Name: plastoglobule lipid droplet isolation from plant leaf tissue and cyanobacteria
Uploaded: 2022-10-06T14:20:00
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A pesquisa no grupo de laboratório Lundquist é apoiada por doações da NSF (MCB-2034631) e USDA (MICL08607) para a P.K.L. Os autores agradecem à Dra. Carrie Hiser (MSU) pelo apoio no desenvolvimento do método de isolamento de plastoglobule cianobacteriano.

1. Isolamento bruto de plastoglobule
<ol><li>Extração bruta de plastoglobulos de tecido foliar de milho não estressado<ol><li>Adquira seis mudas de milho saudáveis com aproximadamente 3 semanas de idade e quase no estágio de crescimento V5, pesando aproximadamente 120 g.</li>
		<li>Corte todas as folhas na base do caule, mergulhe-as rapidamente em um banho de gelo e transporte para a câmara fria.</li>
		<li>Trabalhando sob uma lâmpada de segurança verde, remova as folhas de milho do banho de ge...

<ol>
	<li>Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+throughout+the+evolutionary+tree.">Lipid droplets throughout the evolutionary tree.</a> Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).</li><li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+network+of+the+Arabidopsis+plastoglobule+proteome+based+on+quantitative+proteomics+and+genome-wide+coexpression+analysis.">The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis.</a> Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).</li><li>Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+of+plastoglobules+in+chloroplasts+and+chromoplasts.+A+surprising+site+for+differential+accumulation+of+metabolic+enzymes.">Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes.</a> Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).</li><li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+plastoglobule+kinases+ABC1K1+and+ABC1K3+causes+conditional+degreening,+modified+prenyl-lipids,+and+recruitment+of+the+jasmonic+acid+pathway.">Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway.</a> The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).</li><li>Vidi, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tocopherol+cyclase+(VTE1)+localization+and+vitamin+E+accumulation+in+chloroplast+plastoglobule+lipoprotein+particles.">Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+and+the+fine+structure+of+plastids.">Plastoglobuli and the fine structure of plastids.</a> Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).</li><li>Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+in+different+types+of+plastids+from+Allium+cepa+L.">Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L.</a> Planta. 72 (1), 1-13 (1966).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Plastoglobuli+von+Spinat,+ihre+Gr&#246;&#946;e,+Isolierung+und+Lipochinonzusammensetzung.">Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gr&#246;&#946;e, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung.</a> Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+and+lipoquinone+content+of+chloroplasts+from+Cereus+peruvianus+(L)+Mill.">Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill.</a> Planta. 87 (4), 304-310 (1969).</li><li>Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromoplast+ultrastructure+of+Capsicum+carotenoid+mutants+I.+Ultrastructure+and+carotenoid+composition+of+a+new+mutant.">Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant.</a> Zeitschrift f&#252;r Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).</li><li>Hansmann, P., Sitte, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+molecular+structure+of+chromoplast+globules+of+Viola+tricolor.">Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor.</a> Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).</li><li>Steinmuller, D., Tevini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+function+of+plastoglobuli+:+I.+Isolation+and+purification+from+chloroplasts+and+chromoplasts.">Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts.</a> Planta. 163 (2), 201-207 (1985).</li><li>Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proteins+associated+with+plastoglobules+isolated+from+pea+(Pisum+sativum+L.)+chloroplasts.">Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts.</a> Planta. 208 (1), 107-113 (1999).</li><li>Grennan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobule+proteome.">Plastoglobule proteome.</a> Plant Physiology. 147 (2), 443-445 (2008).</li><li>Peramuna, A., Summers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+occurrence+of+lipid+droplets+in+the+cyanobacterium+Nostoc+punctiforme.">Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme.</a> Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).</li><li>Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobules+are+lipoprotein+subcompartments+of+the+chloroplast+that+are+permanently+coupled+to+thylakoid+membranes+and+contain+biosynthetic+enzymes.">Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes.</a> The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).</li><li>Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid+lipid+droplets+at+the+crossroads+of+prenylquinone+metabolism.">Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).</li><li>Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plastoglobules+in+metabolite+repair+in+the+tocopherol+redox+cycle.">Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).</li><li>Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+functional+connections+between+cytoplasmic+and+chloroplast+triacylglycerol+storage.">Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage.</a> Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).</li><li>Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+isolation+from+Arabidopsis+thaliana+leaves.">Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves.</a> Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).</li><li>Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+changes+of+Arabidopsis+thaliana+plastoglobules+facilitate+thylakoid+membrane+remodeling+under+high+light+stress.">Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress.</a> Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).</li><li>Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plastoglobule-localized+protein+AtABC1K6+is+a+Mn2+-dependent+kinase+necessary+for+timely+transition+to+reproductive+growth.">The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth.</a> Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).</li><li>Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+topology+and+membrane+interaction+characteristics+of+plastoglobule-localized+AtFBN1a+and+AtLOX2.">Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2.</a> Plant Signalling &amp; Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).</li><li>Besagni, C., Piller, L. E., Br&#233;h&#233;lin, C., Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plastoglobules+from+Arabidopsis+Plastids+for+Proteomic+Analysis+and+Other+Studies.">Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies.</a> Chloroplast Research in Arabidopsis. , 223-239 (2011).</li><li>Yang, H., Murphy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+preparation,+sucrose+density+gradients+and+two-phase+separation+fractionation+from+five-day-old+Arabidopsis+seedlings.">Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings.</a> Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).</li><li>Kelekar, P., Wei, M., Yang, P., Pazour, G. J., King, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Radial+Spoke+Proteins.">Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins.</a> Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. 92, 181-196 (2009).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear-encoded+synthesis+of+the+D1+subunit+of+photosystem+II+increases+photosynthetic+efficiency+and+crop+yield.">Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield.</a> Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy+reveals+that+senescence+induces+in-situ+and+vacuolar+degradation+of+plastoglobules+in+aging+watermelon+leaves.">Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves.</a> Micron. 80, 135-144 (2016).</li><li>Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+FIBRILLIN4+gene+expression+in+apple+decreases+plastoglobule+plastoquinone+content.">Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content.</a> PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).</li><li>Singh, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIBRILLIN4+is+required+for+plastoglobule+development+and+stress+resistance+in+apple+and+Arabidopsis.">FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gardenia+carotenoid+cleavage+dioxygenase+4a+is+an+efficient+tool+for+biotechnological+production+of+crocins+in+green+and+non-green+plant+tissues.">Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues.</a> Plant Biotechnology Journal. , (2022).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian Journal of Biochemistry &amp; Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li></ol>

Para minimizar as alterações fisiológicas/bioquímicas do material e proteger certos pigmentos pré-lábeis foto-lábeis e termolábeis que são um componente rico dos plastoglobules, é fundamental realizar o isolamento a 4 °C e protegido da luz. Como indicado acima, as etapas iniciais são realizadas na câmara fria sob uma lâmpada de segurança usando uma lâmpada emissora de verde. As etapas subsequentes realizadas no laboratório são sob luzes esmaecidas e usam gelo ou centrifugação refrigerada. Por razões ...

A compreensão atual da composição e função dos plastoglóbulos emergiu por meio de estudos proteômicos e lipidômicos detalhados 1,2,3,4,5. Tais estudos têm sido grandemente auxiliados por um método rápido e eficaz de isolamento que se baseia em sua densidade muito baixa para uma separação eficiente usando gradientes de sacarose. Os métodos iniciais de isolamento de plastoglobulos foram obtidos a partir de espécies como faia (Fagus sylvatica), vassoura-escocesa (Sarothamnus scoparius), cebola (Allium cepa), espinafre (Spinacia oleracea), pansy (Viola tricolor), pimenta (Capsicum annuum) e ervilha (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. Um método atualizado para isolar plastoglóbulos de cloroplasto de forma mais eficiente e melhor produtiva foi posteriormente apresentado por Ytterberg et al.3,14. Embora inicialmente empregado para o estudo dos plastoglóbulos dos cloroplastos foliares de Arabidopsis thaliana, empregamos com sucesso este método atualizado para o tecido foliar saudável de outras espécies vegetais, tanto monocotiledôneas quanto dicotiledôneas, incluindo milho (Zea mays), tomate (Solanum lycopersicum), capim-do-amor (Eragrostis nindensis), bromo falso roxo (Brachypodium distachyon) e tabaco selvagem (Nicotiana benthamiana) ; resultados não publicados). Além disso, o método de isolamento foi adaptado com sucesso aos plastoglóbulos de cianobactérias, incluindo Synechocystis sp. PCC 6803 e Anabaena sp. PCC 712015, e o tecido foliar dessecado da planta da ressurreição, E. nindensis.
Os plastoglóbulos de cloroplasto do tecido foliar saudável estão fisicamente conectados às membranas tilacóides16. Apesar dessa continuidade física, os dois subcompartimentos do cloroplasto mantêm composições lipídicas e proteicas distintas, embora a troca regulada de lipídios e proteínas entre os dois compartimentos tenha sido proposta 2,4,17,18,19. De fato, um interessante modelo de hemifusão foi recentemente proposto para o tráfico de lipídios neutros entre cloroplastos e citosol19. Devido à continuidade física de plastoglobules e tilacóides, o método de isolamento com tecido foliar saudável inicia-se com a coleta de uma preparação tilacóide bruta peletizada, que é posteriormente sonicada para separar os plastoglóbulos dos tilacóides, o que contrasta com os métodos utilizados para isolar gotículas lipídicas citosólicas20 . A ultracentrifugação em uma almofada de sacarose então flutua os plastoglóbulos de baixa densidade através da sacarose, separando-os efetivamente dos tilacóides, núcleos e outros materiais de alta densidade. Em contraste, plastoglóbulos em cianobactérias, bem como os de tecido foliar dessecado, evidentemente existem in vivo em uma forma flutuante. Assim, seu isolamento envolve flutuar diretamente em um gradiente de sacarose. Este artigo demonstra o método de isolamento do tecido foliar saudável e demonstra ainda duas variações que podem ser usadas para isolar plastoglóbulos de tecidos foliares desidratados ou culturas de cianobactérias, expandindo grandemente a amplitude fisiológica e o contexto evolutivo em que os plastoglóbulos podem ser estudados.
Plastoglobules isolados podem posteriormente ser usados para qualquer número de análises a jusante para investigar características moleculares. Utilizamos os plastoglóbulos isolados do tecido foliar de A. thaliana para extensa análise proteômica e lipidômica sob diferentes condições ambientais ou genótipos, demonstrando a modificação seletiva da composição proteica e lipídica em adaptação ao estresse 2,4,21,22. Além disso, ensaios de quinase in vitro que demonstram atividade de transfosforilação associada a plastoglóbulos isolados foram realizados22, os estados oligoméricos de componentes proteicos foram investigados usando eletroforese em gel nativa 21 e ensaios de barbear de protease foram realizados23.
O principal benefício deste método é a velocidade relativa do procedimento. Em nossa experiência, os protocolos descritos abaixo podem ser totalmente concluídos em aproximadamente 4 h. Um método alternativo para isolar plastoglóbulos do tecido foliar tem sido descrito, o que permite o isolamento simultâneo de outros subcompartimentos de cloroplasto24. Este método alternativo oferece algumas vantagens claras quando a comparação quantitativa com os outros subcompartimentos de cloroplasto é necessária ou desejada. No entanto, este método alternativo também é mais tedioso e proporcionará um rendimento significativamente menor de plastoglóbulos isolados de quantidades comparáveis de tecido foliar. Quando um estudo focado de plastoglobules é o objetivo, a metodologia descrita aqui é a escolha ideal. No entanto, as alíquotas totais foliares e tilacóides brutas podem ser coletadas durante a preparação da amostra, e é altamente recomendável fazê-lo, para ter amostras de referência para posterior comparação.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AEBSF</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antipain.2HCl</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>H-1765.0050BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>A6106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B8385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>35675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Proliant Biological</td>
			<td>68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chymostatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eragrostis nindensis</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-64</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure cell (model FA-079)</td>
			<td>SLM/Aminco</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron shaking incubator</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-ramidon.2 Na</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>M16050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced Cysteine</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>101444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ortho-vanadate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyrophosphate &#183; 10H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18&#34;</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synechocystis sp. PCC 6803</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-TL Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A95761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring Blender (1.2 L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58977-227</td>
			<td>Commercial blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zea mays</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plastoglobule lipid droplet isolation from plant leaf tissue and cyanobacteria

As gotículas lipídicas de platoglobulos são um subcompartimento dinâmico de cloroplastos vegetais e cianobactérias. Encontrados de forma onipresente entre as espécies fotossintéticas, acredita-se que eles sirvam a um papel central na adaptação e remodelação da membrana tilacóide sob condições ambientais em rápida mudança. A capacidade de isolar plastoglóbulos de alta pureza facilitou muito seu estudo através de metodologias proteômicas, lipidômicas e outras. Com plastoglóbulos de alta pureza e rendimento, é possível investigar sua composição lipídica e proteica, atividade enzimática e topologia proteica, entre outras possíveis características moleculares. Este artigo apresenta um protocolo rápido e eficaz para o isolamento de plastoglóbulos de cloroplastos de tecido foliar vegetal e apresenta variações metodológicas para o isolamento de plastoglóbulos e estruturas de gotículas lipídicas relacionadas de folhas de milho, do tecido foliar desidratado da planta da ressurreição, Eragrostis nindensis, e da cianobactéria, Synechocystis PCC 6803. O isolamento depende da baixa densidade dessas partículas ricas em lipídios, o que facilita sua purificação pela flotação da densidade de sacarose. Esta metodologia será valiosa no estudo de plastoglobules de diversas espécies.

Após a conclusão da etapa 1 do protocolo, deve-se ser capaz de ver prontamente uma quantidade considerável de material de plastoglobule/gotícula lipídica flutuando sobre (ou perto) da camada superior da almofada de sacarose (Figura 1B-C). Outras frações também poderiam ser coletadas nesta fase. Por exemplo, os tilacóides serão peletizados e podem ser ressuspensos com o meio R 0,2 para análises subsequentes. Após a centrifugação subsequente, os ...

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Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

Um protocolo rápido e eficiente é apresentado para o isolamento de gotículas lipídicas de plastoglobule associadas a vários organismos fotossintéticos. A preparação bem-sucedida de plastoglóbulos isolados é um primeiro passo crucial que precede investigações moleculares detalhadas, como análises proteômicas e lipidômicas.

Isolamento de gotículas lipídicas de platoglobulos do tecido foliar da planta e cianobactérias

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...

O isolamento de plastoglóbulos altamente puros é fundamental para o seu estudo. Um protocolo rápido e eficaz para o seu isolamento que facilita a sua investigação bioquímica a jusante é apresentado aqui. O principal benefício deste método é a velocidade relativa do procedimento e sua adaptabilidade a numerosas espécies de plantas e condições ambientais.Cuidados especiais devem ser tomados ao sonicar as ressuspensões tilacóides para garantir força suficiente para retirar plastoglóbulos dos tilacóides e com a subsequente extração de plastoglóbulos do gradiente de sacarose. Demonstrando esse procedimento estarão o Dr. Elsinraju Devadasu, pesquisador de pós-doutorado em meu laboratório, e Febri Susanto, doutorando em meu laboratório. Comece adquirindo mudas de três semanas de idade de seis milhos saudáveis, com estágio de crescimento V5 e pesando aproximadamente 120 gramas.Corte todas as folhas na base do caule e mergulhe-as rapidamente em um banho de gelo antes de transportá-las para a câmara fria. Trabalhando sob uma lâmpada de segurança verde, remova as folhas de milho do banho de gelo e corte-as em pedaços menores de cinco por cinco centímetros usando uma tesoura. Moer suave e completamente metade do tecido foliar cortado em 350 mililitros do tampão de moagem a um nível inferior a sete num liquidificador comercial.Inicie e pare o liquidificador cinco a seis vezes para garantir que todas as folhas sejam cortadas. Filtre o homogeneizado através de uma camada de pano de nylon de 25 mícrons em um funil grande para quatro frascos de centrífuga de 250 mililitros. Depois de repetir a etapa de mistura com o restante tecido foliar cortado, divida uniformemente o filtrado entre os quatro frascos.Retirar uma alíquota do filtrado foliar e reservá-la para ser armazenada como amostra total representativa das folhas. Em seguida, centrifugar o filtrado por seis minutos a 1, 840 G e quatro graus Celsius. Deitar fora o sobrenadante resultante e, com movimentos suaves de rodopio da escova, ressuspender o pellet em 12 mililitros de R 0,2 médio, contendo 0,2 de sacarose molar.Depois de ressuspender o pellet em uma garrafa, adicione a suspensão à próxima garrafa e repita a ressuspensão para agrupar as suspensões em uma garrafa. Distribuir a suspensão agrupada entre seis tubos ultracentrífugos de três mililitros, atingindo um volume máximo de 2,5 mililitros em cada tubo. Em seguida, use o sonicator de ponta a uma amplitude de 100% para sonicar cada tubo quatro vezes por 10 segundos cada.Certifique-se de manter o chifre do sonicador submerso e longe da superfície do líquido para evitar a formação de espuma. Mova lentamente a buzina do sonicator para cima e para baixo dentro da suspensão durante cada rodada. Ao alternar os quatro tubos, devolva cada tubo a um balde de gelo após cada sonicação para permitir que a amostra esfrie.Uma vez feito, centrifugar a suspensão tilacóide bruta sonicated a 150.000 G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Desnatar a superfície da almofada usando uma seringa e uma agulha de calibre 22 e colher a almofada flutuante amarela e oleosa resultante de plastoglóbulos brutos da almofada de sacarose. Recupere aproximadamente 500 microlitros de cada tubo e deposite-os em um tubo de 2,0 mililitros.Colete alíquotas tilacóides brutas antes e depois da sonicação e liberação de plastoglobules. Uma vez feito, continue o processamento do tecido vegetal ou armazene os plastoglóbulos brutos a menos 80 graus Celsius e purifique-os mais tarde. Cultivar 50 mililitros de cultura da espécie synechocystis PCC 6802 em meio BG11 por 7 a 10 dias para atingir a fase estacionária.Usando um espectrofotômetro, ajuste a densidade celular para uma densidade óptica de 2,0 a 750 nanômetros. Para remover os polissacarídeos, centrifugar 50 mililitros de cultura e remover o sobrenadante. Repita a lavagem das células em 50 mililitros de tampão A duas vezes.Ressuspeite o pellet lavado em 25 mililitros de tampão A e quebre as células usando uma célula de pressão francesa a 1.100 libras de polegadas quadradas. Repita o processo três vezes em condições frias até que a cor lisada mude de verde para vermelho, azul, verde sob luz branca. Remova a alíquota do homogeneizado celular e reserve-a para ser armazenada como uma amostra de célula total representativa.Distribuir o homogeneizado resultante em oito tubos de ultracentrífuga de três mililitros cheios até um máximo de 2,5 mililitros em cada tubo. Sobreponha este homogeneizado com 400 microlitros de R médio, produzindo um gradiente de degraus. Equilibre cuidadosamente os tubos adicionando o meio R adicional, conforme necessário, antes de centrifugar os tubos.O tilacóide e outras organelas mais pesadas, incluindo quaisquer corpos de polihidroxialcanoato, mostram formação de pelotas, enquanto os plastoglóbulos formam uma almofada oleosa amarela sobre ou perto do topo do gradiente de sacarose. Colha a almofada flutuante resultante de plastoglóbulos brutos com uma seringa, como demonstrado anteriormente, e deposite a colheita em um tubo de dois mililitros. Raspe os plastoglóbulos do lado da parede do tubo de ultracentrífuga com uma ponta de agulha, se necessário.Ou continuar com o processamento de cianobactérias ou armazenar plastoglóbulos brutos a menos 80 graus Celsius e purificar mais tarde. Para colher os plastoglóbulos puros usando o método de processamento de tecido vegetal, prepare o gradiente de sacarose descrito anteriormente usando 500 microlitros de plastoglóbulos brutos, 400 microlitros de meio R 0,2 e 400 microlitros de médio R.Após centrifugação, colha a almofada flutuante resultante de plastoglóbulos puros em um tubo de dois mililitros. Depois de alicitar os plastoglóbulos puros e congelar as alíquotas em nitrogênio líquido, armazene-as a menos 80 graus Celsius ou liafilize-as em um pó seco.Para colher plastoglóbulos puros de cianobactérias, crie um gradiente de sacarose, como mencionado anteriormente, usando 500 microlitros dos plastoglóbulos brutos, 750 microlitros do meio R 0,7 e 750 microlitros do meio R 0,2. Após a centrifugação, colete os plastoglóbulos puros em um tubo de 1,5 mililitro e alíquota os plastoglóbulos puros. Uma vez feito, congele rapidamente as alíquotas de plastoglóbulos puros em nitrogênio líquido e armazene-as diretamente a menos 80 graus Celsius ou liofilize em um pó seco.Neste método, uma quantidade significativa de plastoglobule ou material de gotículas lipídicas foi vista flutuando na camada superior da almofada de sacarose. Após a centrifugação subsequente, plastoglóbulos purificados foram obtidos na superfície ou perto da superfície do gradiente de sacarose. Após o isolamento bem-sucedido dos plastoglobules, imunoblots desenvolvidos para avaliação de pureza utilizando anticorpos levantados contra arabidopsis thaliana fibrillin 1a e arabidopsis thaliana photosystem II subunidade D1 mostraram que os homólogos da fibrilina estavam primariamente associados a tilacóides do que os plastoglobules.Para garantir a extração eficiente e concentrada da almofada flutuante, coloque o orifício da agulha da seringa logo abaixo da superfície líquida do tampão enquanto estiver completamente submerso e, em seguida, puxe suavemente para cima. Amostras isoladas de plastoglobule são passíveis de estudos proteômicos ou lipidômicos subsequentes e têm sido usadas para demonstrar as mudanças na composição proteico-lipídica alvo sob diferentes condições ambientais. Esta técnica facilitou novos estudos do plastoglobule, incluindo a descoberta da atividade da proteína quinase associada e a presença de complexos proteicos oligoméricos através de investigação bioquímica subsequente.

Research

JoVE Journal

Biology

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High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

Biologia

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

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Isolamento eficiente e rápida de embriões em início de carreira a partir de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sementes

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

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Isolamento e composicional Análise da cutícula vegetal lipídicas poliéster Monómeros

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Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Protocolo de isolamento gota lipídica rápida usando um Kit de isolamento organela bem estabelecidas

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Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

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Cotocação e gota lipídica manchando de enocitos nas larvas de Drosophila

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Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

Preparando e criando insetos axeônicos com mudas cultivadas de tecido para estudos de interação microbiota hospedeiro-intestinal do besouro-folha

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Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

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Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Isolamento e Análise de Vesículas Extracelulares Rastreáveis e Funcionalizadas do Plasma e Tecidos Sólidos

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Isolamento, Caracterização e Aplicação Terapêutica de Vesículas Extracelulares a partir de Células-Tronco Mesenquimais Humanas Cultivadas

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...