환경 조건에서 틸라코이드 막의 적응 및 리모델링에 중심적인 역할을 하는 것으로 믿어집니다. 고순도의 플라스토글로블을 분리할 수 있는 능력은 단백질체, 지질 및 기타 방법론을 통해 연구를 크게 촉진했습니다. 고순도 및 수율의 플라스토글로블을 사용하면 다른 가능한 분자 특성 중에서 지질 및 단백질 조성, 효소 활성 및 단백질 토폴로지를 조사할 수 있습니다. 이 기사는 식물 잎 조직의 엽록체에서 플라스토글로불을 분리하기 위한 신속하고 효과적인 프로토콜을 제시하고 옥수수 잎, 부활 식물의 건조된 잎 조직, Eragrostis nindensis 및 시아노박테리움, Synechocystis 에서 플라스토글로블 및 관련 지질 방울 구조를 분리하기 위한 방법론적 변형을 제시합니다. PCC 6803. 분리는 이러한 지질이 풍부한 입자의 낮은 밀도에 의존하며, 이는 자당 밀도 부유선광에 의한 정제를 용이하게 합니다. 이 방법론은 다양한 종의 플라스토글로블 연구에 가치가 있음이 입증될 것입니다.

프로토콜의 단계 1이 완료되면, 상당한 양의 플라스토글로불/지질 액적 물질이 슈크로스 쿠션의 최상층 상(또는 그 근처)에 떠 있는 것을 쉽게 볼 수 있어야 한다(도 1B-C). 이 단계에서 다른 분획도 수집 할 수 있습니다. 예를 들어, 틸라코이드는 펠릿화되고 후속 분석을 위해 중간 R 0.2로 재현탁될 수 있습니다. 후속 원심분리 후, 정제 된 플라스토 글?...

Watch this Scientific Journal Video about Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria at JoVE.com

Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

다양한 광합성 유기체와 관련된 플라스토글로불 지질 방울의 분리를 위한 빠르고 효율적인 프로토콜이 제시됩니다. 분리된 플라스토글로불의 성공적인 준비는 단백질체학 및 지질체 분석과 같은 상세한 분자 조사에 앞서 중요한 첫 번째 단계입니다.

Plastoglobule 지질 액적 분리 식물 잎 조직 및 시아노박테리아

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...

고순도 색소 소구의 분리는 그들의 연구에 매우 중요합니다. 다운스트림 생화학적 조사를 용이하게 하는 신속하고 효과적인 분리 프로토콜이 여기에 제시됩니다. 이 방법의 주요 이점은 절차의 상대적 속도와 수많은 식물 종 및 환경 조건에 대한 적응성입니다.틸라코이드 재현탁액을 초음파 처리하는 동안 틸라코이드에서 플라스토글로불을 제거하고 이후 자당 구배에서 플라스토글로불을 추출할 수 있는 충분한 힘을 보장하기 위해 특별한 주의를 기울여야 합니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 박사후 연구원 인 Elsinraju Devadasu 박사와 내 실험실의 박사 과정 학생 인 Febri Susanto입니다. V5 성장 단계와 약 120g의 무게를 가진 6 개의 건강한 옥수수의 3 주 된 묘목을 구입하는 것으로 시작하십시오.줄기 바닥에있는 모든 잎을 잘라 내고 차가운 방으로 옮기기 전에 얼음 욕조에 빠르게 담그십시오. 녹색 안전 램프 아래에서 작업하면서 얼음 욕조에서 옥수수 잎을 제거하고 가위를 사용하여 더 작은 5x5cm 조각으로 자릅니다. 절단 된 잎 조직의 절반을 350ml의 분쇄 완충액에서 상업용 블렌더에서 7보다 낮은 수준으로 부드럽고 철저하게 분쇄합니다.블렌더를 5-6 번 시작하고 중지하여 모든 잎이 잘리도록하십시오. 큰 깔때기에있는 25 미크론 나일론 천의 한 층을 통해 균질 액을 4 개의 250 밀리리터 원심 분리기 병으로 여과합니다. 남은 잘린 잎 조직으로 블렌딩 단계를 반복한 후 여액을 4개의 병 사이에 고르게 나눕니다.잎 여과액의 분취량을 제거하고 대표적인 총 잎 샘플로 저장하기 위해 따로 보관합니다. 다음으로, 여과액을 섭씨 1, 840 G 및 섭씨 4도에서 6분 동안 원심분리한다. 생성 된 상청액을 붓고, 브러시의 부드러운 소용돌이 움직임으로 0.2 몰 자당을 함유 한 12 밀리리터의 매체 R 0.2에 펠릿을 다시 현탁시킨다.펠릿을 한 병에 다시 현탁시킨 후 현탁액을 다음 병에 추가하고 재현탁을 반복하여 현탁액을 한 병에 모읍니다. 풀링된 현탁액을 6개의 3밀리리터 초원심분리기 튜브 사이에 분배하여 각 튜브에서 최대 부피 2.5ml에 도달합니다. 그런 다음 100%의 진폭에서 팁 초음파 처리기를 사용하여 각 튜브를 각각 10초 동안 4번 초음파 처리합니다.거품을 방지하기 위해 초음파 처리기 혼을 물에 잠기고 액체 표면에서 멀리 두십시오. 각 라운드 동안 서스펜션 내에서 초음파 처리기 혼을 위아래로 천천히 움직입니다. 4 개의 튜브를 번갈아 가며 각 초음파 처리 후 각 튜브를 얼음 양동이에 다시 넣어 샘플을 식히십시오.완료되면 초음파 처리 된 조 틸라코이드 현탁액을 섭씨 4도에서 30 분 동안 150, 000G에서 원심 분리합니다. 주사기 및 22 게이지 바늘을 사용하여 쿠션 표면을 탈지하고, 생성된 황색 및 유성 플로팅 패드를 수크로스 쿠션으로부터 조잡한 플라스토글로불로 수확한다. 각 튜브에서 약 500 마이크로 리터를 회수하여 2.0 밀리리터 튜브에 넣습니다.plastoglobules의 초음파 처리 및 방출 전후에 조잡한 틸라코이드 분취량을 수집하십시오. 완료되면 식물 조직 처리를 계속하거나 조 플라스토글로블을 섭씨 영하 80도에서 보관하고 나중에 정제합니다. 고정상에 도달하기 위해 BG11 배지에서 50 밀리리터의 synechocystis 종 PCC 6802 배양액을 7-10 일 동안 성장시킵니다.분광 광도계를 사용하여 셀 밀도를 750 나노 미터에서 2.0의 광학 밀도로 조정합니다. 다당류를 제거하기 위해, 배양물 50 밀리리터를 원심분리하고 상청액을 제거한다. 50 밀리리터의 완충액 A에서 세포를 2 회 반복한다.세척된 펠릿을 25 밀리리터의 완충액 A에 재현탁시키고, 1, 100 파운드 제곱인치의 프렌치 압력 셀을 사용하여 세포를 분해한다. 백색광 아래에서 용해 된 색상이 녹색에서 빨간색, 파란색, 녹색으로 바뀔 때까지 추운 조건에서 이 과정을 세 번 반복합니다. 세포 균질액의 분취량을 제거하고 대표 전체 세포 샘플로서 저장되도록 따로 보관한다.생성 된 균질 액을 각 튜브에 최대 2.5 밀리리터로 채워진 8 개의 3 밀리리터 초 원심 분리 튜브에 분배하십시오. 이 균질액을 400마이크로리터의 배지 R과 오버레이하여 스텝 그래디언트를 생성합니다. 튜브를 원심분리하기 전에 필요에 따라 매체 R을 추가하여 튜브의 균형을 조심스럽게 잡습니다.틸라코이드 및 폴리 하이드 록시 알카 노 에이트 체를 포함한 다른 무거운 세포 기관은 펠릿 형성을 나타내는 반면, 플라 스토 글로불은 자당 구배의 상단 또는 그 근처에서 노란색 유성 패드를 형성합니다. 앞에서 설명한 것처럼 주사기로 원유 플라스토글로불의 플로팅 패드를 수확하고 수확물을 2 밀리리터 튜브에 넣습니다. 필요한 경우 바늘 끝으로 초원심분리기 튜브 벽의 측면에서 플라스토글로블을 긁어냅니다.시아노박테리아 가공을 계속하거나 미정제된 플라스토글로블을 섭씨 영하 80도에서 보관하고 나중에 정제하십시오. 식물 조직 처리 방법을 사용하여 순수한 플라스토글로불을 수확하기 위해, 500 마이크로리터의 미정제 플라스토글로불, 400 마이크로리터의 배지 R0.2 및 400 마이크로리터의 배지 R을 사용하여 앞서 기술한 슈크로스 구배를 제조하고, 원심분리 후, 생성된 순수 플라스토글로불의 플로팅 패드를 2밀리리터 튜브로 수확한다. 순수한 플라스토글로불을 분취한 후 액체 질소에서 분취량을 급속 냉동한 후 섭씨 영하 80도에서 보관하거나 건조 분말로 동결건조합니다.시아 노 박테리아로부터 순수한 플라 스토 글로 불 (plastoglobules)을 수확하기 위해, 500 마이크로 리터의 원유 플라스토 글로불, 750 마이크로 리터의 배지 R 0.7 및 750 마이크로 리터의 배지 R 0.2를 사용하여 앞서 언급 한 바와 같이 자당 구배를 생성한다. 원심분리 후, 1.5 밀리리터 튜브에서 순수한 플라스토 글로블을 수집하고 순수한 플라스토 글로블을 분취한다. 완료되면 순수한 플라스토글로불 분취량을 액체 질소에 급속 냉동하고 섭씨 영하 80도에서 직접 보관하거나 건조 분말로 동결건조합니다.이 방법에서, 상당한 양의 플라스토글로불 또는 지질 액적 물질이 슈크로스 쿠션의 최상층에 부유하는 것을 볼 수 있었다. 후속 원심분리 후, 정제된 플라스토글로불은 슈크로스 구배의 표면 또는 그 근처에서 수득되었다. 플라스토글로불의 성공적인 분리 후, 애기장대 탈리아나 피브릴린 1a 및 애기장대 탈리아나 광계 II 서브유닛 D1에 대해 제기된 항체를 사용하여 순도 평가를 위해 개발된 면역블롯은 피브릴린 동족체가 플라스토글로불보다 주로 틸라코이드와 관련이 있음을 보여주었습니다.플로팅 패드의 효율적이고 집중된 추출을 보장하려면 완전히 잠긴 상태에서 주사기 바늘 오리피스를 버퍼의 액체 표면 바로 아래에 놓은 다음 부드럽게 위로 당깁니다. 분리된 플라스토글로불 샘플은 후속 단백질체학 또는 지질체 연구에 적합하며 다양한 환경 조건에서 표적화된 단백질-지질 조성의 변화를 입증하는 데 사용되었습니다. 이 기술은 후속 생화학 적 조사를 통해 관련 단백질 키나아제 활성의 발견 및 올리고머 단백질 복합체의 존재를 포함하여 플라스토글로불에 대한 새로운 연구를 촉진했습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

LeafJ : 세미 자동 리프 형상 측정을위한 ImageJ 플러그인

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

연구

생물학

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

에서 초기 단계의 배아의 효율적이고 신속한 분리<em&gt; 애기 장대</em&gt; 씨앗

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

식물 표피 지질 폴리 에스테르 단량체의 분리 및 성분 분석

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

음 세포 기관이 격리 키트를 사용 하 여 급속 한 지질 작은 물방울 격리 프로토콜

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

초파리 유충에 있는 Oenocytes의 해부 그리고 지질 물방울 염색

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

잎 딱정벌레의 숙주 - 장 microbiota 상호 작용 연구를위한 조직 배양 묘목으로 축 곤충 준비 및 사육

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

시아노박테리아의 피코빌리좀의 격리 및 특성화

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

혈장 및 고형 조직에서 추적 가능하고 기능화된 세포외 소포의 분리 및 분석

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 세포외 소포의 분리, 특성화 및 치료적 적용

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...