Name: plastoglobule lipid droplet isolation from plant leaf tissue and cyanobacteria
Uploaded: 2022-10-06T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria at JoVE.com

Исследования в лабораторной группе Лундквиста поддерживаются грантами NSF (MCB-2034631) и USDA (MICL08607) P.K.L. Авторы благодарят доктора Кэрри Хизер (МГУ) за поддержку в разработке метода выделения цианобактериальных пластоглобул.

1. Выделение сырой пластоглобулы
<ol><li>Извлечение сырой пластоглобулы из ненапряженной ткани листьев кукурузы<ol><li>Приобретите шесть здоровых саженцев кукурузы примерно в возрасте 3 недель и почти на стадии роста V5, весом около 120 г.</li>
		<li>Отрежьте все листья у основания стебля, ...

<ol>
	<li>Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+throughout+the+evolutionary+tree.">Lipid droplets throughout the evolutionary tree.</a> Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).</li><li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+network+of+the+Arabidopsis+plastoglobule+proteome+based+on+quantitative+proteomics+and+genome-wide+coexpression+analysis.">The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis.</a> Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).</li><li>Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+of+plastoglobules+in+chloroplasts+and+chromoplasts.+A+surprising+site+for+differential+accumulation+of+metabolic+enzymes.">Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes.</a> Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).</li><li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+plastoglobule+kinases+ABC1K1+and+ABC1K3+causes+conditional+degreening,+modified+prenyl-lipids,+and+recruitment+of+the+jasmonic+acid+pathway.">Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway.</a> The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).</li><li>Vidi, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tocopherol+cyclase+(VTE1)+localization+and+vitamin+E+accumulation+in+chloroplast+plastoglobule+lipoprotein+particles.">Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+and+the+fine+structure+of+plastids.">Plastoglobuli and the fine structure of plastids.</a> Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).</li><li>Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+in+different+types+of+plastids+from+Allium+cepa+L.">Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L.</a> Planta. 72 (1), 1-13 (1966).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Plastoglobuli+von+Spinat,+ihre+Gr&#246;&#946;e,+Isolierung+und+Lipochinonzusammensetzung.">Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gr&#246;&#946;e, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung.</a> Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+and+lipoquinone+content+of+chloroplasts+from+Cereus+peruvianus+(L)+Mill.">Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill.</a> Planta. 87 (4), 304-310 (1969).</li><li>Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromoplast+ultrastructure+of+Capsicum+carotenoid+mutants+I.+Ultrastructure+and+carotenoid+composition+of+a+new+mutant.">Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant.</a> Zeitschrift f&#252;r Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).</li><li>Hansmann, P., Sitte, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+molecular+structure+of+chromoplast+globules+of+Viola+tricolor.">Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor.</a> Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).</li><li>Steinmuller, D., Tevini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+function+of+plastoglobuli+:+I.+Isolation+and+purification+from+chloroplasts+and+chromoplasts.">Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts.</a> Planta. 163 (2), 201-207 (1985).</li><li>Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proteins+associated+with+plastoglobules+isolated+from+pea+(Pisum+sativum+L.)+chloroplasts.">Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts.</a> Planta. 208 (1), 107-113 (1999).</li><li>Grennan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobule+proteome.">Plastoglobule proteome.</a> Plant Physiology. 147 (2), 443-445 (2008).</li><li>Peramuna, A., Summers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+occurrence+of+lipid+droplets+in+the+cyanobacterium+Nostoc+punctiforme.">Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme.</a> Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).</li><li>Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobules+are+lipoprotein+subcompartments+of+the+chloroplast+that+are+permanently+coupled+to+thylakoid+membranes+and+contain+biosynthetic+enzymes.">Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes.</a> The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).</li><li>Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid+lipid+droplets+at+the+crossroads+of+prenylquinone+metabolism.">Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).</li><li>Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plastoglobules+in+metabolite+repair+in+the+tocopherol+redox+cycle.">Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).</li><li>Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+functional+connections+between+cytoplasmic+and+chloroplast+triacylglycerol+storage.">Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage.</a> Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).</li><li>Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+isolation+from+Arabidopsis+thaliana+leaves.">Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves.</a> Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).</li><li>Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+changes+of+Arabidopsis+thaliana+plastoglobules+facilitate+thylakoid+membrane+remodeling+under+high+light+stress.">Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress.</a> Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).</li><li>Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plastoglobule-localized+protein+AtABC1K6+is+a+Mn2+-dependent+kinase+necessary+for+timely+transition+to+reproductive+growth.">The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth.</a> Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).</li><li>Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+topology+and+membrane+interaction+characteristics+of+plastoglobule-localized+AtFBN1a+and+AtLOX2.">Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2.</a> Plant Signalling &amp; Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).</li><li>Besagni, C., Piller, L. E., Br&#233;h&#233;lin, C., Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plastoglobules+from+Arabidopsis+Plastids+for+Proteomic+Analysis+and+Other+Studies.">Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies.</a> Chloroplast Research in Arabidopsis. , 223-239 (2011).</li><li>Yang, H., Murphy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+preparation,+sucrose+density+gradients+and+two-phase+separation+fractionation+from+five-day-old+Arabidopsis+seedlings.">Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings.</a> Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).</li><li>Kelekar, P., Wei, M., Yang, P., Pazour, G. J., King, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Radial+Spoke+Proteins.">Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins.</a> Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. 92, 181-196 (2009).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear-encoded+synthesis+of+the+D1+subunit+of+photosystem+II+increases+photosynthetic+efficiency+and+crop+yield.">Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield.</a> Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy+reveals+that+senescence+induces+in-situ+and+vacuolar+degradation+of+plastoglobules+in+aging+watermelon+leaves.">Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves.</a> Micron. 80, 135-144 (2016).</li><li>Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+FIBRILLIN4+gene+expression+in+apple+decreases+plastoglobule+plastoquinone+content.">Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content.</a> PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).</li><li>Singh, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIBRILLIN4+is+required+for+plastoglobule+development+and+stress+resistance+in+apple+and+Arabidopsis.">FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gardenia+carotenoid+cleavage+dioxygenase+4a+is+an+efficient+tool+for+biotechnological+production+of+crocins+in+green+and+non-green+plant+tissues.">Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues.</a> Plant Biotechnology Journal. , (2022).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian Journal of Biochemistry &amp; Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li></ol>

Чтобы свести к минимуму физиологические/биохимические изменения материала и защитить определенные фото- и термолабильные прениллипидные пигменты, которые являются богатым компонентом пластоглобул, крайне важно выполнить изоляцию при 4 °C и защитить от света. Как указано выше, начальн...

Современное понимание состава и функции пластоглобул появилось благодаря подробным протеомным и липидомическим исследованиям 1,2,3,4,5. Таким исследованиям в значительной степени способствовал быстрый и эффективный метод изоляции, который опирается на их очень низкую плотность для эффективного разделения с использованием градиентов сахарозы. Первоначальные методы выделения пластоглобул были достигнуты из таких видов, как буковое дерево (Fagus sylvatica), шотландский веник (Sarothamnus scoparius), лук (Allium cepa), шпинат (Spinacia oleracea), анютины глазки (Viola tricolor), перец (Capsicum annuum) и горох (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. Обновленный метод выделения хлоропластобул более эффективным и лучшим способом получения урожая был позднее представлен Ytterberg et al.3,14. Хотя первоначально мы использовались для изучения пластоглобул хлоропластов листьев Arabidopsis thaliana, мы успешно использовали этот обновленный метод для здоровой листовой ткани других видов растений, как монокота, так и дикота, включая кукурузу (Zea mays), помидор (Solanum lycopersicum), лавграсс (Eragrostis nindensis), фиолетовый ложный бром (Brachypodium distachyon) и дикий табак (Nicotiana benthamiana). ; неопубликованные результаты). Кроме того, метод выделения был успешно адаптирован к пластоглобулам цианобактерий, включая Synechocystis sp. PCC 6803 и Anabaena sp. PCC 712015, а также к высохшей листовой ткани воскрешающего растения E. nindensis.
Хлоропластовые пластоглобулы здоровой ткани листа физически соединены с тилакоидными мембранами16. Несмотря на эту физическую непрерывность, два субкомпамента хлоропластов сохраняют различные липидные и белковые композиции, хотя регулируемый обмен липидами и белками между двумя компартментами был предложен 2,4,17,18,19. На самом деле, недавно была предложена интересная модель гемифузии для обмена нейтральными липидами между хлоропластами и цитозолом19. Из-за физической непрерывности пластоглобул и тилакоидов метод выделения со здоровой тканью листьев начинается со сбора гранулированного сырого тилакоидного препарата, который впоследствии обрабатывают ультразвуком для отделения пластоглобул от тилакоидов, что в отличие от методов, используемых для выделения цитозольных липидных капель20 . Ультрацентрифугирование на сахарозной подушке затем запускает пластоглобулы низкой плотности вверх через сахарозу, эффективно отделяя их от тилакоидов, ядер и другого материала высокой плотности. Напротив, пластоглобулы в цианобактериях, а также в высохшей ткани листа, очевидно, существуют in vivo в свободно плавающей форме. Следовательно, их изоляция включает в себя непосредственное плавание на градиенте сахарозы. Эта статья демонстрирует метод выделения из здоровой листовой ткани и дополнительно демонстрирует две вариации, которые могут быть использованы для выделения пластоглобул из высохшей листовой ткани или цианобактериальных культур, значительно расширяя физиологическую широту и эволюционный контекст, в котором пластоглобулы могут быть изучены.
Изолированные пластоглобулы могут впоследствии использоваться для любого количества последующих анализов для исследования молекулярных характеристик. Мы использовали выделенные пластоглобулы из ткани листьев A. thaliana для обширного протеомного и липидомического анализа в различных условиях окружающей среды или генотипах, демонстрируя селективную модификацию белкового и липидного состава при адаптации к стрессу 2,4,21,22. Кроме того, были проведены анализы киназы in vitro, которые демонстрируют активность трансфосфорилирования, связанную с изолированными пластоглобулами, 22, олигомерные состояния белковых компонентов были исследованы с использованием нативного гелевого электрофореза 21 и протеазно-бритвенные анализы были выполнены23.
Основным преимуществом этого метода является относительная скорость процедуры. По нашему опыту, протоколы, описанные ниже, могут быть полностью завершены в течение примерно 4 часов. Описан альтернативный способ выделения пластоглобул из листовой ткани, который позволяет одновременно выделять другие подкомпоны24 хлоропласта. Этот альтернативный метод дает некоторые явные преимущества, когда количественное сравнение с другими подотсеками хлоропласта необходимо или желательно. Однако этот альтернативный метод также более утомителен и обеспечит значительно более низкий выход изолированных пластоглобул из сопоставимых количеств листовой ткани. Когда целью является целенаправленное изучение пластоглобул, методология, изложенная здесь, является оптимальным выбором. Тем не менее, общее количество листовых и сырых тилакоидных аликвот может быть собрано во время подготовки образца, и настоятельно рекомендуется сделать это, чтобы иметь эталонные образцы для последующего сравнения.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AEBSF</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antipain.2HCl</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>H-1765.0050BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>A6106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B8385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>35675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Proliant Biological</td>
			<td>68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chymostatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eragrostis nindensis</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-64</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure cell (model FA-079)</td>
			<td>SLM/Aminco</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron shaking incubator</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-ramidon.2 Na</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>M16050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced Cysteine</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>101444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ortho-vanadate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyrophosphate &#183; 10H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18&#34;</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synechocystis sp. PCC 6803</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-TL Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A95761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring Blender (1.2 L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58977-227</td>
			<td>Commercial blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zea mays</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plastoglobule lipid droplet isolation from plant leaf tissue and cyanobacteria

Капли липидов пластоглобул являются динамическим субкомпоном растительных хлоропластов и цианобактерий. Считается, что они повсеместно встречаются среди фотосинтезирующих видов и играют центральную роль в адаптации и ремоделировании тилакоидной мембраны в быстро меняющихся условиях окружающей среды. Способность выделять пластоглобулы высокой чистоты значительно облегчила их изучение с помощью протеомных, липидомных и других методологий. С пластоглобулами высокой чистоты и выхода можно исследовать их липидный и белковый состав, ферментативную активность и топологию белка, среди других возможных молекулярных характеристик. В данной статье представлен быстрый и эффективный протокол выделения пластоглобул из хлоропластов ткани листьев растений и представлены методологические вариации выделения пластоглобул и связанных с ними липидных капельных структур из листьев кукурузы, высохшей листовой ткани воскрешающего растения Eragrostis nindensis и цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803. Изоляция зависит от низкой плотности этих богатых липидами частиц, что облегчает их очистку флотации плотности сахарозы. Эта методология окажется полезной при изучении пластоглобул различных видов.

По завершении этапа 1 протокола следует легко увидеть значительное количество пластоглобулы/липидного капельного материала, плавающего на верхнем слое сахарозной подушки (или рядом с ним) (рис. 1В-С). Другие фракции также могут быть собраны на этом этап...

Watch this Scientific Journal Video about Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria at JoVE.com

Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

Представлен быстрый и эффективный протокол выделения пластоглобулы липидных капель, связанных с различными фотосинтезирующими организмами. Успешное получение изолированных пластоглобул является важным первым шагом, который предшествует подробным молекулярным исследованиям, таким как протеомный и липидомический анализы.

Выделение пластоглобулы липидных капель из ткани листьев растений и цианобактерий

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...

Выделение высокочистых пластоглобул имеет решающее значение для их изучения. Здесь представлен быстрый и эффективный протокол их выделения, который облегчает их биохимическое исследование. Основным преимуществом этого метода является относительная скорость процедуры и ее приспособляемость к многочисленным видам растений и условиям окружающей среды.Особую осторожность необходимо соблюдать при обработке ультразвуком тилакоидных ресуспензий для обеспечения достаточной силы для удаления пластоглобул из тилакоидов и с последующим извлечением пластоглобул из градиента сахарозы. Продемонстрировать эту процедуру будут доктор Эльсинраджу Девадасу, научный сотрудник моей лаборатории, и Фебри Сусанто, аспирант в моей лаборатории. Начните с приобретения трехнедельных саженцев шести здоровых сортов кукурузы, имеющих стадию роста V5 и весом около 120 граммов.Отрежьте все листья у основания стебля и быстро окуните их в ледяную ванну, прежде чем транспортировать их в холодную комнату. Работая под зеленой лампой безопасности, извлеките листья кукурузы из ледяной ванны и разрежьте их на более мелкие кусочки размером пять на пять сантиметров с помощью ножниц. Аккуратно и тщательно измельчите половину обрезанной ткани листа в 350 миллилитрах измельчающего буфера на уровне ниже семи на коммерческом блендере.Запускайте и останавливайте блендер пять-шесть раз, чтобы убедиться, что все листья срезаны. Отфильтруйте гомогенат через один слой 25-микронной нейлоновой ткани на большой воронке до четырех 250-миллилитровых бутылок центрифуги. После повторения этапа смешивания с оставшейся обрезанной тканью листа равномерно разделите фильтрат между четырьмя флаконами.Удалите аликвоту листового фильтрата и отложите ее в сторону для хранения в качестве репрезентативного общего образца листа. Затем центрифугируйте фильтрат в течение шести минут при 1, 840 G и четырех градусах Цельсия. Вылейте полученный супернатант и легкими закрученными движениями щетки повторно суспендируйте гранулу в 12 миллилитрах среды R0,2, содержащей 0,2 молярной сахарозы.После повторного использования гранулы в одном флаконе добавьте суспензию в следующую бутылку и повторите повторное суспензию, чтобы объединить суспензии в один флакон. Распределите объединенную суспензию между шестью трехмиллилитровыми ультрацентрифугными трубками, достигнув максимального объема 2,5 миллилитра в каждой трубке. Затем используйте наконечник ультразвукового аппарата с амплитудой 100%, чтобы обработать каждую трубку ультразвуком четыре раза в течение 10 секунд каждая.Убедитесь, что звуковой сигнал ультразвукового аппарата находится под водой и подальше от поверхности жидкости, чтобы предотвратить вспенивание. Медленно перемещайте звуковой сигнал sonicator вверх и вниз внутри подвески во время каждого раунда. Чередуя четыре трубки, возвращайте каждую трубку в ведро со льдом после каждой обработки ультразвуком, чтобы дать образцу остыть.После этого центрифугируйте обработанную ультразвуком сырую суспензию тилакоида при 150 000 г в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Скользите по поверхности подушки, используя шприц и иглу 22-го калибра, и соберите полученную желтую и маслянистую плавающую прокладку из сырых пластоглобул из подушки сахарозы. Извлеките приблизительно 500 микролитров из каждой трубки и поместите их в 2,0-миллилитровую трубку.Собирайте сырые тилакоидные аликвоты до и после обработки ультразвуком и высвобождения пластоглобул. После этого либо продолжайте обработку растительной ткани, либо храните сырые пластоглобулы при минус 80 градусах Цельсия и очищайте их позже. Вырастите 50 миллилитров культуры synechocystis вида PCC 6802 в среде BG11 в течение 7-10 дней, чтобы достичь стационарной фазы.Используя спектрофотометр, отрегулируйте плотность ячейки до оптической плотности 2,0 при 750 нанометрах. Чтобы удалить полисахариды, центрифугируют 50 миллилитров культуры и удаляют надосадочный агент. Повторите промывку клеток в 50 миллилитрах буфера А два раза.Повторно суспендируйте промытую гранулу в 25 миллилитрах буфера А и разбейте ячейки с помощью французской напорной ячейки на 1 100 фунтов квадратных дюймов. Повторяйте процесс три раза в холодных условиях до тех пор, пока цвет лизирования не изменится с зеленого на красный, синий, зеленый при белом свете. Удалите аликвоту гомогената клетки и отложите ее для хранения в качестве репрезентативного общего образца клетки.Распределите полученный гомогенат в восьми трехмиллилитровых ультрацентрифужных трубках, заполненных максимум до 2,5 миллилитров в каждой трубке. Наложите этот гомогенат на 400 микролитров среды R, получив градиент шага. Тщательно балансируйте трубки, добавляя дополнительную среду R по мере необходимости перед центрифугированием трубок.Тилакоид и другие более тяжелые органеллы, включая любые полигидроксиалканоатные тела, показывают образование гранул, в то время как пластоглобулы образуют желтую маслянистую прокладку на или около верхней части градиента сахарозы. Соберите полученную плавающую подушку из сырых пластоглобул с помощью шприца, как показано ранее, и поместите урожай в двухмиллилитровую трубку. При необходимости соскоблите пластоглобулы со стороны стенки ультрацентрифужной трубки кончиком иглы.Либо продолжайте обработку цианобактерий, либо храните сырые пластоглобулы при минус 80 градусах Цельсия и очищайте позже. Чтобы собрать чистые пластоглобулы с использованием метода обработки растительной ткани, подготовьте градиент сахарозы, описанный ранее, используя 500 микролитров сырых пластоглобул, 400 микролитров среды R 0,2 и 400 микролитров среды R. После центрифугирования соберите полученную плавающую прокладку чистых пластоглобул в двухмиллилитровую трубку. После аликотирования чистых пластоглобул и мгновенного замораживания аликвот в жидком азоте либо хранят их при минус 80 градусах Цельсия, либо лиофилизируют в сухой порошок.Чтобы собрать чистые пластоглобулы из цианобактерий, создайте градиент сахарозы, как упоминалось ранее, используя 500 микролитров сырых пластоглобул, 750 микролитров среды R 0,7 и 750 микролитров среды R 0,2. После центрифугирования соберите чистые пластоглобулы в 1,5-миллилитровую трубку и аликвотируйте чистые пластоглобулы. После этого заморозьте чистые пластоглобулы аликвоты в жидком азоте и храните их непосредственно при минус 80 градусах Цельсия или лиофилизируйте в сухой порошок.В этом методе было замечено значительное количество пластоглобулы или липидного капельного материала, плавающего на верхнем слое подушки сахарозы. После последующего центрифугирования очищенные пластоглобулы получали на поверхности градиента сахарозы или вблизи нее. После успешного выделения пластоглобул иммуноблоты, разработанные для оценки чистоты с использованием антител, выращенных против арабидопсиса талиана фибриллина 1а и фотосистемы arabidopsis thaliana II субъединицы D1, показали, что гомологи фибриллина были в первую очередь связаны с тилакоидами, чем пластоглобулы.Чтобы обеспечить эффективное и концентрированное извлечение плавающей площадки, поместите отверстие иглы шприца чуть ниже жидкой поверхности буфера, будучи полностью погруженным, а затем осторожно подтяните вверх. Изолированные образцы пластоглобул поддаются последующим протеомным или липидомическим исследованиям и были использованы для демонстрации изменений в целевом белково-липидном составе в различных условиях окружающей среды. Этот метод облегчил новые исследования пластоглобулы, включая открытие связанной активности протеинкиназы и присутствия олигомерных белковых комплексов посредством последующего биохимического исследования.

Research

JoVE Journal

Biology

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

LeafJ: Plugin ImageJ для полуавтоматического измерения формы листьев

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Эффективной и быстрой изоляции на ранней стадии эмбрионы из<em&gt; Arabidopsis THALIANA</em&gt; Семена

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Выделение жизнеспособных многоклеточных желез от ткани Хищные растения, Nepenthes</i

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Выделение и анализ состава растительных липидов кутикулы полиэфирные мономеры

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Протокол изоляции капелька быстрого липидов используя налаженные органеллы изоляции комплект

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Рассечение и Липид капли пятно Эноцитов в Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

Подготовка и выращивание топорических насекомых с тканевыми культивируемыми саженцами для исследований взаимодействия микробиоты кишечника хозяина и жука-листоеда

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

Выделение и характеристика интактной фикобилисомы в цианобактериях

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Выделение и анализ прослеживаемых и функционализированных внеклеточных везикул из плазмы и твердых тканей

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Выделение, характеристика и терапевтическое применение внеклеточных везикул из культивируемых мезенхимальных стволовых клеток человека

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...