Name: plastoglobule lipid droplet isolation from plant leaf tissue and cyanobacteria
Uploaded: 2022-10-06T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria at JoVE.com

Forskning i Lundquist lab-gruppen støttes av tilskudd fra NSF (MCB-2034631) og USDA (MICL08607) til P.K.L. Forfatterne takker Dr. Carrie Hiser (MSU) for støtte i utviklingen av cyanobakteriell plastoglobule isolasjonsmetode.

1. Isolasjon av rå plastoglobule
<ol><li>Rå plastoglobuleekstraksjon fra ustresset maisbladvev<ol><li>Oppnå seks sunne maisplanter ca 3 uker gamle og nesten på V5-vekststadiet, veier ca 120 g.</li>
		<li>Klipp av alle bladene ved foten av stammen, dunk dem raskt i et isbad og transport til kjølerommet.</li>
		<li>Arbeid under en grønn sikkerhetslampe, fjern maisbladene fra isbadet og klipp dem i mindre biter (rundt 5 cm x 5 cm) ved hjelp av saks.</li>
		<li>Slip forsiktig, men grundig halvparten ...

<ol>
	<li>Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+throughout+the+evolutionary+tree.">Lipid droplets throughout the evolutionary tree.</a> Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).</li><li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+network+of+the+Arabidopsis+plastoglobule+proteome+based+on+quantitative+proteomics+and+genome-wide+coexpression+analysis.">The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis.</a> Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).</li><li>Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+of+plastoglobules+in+chloroplasts+and+chromoplasts.+A+surprising+site+for+differential+accumulation+of+metabolic+enzymes.">Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes.</a> Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).</li><li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+plastoglobule+kinases+ABC1K1+and+ABC1K3+causes+conditional+degreening,+modified+prenyl-lipids,+and+recruitment+of+the+jasmonic+acid+pathway.">Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway.</a> The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).</li><li>Vidi, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tocopherol+cyclase+(VTE1)+localization+and+vitamin+E+accumulation+in+chloroplast+plastoglobule+lipoprotein+particles.">Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+and+the+fine+structure+of+plastids.">Plastoglobuli and the fine structure of plastids.</a> Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).</li><li>Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+in+different+types+of+plastids+from+Allium+cepa+L.">Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L.</a> Planta. 72 (1), 1-13 (1966).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Plastoglobuli+von+Spinat,+ihre+Gr&#246;&#946;e,+Isolierung+und+Lipochinonzusammensetzung.">Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gr&#246;&#946;e, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung.</a> Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+and+lipoquinone+content+of+chloroplasts+from+Cereus+peruvianus+(L)+Mill.">Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill.</a> Planta. 87 (4), 304-310 (1969).</li><li>Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromoplast+ultrastructure+of+Capsicum+carotenoid+mutants+I.+Ultrastructure+and+carotenoid+composition+of+a+new+mutant.">Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant.</a> Zeitschrift f&#252;r Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).</li><li>Hansmann, P., Sitte, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+molecular+structure+of+chromoplast+globules+of+Viola+tricolor.">Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor.</a> Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).</li><li>Steinmuller, D., Tevini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+function+of+plastoglobuli+:+I.+Isolation+and+purification+from+chloroplasts+and+chromoplasts.">Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts.</a> Planta. 163 (2), 201-207 (1985).</li><li>Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proteins+associated+with+plastoglobules+isolated+from+pea+(Pisum+sativum+L.)+chloroplasts.">Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts.</a> Planta. 208 (1), 107-113 (1999).</li><li>Grennan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobule+proteome.">Plastoglobule proteome.</a> Plant Physiology. 147 (2), 443-445 (2008).</li><li>Peramuna, A., Summers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+occurrence+of+lipid+droplets+in+the+cyanobacterium+Nostoc+punctiforme.">Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme.</a> Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).</li><li>Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobules+are+lipoprotein+subcompartments+of+the+chloroplast+that+are+permanently+coupled+to+thylakoid+membranes+and+contain+biosynthetic+enzymes.">Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes.</a> The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).</li><li>Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid+lipid+droplets+at+the+crossroads+of+prenylquinone+metabolism.">Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).</li><li>Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plastoglobules+in+metabolite+repair+in+the+tocopherol+redox+cycle.">Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).</li><li>Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+functional+connections+between+cytoplasmic+and+chloroplast+triacylglycerol+storage.">Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage.</a> Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).</li><li>Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+isolation+from+Arabidopsis+thaliana+leaves.">Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves.</a> Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).</li><li>Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+changes+of+Arabidopsis+thaliana+plastoglobules+facilitate+thylakoid+membrane+remodeling+under+high+light+stress.">Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress.</a> Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).</li><li>Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plastoglobule-localized+protein+AtABC1K6+is+a+Mn2+-dependent+kinase+necessary+for+timely+transition+to+reproductive+growth.">The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth.</a> Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).</li><li>Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+topology+and+membrane+interaction+characteristics+of+plastoglobule-localized+AtFBN1a+and+AtLOX2.">Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2.</a> Plant Signalling &amp; Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).</li><li>Besagni, C., Piller, L. E., Br&#233;h&#233;lin, C., Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plastoglobules+from+Arabidopsis+Plastids+for+Proteomic+Analysis+and+Other+Studies.">Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies.</a> Chloroplast Research in Arabidopsis. , 223-239 (2011).</li><li>Yang, H., Murphy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+preparation,+sucrose+density+gradients+and+two-phase+separation+fractionation+from+five-day-old+Arabidopsis+seedlings.">Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings.</a> Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).</li><li>Kelekar, P., Wei, M., Yang, P., Pazour, G. J., King, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Radial+Spoke+Proteins.">Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins.</a> Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. 92, 181-196 (2009).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear-encoded+synthesis+of+the+D1+subunit+of+photosystem+II+increases+photosynthetic+efficiency+and+crop+yield.">Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield.</a> Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy+reveals+that+senescence+induces+in-situ+and+vacuolar+degradation+of+plastoglobules+in+aging+watermelon+leaves.">Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves.</a> Micron. 80, 135-144 (2016).</li><li>Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+FIBRILLIN4+gene+expression+in+apple+decreases+plastoglobule+plastoquinone+content.">Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content.</a> PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).</li><li>Singh, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIBRILLIN4+is+required+for+plastoglobule+development+and+stress+resistance+in+apple+and+Arabidopsis.">FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gardenia+carotenoid+cleavage+dioxygenase+4a+is+an+efficient+tool+for+biotechnological+production+of+crocins+in+green+and+non-green+plant+tissues.">Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues.</a> Plant Biotechnology Journal. , (2022).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian Journal of Biochemistry &amp; Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li></ol>

For å minimere fysiologiske/biokjemiske endringer i materialet og beskytte visse foto- og termolabile prenyl-lipidpigmenter som er en rik komponent i plastoglobuler, er det avgjørende å utføre isolasjonen ved 4 °C og beskyttet mot lys. Som angitt ovenfor utføres de første trinnene i kjølerommet under en sikkerhetslampe ved hjelp av en grønnemitterende lyspære. De påfølgende trinnene som utføres i laboratoriet er under dimmede lys og bruker is eller nedkjølt sentrifugering. Av lignende grunner er inkludering...

Den nåværende forståelsen av plastoglobule sammensetning og funksjon har dukket opp gjennom detaljerte proteomiske og lipidomiske studier 1,2,3,4,5. Slike studier har blitt sterkt hjulpet av en rask og effektiv isolasjonsmetode som er avhengig av deres svært lave tetthet for effektiv separasjon ved bruk av sukrosegradienter. Innledende metoder for plastoglobuleisolasjon ble oppnådd fra arter som bøketreet (Fagus sylvatica), scotch kost (Sarothamnus scoparius), løk (Allium cepa), spinat (Spinacia oleracea), stemorsblomst (Viola tricolor), pepper (Capsicum annuum) og ert (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. En oppdatert metode for å isolere kloroplastoglobuler på en mer effektiv og bedre avgivende måte ble senere presentert av Ytterberg et al.3,14. Mens vi opprinnelig ble ansatt for studiet av plastoglobulene til Arabidopsis thaliana bladkloroplaster, har vi med hell brukt denne oppdaterte metoden for det sunne bladvevet til andre plantearter, både monocot og dicot, inkludert mais (Zea mays), tomat (Solanum lycopersicum), lovegrass (Eragrostis nindensis), lilla falsk brom (Brachypodium distachyon) og vill tobakk (Nicotiana benthamiana ; upubliserte resultater). Videre har isolasjonsmetoden blitt vellykket tilpasset plastoglobulene til cyanobakterier, inkludert Synechocystis sp. PCC 6803 og Anabaena sp. PCC 712015, og det uttørkede bladvevet til oppstandelsesplanten, E. nindensis.
Kloroplast plastoglobuler av sunt bladvev er fysisk forbundet med thylakoidmembranene16. Til tross for denne fysiske kontinuiteten opprettholder de to kloroplastunderrommene distinkte lipid- og proteinsammensetninger, selv om den regulerte utvekslingen av lipid og protein mellom de to rommene er foreslått 2,4,17,18,19. Faktisk har en interessant hemifusjonsmodell nylig blitt foreslått for handel med nøytrale lipider mellom kloroplaster og cytosol19. På grunn av den fysiske kontinuiteten til plastoglobuler og thylakoider begynner isolasjonsmetoden med sunt bladvev med innsamling av et pelletert rå tylakoidpreparat, som deretter sonikeres for å skille plastoglobulene fra thylakoider, som er i motsetning til metoder som brukes til å isolere cytosoliske lipiddråper20 . Ultracentrifugering på en sukrosepute flyter deretter plastoglobulene med lav tetthet opp gjennom sukrose, og separerer dem effektivt fra thylakoider, kjerner og annet materiale med høy tetthet. I motsetning til dette eksisterer plastoglobuler i cyanobakterier, så vel som de av uttørket bladvev, tydeligvis in vivo i frittflytende form. Derfor innebærer deres isolasjon direkte flytende på en sukrosegradient. Denne artikkelen demonstrerer isolasjonsmetoden fra sunt bladvev og demonstrerer videre to variasjoner som kan brukes til å isolere plastoglobuler fra uttørket bladvev eller cyanobakterielle kulturer, og utvider den fysiologiske bredden og evolusjonær konteksten der plastoglobuler kan studeres.
Isolerte plastoglobuler kan senere brukes til et hvilket som helst antall nedstrømsanalyser for å undersøke molekylære egenskaper. Vi har brukt de isolerte plastoglobulene fra A. thaliana bladvev for omfattende proteomisk og lipidomisk analyse under forskjellige miljøforhold eller genotyper, og demonstrerer selektiv modifisering av protein- og lipidsammensetning i tilpasning til stress 2,4,21,22. I tillegg er det utført in vitro-kinaseanalyser som viser transfosforyleringsaktivitet assosiert med isolerte plastoglobuler22, de oligomere tilstandene til proteinkomponenter er undersøkt ved hjelp av innfødt gelelektroforese 21, og proteasebarberingsanalyser er utført 23.
Den primære fordelen med denne metoden er den relative hastigheten på prosedyren. Etter vår erfaring kan protokollene som er skissert nedenfor, fullføres fullt ut innen ca. 4 timer. En alternativ metode for å isolere plastoglobuler fra bladvev er beskrevet, noe som muliggjør samtidig isolering av andre kloroplastunderrom24. Denne alternative metoden gir noen klare fordeler når kvantitativ sammenligning med de andre kloroplastunderrommene er nødvendig eller ønsket. Imidlertid er denne alternative metoden også mer kjedelig og vil gi et betydelig lavere utbytte av isolerte plastoglobuler fra sammenlignbare mengder bladvev. Når en fokusert studie av plastoglobuler er målet, er metodikken som er skissert her det optimale valget. Ikke desto mindre kan totalt blad og rå thylakoid aliquots samles under prøveprepareringen, og det anbefales sterkt å gjøre det, for å ha referanseprøver for senere sammenligning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AEBSF</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antipain.2HCl</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>H-1765.0050BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>A6106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B8385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>35675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Proliant Biological</td>
			<td>68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chymostatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eragrostis nindensis</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-64</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure cell (model FA-079)</td>
			<td>SLM/Aminco</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron shaking incubator</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-ramidon.2 Na</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>M16050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced Cysteine</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>101444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ortho-vanadate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyrophosphate &#183; 10H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18&#34;</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synechocystis sp. PCC 6803</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-TL Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A95761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring Blender (1.2 L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58977-227</td>
			<td>Commercial blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zea mays</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plastoglobule lipid droplet isolation from plant leaf tissue and cyanobacteria

Plastoglobule lipiddråper er et dynamisk underrom av plantekloroplaster og cyanobakterier. Funnet allestedsnærværende blant fotosyntetiske arter, antas de å tjene en sentral rolle i tilpasning og ombygging av thylakoidmembranen under raskt skiftende miljøforhold. Kapasiteten til å isolere plastoglobuler med høy renhet har i stor grad lettet studien gjennom proteomiske, lipidomiske og andre metoder. Med plastoglobuler med høy renhet og utbytte er det mulig å undersøke deres lipid- og proteinsammensetning, enzymatisk aktivitet og proteintopologi, blant andre mulige molekylære egenskaper. Denne artikkelen presenterer en rask og effektiv protokoll for isolering av plastoglobuler fra kloroplaster av plantebladvev og presenterer metodologiske variasjoner for isolering av plastoglobuler og relaterte lipiddråpestrukturer fra maisblader, oppstandelsesplantens uttørkede bladvev, Eragrostis nindensis og cyanobakterien, Synechocystis. sp. PCC 6803. Isolasjon er avhengig av den lave tettheten av disse lipidrike partiklene, noe som letter rensingen ved sukrosedensitetsflotasjon. Denne metoden vil vise seg verdifull i studiet av plastoglobuler fra ulike arter.

Når trinn 1 i protokollen er fullført, bør man lett kunne se en betydelig mengde plastoglobul/lipiddråpemateriale som flyter på (eller i nærheten av) det øverste laget av sukroseputen (figur 1B-C). Andre fraksjoner kan også samles på dette stadiet. For eksempel vil thylakoidene bli pelletert og kan suspenderes på nytt med medium R 0,2 for påfølgende analyser. Etter påfølgende sentrifugering vil rensede plastoglobuler oppnås ved eller nær over...

Watch this Scientific Journal Video about Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria at JoVE.com

Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

En rask og effektiv protokoll presenteres for isolering av plastoglobule lipiddråper assosiert med ulike fotosyntetiske organismer. Vellykket fremstilling av isolerte plastoglobuler er et avgjørende første skritt som går foran detaljerte molekylære undersøkelser som proteomiske og lipidomiske analyser.

Plastoglobule lipiddråpeisolasjon fra plantebladvev og cyanobakterier

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...

Isoleringen av svært rene plastoglobuler er avgjørende for studien. En rask og effektiv protokoll for deres isolasjon som letter deres nedstrøms biokjemiske undersøkelse presenteres her. Den primære fordelen med denne metoden er den relative prosedyrens hastighet og dens tilpasningsevne til mange plantearter og miljøforhold.Spesiell forsiktighet må utvises ved sonikering av thylakoidresuspensjoner for å sikre tilstrekkelig kraft til å stripe plastoglobuler fra thylakoider og med etterfølgende ekstraksjon av plastoglobuler fra sukrosegradient. Demonstrere denne prosedyren vil være Dr.Elsinraju Devadasu, en postdoktor forsker i laboratoriet mitt, og Febri Susanto, en doktorgradsstudent i laboratoriet mitt. Begynn med å anskaffe tre uker gamle frøplanter av seks sunne mais, som har V5-vekststadium og veier ca. 120 gram.Klipp av alle bladene ved bunnen av stilken og dunk dem raskt i et isbad før du transporterer dem til kjølerommet. Arbeid under en grønn sikkerhetslampe, fjern maisbladene fra isbadet og klipp dem i mindre fem ganger fem centimeter biter ved hjelp av saks. Slip forsiktig og grundig halvparten av det klippede bladvevet i 350 ml av slipebufferen på et nivå lavere enn syv på en kommersiell blender.Start og stopp blenderen fem til seks ganger for å sikre at alle bladene er kuttet. Filtrer homogenatet gjennom ett lag med 25 mikron nylonduk på en stor trakt til fire 250 milliliter sentrifugeflasker. Etter å ha gjentatt blandingstrinnet med det gjenværende klippede bladvevet, del filtratet jevnt mellom de fire flaskene.Fjern en alikot av bladfiltratet og sett det til side for å bli lagret som en representativ total bladprøve. Deretter sentrifugerer filtratet i seks minutter ved 1.840 G og fire grader Celsius. Hell av den resulterende supernatanten, og med forsiktige virvlende bevegelser av børsten, resuspender pelleten i 12 ml medium R 0,2, inneholdende 0,2 molar sukrose.Etter at pelleten er resuspendert i én flaske, tilsett suspensjonen i neste flaske og gjenta suspensjonen for å samle suspensjonene i én flaske. Fordel den samlede suspensjonen mellom seks tre milliliter ultrasentrifugerør, og når et maksimalt volum på 2,5 milliliter i hvert rør. Bruk deretter spisssonikatoren med en amplitude på 100% for å sonikere hvert rør fire ganger i 10 sekunder hver.Sørg for å holde sonikatorhornet nedsenket og vekk fra væskeoverflaten for å forhindre skumming. Beveg sonikatorhornet sakte opp og ned i suspensjonen under hver runde. Mens vekslende de fire rørene, returner hvert rør til en isbøtte etter hver sonikering for å la prøven avkjøles.Når det er gjort, sentrifuge den sonikerte rå-thylakoid-suspensjonen ved 150 000 G i 30 minutter ved fire grader Celsius. Skum puteoverflaten ved hjelp av en sprøyte og 22 gauge nål og høst den resulterende gule og oljete flytende puten av rå plastoglobuler fra sukroseputen. Gjenopprett ca 500 mikroliter fra hvert rør og sett dem inn i et 2,0 milliliter rør.Samle rå thylakoid alikoter før og etter sonikering og frigjøring av plastoglobuler. Når du er ferdig, kan du enten fortsette behandlingen av plantevev eller lagre de rå plastoglobulene ved minus 80 grader Celsius og rense dem senere. Dyrk 50 ml synechocystis-arter PCC 6802-kultur i BG11-medier i 7 til 10 dager for å nå den stasjonære fasen.Bruk et spektrofotometer til å justere celletettheten til en optisk tetthet på 2,0 ved 750 nanometer. For å fjerne polysakkaridene, sentrifuge 50 ml kultur og fjern supernatanten. Gjenta vasking av cellene i 50 ml buffer A to ganger.Suspender den vasket pelleten i 25 ml buffer A og bryt cellene ved hjelp av en fransk trykkcelle på 1, 100 pund kvadrattommer. Gjenta prosessen tre ganger under kalde forhold til lysfargen endres fra grønt til rødt, blått, grønt under hvitt lys. Fjern alikoten av cellehomogenatet og sett det til side for å bli lagret som en representativ total celleprøve.Fordel det resulterende homogenatet i åtte tre-milliliter ultrasentrifugerør fylt til maksimalt 2,5 milliliter i hvert rør. Overlegg dette homogenatet med 400 mikroliter medium R, og produserer en trinngradient. Balanser rørene forsiktig ved å tilsette ekstra medium R etter behov før du sentrifugerer rørene.Thylakoid og andre tyngre organeller, inkludert eventuelle polyhydroksyalkanoatlegemer, viser pelletsdannelse, mens plastoglobuler danner en gul oljeaktig pute på eller nær toppen av sukrosegradienten. Høst den resulterende flytende puten av rå plastoglobuler med en sprøyte, som vist tidligere, og deponer høsten i et to-milliliter rør. Skrap plastoglobuler av siden av ultrasentrifugerørveggen med en nålespiss om nødvendig.Enten fortsette med cyanobakterier behandling eller lagre rå plastoglobules ved minus 80 grader Celsius og rense senere. For å høste de rene plastoglobulene ved hjelp av plantevevsbehandlingsmetoden, fremstill sukrosegradienten beskrevet tidligere ved bruk av 500 mikroliter rå plastoglobuler, 400 mikroliter medium R 0,2 og 400 mikroliter medium R.Etter sentrifugering, høst den resulterende flytende puten av rene plastoglobuler i et to-milliliter rør. Etter aliquoting de rene plastoglobulene og flashfrysing av alikotene i flytende nitrogen, må du enten lagre dem ved minus 80 grader Celsius eller lyofilisere dem til et tørt pulver.For å høste rene plastoglobuler fra cyanobakterier, opprett en sukrosegradient, som nevnt tidligere, ved bruk av 500 mikroliter av de rå plastoglobulene, 750 mikroliter medium R 0,7 og 750 mikroliter medium R 0,2. Etter sentrifugering samles de rene plastoglobulene i et 1,5 milliliter rør og alikot de rene plastoglobulene. Når du er ferdig, blits fryse de rene plastoglobules alikotene i flytende nitrogen og lagre dem direkte ved minus 80 grader Celsius eller lyofilisere til et tørt pulver.I denne metoden ble en betydelig mengde plastoglobule eller lipiddråpemateriale sett flytende på det øverste laget av sukroseputen. Etter etterfølgende sentrifugering ble rensede plastoglobuler oppnådd ved eller nær overflaten av sukrosegradienten. Etter vellykket isolering av plastoglobuler viste immunblotter utviklet for renhetsvurdering med antistoffer forhøyet mot arabidopsis thalianafibrillin 1a og arabidopsis thaliana photosystem II subenhet D1 at fibrillinhomologene primært var assosiert med thylakoider enn plastoglobulene.For å sikre effektiv og konsentrert ekstraksjon av den flytende puten, plasser sprøytenålens åpning like under bufferens væskeoverflate mens den er helt nedsenket, og trekk deretter forsiktig opp. Isolerte plastoglobuleprøver er mottagelige for påfølgende proteomiske eller lipidomiske studier og har blitt brukt til å demonstrere endringene i den målrettede protein-lipidsammensetningen under forskjellige miljøforhold. Denne teknikken har muliggjort nye studier av plastoglobule, inkludert oppdagelsen av assosiert proteinkinaseaktivitet og tilstedeværelsen av oligomere proteinkomplekser gjennom etterfølgende biokjemisk undersøkelse.

Research

JoVE Journal

Biology

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

LeafJ: En ImageJ Plugin for Semi-automatisk Leaf Shape Måling

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Effektiv og Rapid Isolering av tidlig stadium embryo fra<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Frø

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Isolasjon og kompositorisk analyse av plante Cuticle Lipid Polyester Monomers

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Rask Lipid slippverktøy isolasjon protokollen bruker en Well-established Organelle isolering Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Disseksjon og lipid dråpe farging av Oenocytes i Drosophila larver

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

Forberede og oppdrette akseniske insekter med vevskulturerte frøplanter for host-gut mikrobiota interaksjonsstudier av bladbille

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

Isolasjon og karakterisering av intakt fykobilisom i cyanobakterier

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Isolering og analyse av sporbare og funksjonaliserte ekstracellulære vesikler fra plasma og fast vev

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Isolering, karakterisering og terapeutisk anvendelse av ekstracellulære vesikler fra dyrkede humane mesenkymale stamceller

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...