Name: plastoglobule lipid droplet isolation from plant leaf tissue and cyanobacteria
Uploaded: 2022-10-06T14:20:00
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La investigación en el grupo de laboratorio de Lundquist está respaldada por subvenciones de la NSF (MCB-2034631) y USDA (MICL08607) a P.K.L. Los autores agradecen a la Dra. Carrie Hiser (MSU) por su apoyo en el desarrollo del método de aislamiento de plastoglóbulos cianobacterianos.

1. Aislamiento de plastoglóbulos crudos
<ol><li>Extracción cruda de plastoglóbulo del tejido foliar de maíz no estresado<ol><li>Adquiera seis plántulas de maíz sanas de aproximadamente 3 semanas de edad y casi en la etapa de crecimiento V5, con un peso aproximado de 120 g.</li>
		<li>Recorte todas las hojas en la base del tallo, sumérjalas rápidamente en un baño de hielo y transpógrelas a la cámara frigorífica.</li>
		<li>Trabajando bajo una lámpara de seguridad verde, retire las hojas de ...

<ol>
	<li>Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+throughout+the+evolutionary+tree.">Lipid droplets throughout the evolutionary tree.</a> Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).</li><li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+network+of+the+Arabidopsis+plastoglobule+proteome+based+on+quantitative+proteomics+and+genome-wide+coexpression+analysis.">The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis.</a> Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).</li><li>Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+of+plastoglobules+in+chloroplasts+and+chromoplasts.+A+surprising+site+for+differential+accumulation+of+metabolic+enzymes.">Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes.</a> Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).</li><li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+plastoglobule+kinases+ABC1K1+and+ABC1K3+causes+conditional+degreening,+modified+prenyl-lipids,+and+recruitment+of+the+jasmonic+acid+pathway.">Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway.</a> The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).</li><li>Vidi, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tocopherol+cyclase+(VTE1)+localization+and+vitamin+E+accumulation+in+chloroplast+plastoglobule+lipoprotein+particles.">Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+and+the+fine+structure+of+plastids.">Plastoglobuli and the fine structure of plastids.</a> Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).</li><li>Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+in+different+types+of+plastids+from+Allium+cepa+L.">Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L.</a> Planta. 72 (1), 1-13 (1966).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Plastoglobuli+von+Spinat,+ihre+Gr&#246;&#946;e,+Isolierung+und+Lipochinonzusammensetzung.">Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gr&#246;&#946;e, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung.</a> Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+and+lipoquinone+content+of+chloroplasts+from+Cereus+peruvianus+(L)+Mill.">Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill.</a> Planta. 87 (4), 304-310 (1969).</li><li>Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromoplast+ultrastructure+of+Capsicum+carotenoid+mutants+I.+Ultrastructure+and+carotenoid+composition+of+a+new+mutant.">Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant.</a> Zeitschrift f&#252;r Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).</li><li>Hansmann, P., Sitte, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+molecular+structure+of+chromoplast+globules+of+Viola+tricolor.">Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor.</a> Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).</li><li>Steinmuller, D., Tevini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+function+of+plastoglobuli+:+I.+Isolation+and+purification+from+chloroplasts+and+chromoplasts.">Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts.</a> Planta. 163 (2), 201-207 (1985).</li><li>Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proteins+associated+with+plastoglobules+isolated+from+pea+(Pisum+sativum+L.)+chloroplasts.">Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts.</a> Planta. 208 (1), 107-113 (1999).</li><li>Grennan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobule+proteome.">Plastoglobule proteome.</a> Plant Physiology. 147 (2), 443-445 (2008).</li><li>Peramuna, A., Summers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+occurrence+of+lipid+droplets+in+the+cyanobacterium+Nostoc+punctiforme.">Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme.</a> Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).</li><li>Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobules+are+lipoprotein+subcompartments+of+the+chloroplast+that+are+permanently+coupled+to+thylakoid+membranes+and+contain+biosynthetic+enzymes.">Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes.</a> The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).</li><li>Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid+lipid+droplets+at+the+crossroads+of+prenylquinone+metabolism.">Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).</li><li>Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plastoglobules+in+metabolite+repair+in+the+tocopherol+redox+cycle.">Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).</li><li>Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+functional+connections+between+cytoplasmic+and+chloroplast+triacylglycerol+storage.">Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage.</a> Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).</li><li>Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+isolation+from+Arabidopsis+thaliana+leaves.">Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves.</a> Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).</li><li>Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+changes+of+Arabidopsis+thaliana+plastoglobules+facilitate+thylakoid+membrane+remodeling+under+high+light+stress.">Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress.</a> Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).</li><li>Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plastoglobule-localized+protein+AtABC1K6+is+a+Mn2+-dependent+kinase+necessary+for+timely+transition+to+reproductive+growth.">The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth.</a> Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).</li><li>Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+topology+and+membrane+interaction+characteristics+of+plastoglobule-localized+AtFBN1a+and+AtLOX2.">Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2.</a> Plant Signalling &amp; Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).</li><li>Besagni, C., Piller, L. E., Br&#233;h&#233;lin, C., Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plastoglobules+from+Arabidopsis+Plastids+for+Proteomic+Analysis+and+Other+Studies.">Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies.</a> Chloroplast Research in Arabidopsis. , 223-239 (2011).</li><li>Yang, H., Murphy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+preparation,+sucrose+density+gradients+and+two-phase+separation+fractionation+from+five-day-old+Arabidopsis+seedlings.">Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings.</a> Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).</li><li>Kelekar, P., Wei, M., Yang, P., Pazour, G. J., King, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Radial+Spoke+Proteins.">Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins.</a> Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. 92, 181-196 (2009).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear-encoded+synthesis+of+the+D1+subunit+of+photosystem+II+increases+photosynthetic+efficiency+and+crop+yield.">Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield.</a> Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy+reveals+that+senescence+induces+in-situ+and+vacuolar+degradation+of+plastoglobules+in+aging+watermelon+leaves.">Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves.</a> Micron. 80, 135-144 (2016).</li><li>Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+FIBRILLIN4+gene+expression+in+apple+decreases+plastoglobule+plastoquinone+content.">Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content.</a> PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).</li><li>Singh, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIBRILLIN4+is+required+for+plastoglobule+development+and+stress+resistance+in+apple+and+Arabidopsis.">FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gardenia+carotenoid+cleavage+dioxygenase+4a+is+an+efficient+tool+for+biotechnological+production+of+crocins+in+green+and+non-green+plant+tissues.">Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues.</a> Plant Biotechnology Journal. , (2022).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian Journal of Biochemistry &amp; Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li></ol>

Para minimizar los cambios fisiológicos/bioquímicos en el material y proteger ciertos pigmentos fotolípidos y termolábiles que son un componente rico en plastoglobulos, es fundamental realizar el aislamiento a 4 °C y protegido de la luz. Como se indicó anteriormente, los pasos iniciales se realizan en la cámara frigorífica bajo una lámpara de seguridad utilizando una bombilla emisora de color verde. Los pasos posteriores realizados en el laboratorio son bajo luces tenues y utilizan hielo o centrifugación refrig...

La comprensión actual de la composición y función de los plastoglobullos ha surgido a través de estudios proteómicos y lipidómicos detallados 1,2,3,4,5. Tales estudios han sido ayudados en gran medida por un método rápido y efectivo de aislamiento que se basa en su muy baja densidad para una separación eficiente utilizando gradientes de sacarosa. Los métodos iniciales de aislamiento de plastoglobullos se lograron a partir de especies como el haya (Fagus sylvatica), la escoba (Sarothamnus scoparius), la cebolla (Allium cepa), la espinaca (Spinacia oleracea), el pensamiento (Viola tricolor), la pimienta (Capsicum annuum) y el guisante (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. Un método actualizado para aislar plastoglóbulos de cloroplastos de una manera más eficiente y de mejor rendimiento fue presentado posteriormente por Ytterberg et al.3,14. Aunque inicialmente se empleó para el estudio de los plastoglóbulos de los cloroplastos de hojas de Arabidopsis thaliana, hemos empleado con éxito este método actualizado para el tejido foliar sano de otras especies de plantas, tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas, incluyendo maíz (Zea mays), tomate (Solanum lycopersicum), hierba del amor (Eragrostis nindensis), bromo falso púrpura (Brachypodium distachyon) y tabaco silvestre (Nicotiana benthamiana) ; resultados no publicados). Además, el método de aislamiento se ha adaptado con éxito a los plastoglóbulos de cianobacterias, incluyendo Synechocystis sp. PCC 6803 y Anabaena sp. PCC 712015, y el tejido foliar desecado de la planta de resurrección, E. nindensis.
Los plastoglóbulos de cloroplasto del tejido foliar sano están conectados físicamente a las membranas tilacoides16. A pesar de esta continuidad física, los dos subcompartimentos del cloroplasto mantienen distintas composiciones de lípidos y proteínas, aunque se ha propuesto el intercambio regulado de lípidos y proteínas entre los dos compartimentos 2,4,17,18,19. De hecho, recientemente se ha propuesto un interesante modelo de hemifusión para el tráfico de lípidos neutros entre cloroplastos y citosol19. Debido a la continuidad física de plastoglóbulos y tilacoides, el método de aislamiento con tejido foliar sano comienza con la recolección de una preparación de tilacoide crudo granulado, que posteriormente se sonica, para separar los plastoglóbulos de los tilacoides, lo que contrasta con los métodos utilizados para aislar gotas lipídicas citosólicas20 . La ultracentrifugación en un cojín de sacarosa hace flotar los plastoglóbulos de baja densidad a través de la sacarosa, separándolos efectivamente de los tilacoides, núcleos y otros materiales de alta densidad. En contraste, los plastoglóbulos en cianobacterias, así como los de tejido foliar desecado, evidentemente existen in vivo en forma flotante. Por lo tanto, su aislamiento implica flotar directamente en un gradiente de sacarosa. Este artículo demuestra el método de aislamiento del tejido foliar sano y además demuestra dos variaciones que se pueden utilizar para aislar plastoglóbulos de tejido foliar desecado o cultivos de cianobacterias, ampliando en gran medida la amplitud fisiológica y el contexto evolutivo en el que se pueden estudiar los plastoglobulos.
Los plastoglóbulos aislados se pueden utilizar posteriormente para cualquier número de análisis posteriores para investigar las características moleculares. Se han utilizado los plastoglobullos aislados del tejido foliar de A. thaliana para un extenso análisis proteómico y lipidómico bajo diferentes condiciones ambientales o genotipos, demostrando la modificación selectiva de la composición proteica y lipídica en adaptación al estrés 2,4,21,22. Además, se han realizado ensayos de quinasa in vitro que demuestran actividad transfosforilación asociada a plastoglóbulos aislados 22, se han investigado los estados oligoméricos de los componentes proteicos mediante electroforesis en gel nativo 21 y se han realizado ensayos de afeitado de proteasa23.
El principal beneficio de este método es la velocidad relativa del procedimiento. En nuestra experiencia, los protocolos descritos a continuación se pueden completar completamente en aproximadamente 4 horas. Se ha descrito un método alternativo para aislar plastoglóbulos del tejido foliar, que permite el aislamiento simultáneo de otros subcompartimentos de cloroplastos24. Este método alternativo ofrece algunas ventajas claras cuando es necesaria o deseada una comparación cuantitativa con los otros subcompartimentos del cloroplasto. Sin embargo, este método alternativo también es más tedioso y proporcionará un rendimiento significativamente menor de plastoglóbulos aislados a partir de cantidades comparables de tejido foliar. Cuando el objetivo es un estudio centrado en los plastoglóbulos, la metodología descrita aquí es la opción óptima. No obstante, se pueden recolectar alícuotas totales de hoja y tilacoide crudo durante la preparación de la muestra, y se recomienda encarecidamente hacerlo, para tener muestras de referencia para su posterior comparación.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AEBSF</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antipain.2HCl</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>H-1765.0050BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>A6106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B8385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>35675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Proliant Biological</td>
			<td>68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chymostatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eragrostis nindensis</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-64</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure cell (model FA-079)</td>
			<td>SLM/Aminco</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron shaking incubator</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-ramidon.2 Na</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>M16050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced Cysteine</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>101444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ortho-vanadate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyrophosphate &#183; 10H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18&#34;</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synechocystis sp. PCC 6803</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-TL Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A95761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring Blender (1.2 L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58977-227</td>
			<td>Commercial blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zea mays</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plastoglobule lipid droplet isolation from plant leaf tissue and cyanobacteria

Las gotitas lipídicas de plastoglobulo son un subcompartimento dinámico de cloroplastos vegetales y cianobacterias. Se encuentran ubicuamente entre las especies fotosintéticas, se cree que desempeñan un papel central en la adaptación y remodelación de la membrana tilacoide en condiciones ambientales que cambian rápidamente. La capacidad de aislar plastoglóbulos de alta pureza ha facilitado enormemente su estudio a través de metodologías proteómicas, lipidómicas y otras. Con plastoglóbulos de alta pureza y rendimiento, es posible investigar su composición lipídica y proteica, actividad enzimática y topología proteica, entre otras posibles características moleculares. Este artículo presenta un protocolo rápido y eficaz para el aislamiento de plastoglóbulos de cloroplastos de tejido foliar vegetal y presenta variaciones metodológicas para el aislamiento de plastoglóbulos y estructuras de gotitas lipídicas relacionadas de hojas de maíz, el tejido foliar desecado de la planta de resurrección, Eragrostis nindensis, y la cianobacteria, Synechocystis PCC 6803. El aislamiento se basa en la baja densidad de estas partículas ricas en lípidos, lo que facilita su purificación por flotación por densidad de sacarosa. Esta metodología resultará valiosa en el estudio de plastoglóbulos de diversas especies.

Al finalizar el paso 1 del protocolo, uno debería poder ver fácilmente una cantidad considerable de material de plastoglóbulo/gota de lípidos flotando sobre (o cerca) de la capa superior del cojín de sacarosa (Figura 1B-C). Otras fracciones también podrían ser recogidas en esta etapa. Por ejemplo, los tilacoides se granularán y se pueden volver a suspender con el medio R 0,2 para análisis posteriores. Después de la centrifugación posterior, se obt...

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Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

Se presenta un protocolo rápido y eficaz para el aislamiento de gotitas lipídicas de plastoglobullos asociadas a diversos organismos fotosintéticos. La preparación exitosa de plastoglóbulos aislados es un primer paso crucial que precede a las investigaciones moleculares detalladas, como los análisis proteómicos y lipidómicos.

Aislamiento de gotitas lipídicas de plastoglobulo del tejido foliar de plantas y cianobacterias

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...

El aislamiento de plastoglóbulos de alta pureza es fundamental para su estudio. Aquí se presenta un protocolo rápido y efectivo para su aislamiento que facilita su investigación bioquímica posterior. El principal beneficio de este método es la velocidad relativa del procedimiento y su adaptabilidad a numerosas especies de plantas y condiciones ambientales.Se debe tener especial cuidado al sonicar las resuspensiones de tilacoides para garantizar una fuerza suficiente para eliminar los plastoglóbulos de los tilacoides y con la posterior extracción de plastoglóbulos del gradiente de sacarosa. Demostrando este procedimiento estarán el Dr. Elsinraju Devadasu, investigador postdoctoral en mi laboratorio, y Febri Susanto, estudiante de doctorado en mi laboratorio. Comience adquiriendo plántulas de tres semanas de edad de seis maíz sanos, con etapa de crecimiento V5 y un peso aproximado de 120 gramos.Recorte todas las hojas en la base del tallo y sumérjalas rápidamente en un baño de hielo antes de transportarlas a la cámara frigorífica. Trabajando bajo una lámpara de seguridad verde, retire las hojas de maíz del baño de hielo y córtelas en pedazos más pequeños de cinco por cinco centímetros con tijeras. Moler suave y completamente la mitad del tejido de la hoja recortado en 350 mililitros del tampón de molienda a un nivel inferior a siete en una licuadora comercial.Comience y detenga la licuadora de cinco a seis veces para asegurarse de que todas las hojas estén cortadas. Filtre el homogeneizado a través de una capa de tela de nylon de 25 micras en un embudo grande a cuatro botellas de centrífuga de 250 mililitros. Después de repetir el paso de mezcla con el tejido de hoja recortado restante, divida uniformemente el filtrado entre las cuatro botellas.Retirar una alícuota del filtrado foliar y reservarla para almacenarla como muestra representativa de la hoja total. A continuación, centrifugar el filtrado durante seis minutos a 1, 840 G y cuatro grados centígrados. Vierta el sobrenadante resultante y, con suaves movimientos de remolino del cepillo, vuelva a suspender el pellet en 12 mililitros de medio R 0.2, que contiene 0.2 molar sacarosa.Después de resuspender el pellet en una botella, agregue la suspensión a la siguiente botella y repita la resuspensión para agrupar las suspensiones en una botella. Distribuir la suspensión agrupada entre seis tubos de ultracentrífuga de tres mililitros, alcanzando un volumen máximo de 2,5 mililitros en cada tubo. Luego use el sonicador de punta a una amplitud del 100% para sonicar cada tubo cuatro veces durante 10 segundos cada una.Asegúrese de mantener la bocina del sonicador sumergida y lejos de la superficie del líquido para evitar la espuma. Mueva lentamente la bocina del sonicador hacia arriba y hacia abajo dentro de la suspensión durante cada ronda. Mientras alterna los cuatro tubos, devuelva cada tubo a un cubo de hielo después de cada sonicación para permitir que la muestra se enfríe.Una vez hecho esto, centrifugar la suspensión tilacoide cruda sonicada a 150, 000 G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Roze la superficie del cojín con una jeringa y una aguja de calibre 22 y recoja la almohadilla flotante amarilla y aceitosa resultante de plastoglóbulos crudos del cojín de sacarosa. Recuperar aproximadamente 500 microlitros de cada tubo y depositarlos en un tubo de 2,0 mililitros.Recolectar alícuotas tilacoides crudas antes y después de la sonicación y liberación de plastoglobulos. Una vez hecho esto, continúe el procesamiento del tejido vegetal o almacene los plastoglóbulos crudos a menos 80 grados centígrados y purifíquelos más tarde. Cultivar 50 mililitros de la especie PCC 6802 de synechocystis en medios BG11 durante 7 a 10 días para alcanzar la fase estacionaria.Usando un espectrofotómetro, ajuste la densidad celular a una densidad óptica de 2.0 a 750 nanómetros. Para eliminar los polisacáridos, centrifugar 50 mililitros de cultivo y eliminar el sobrenadante. Repita el lavado de las células en 50 mililitros de tampón A dos veces.Resuspenda el pellet lavado en 25 mililitros de tampón A y rompa las celdas usando una celda de presión francesa a 1, 100 libras de pulgadas cuadradas. Repita el proceso tres veces en condiciones frías hasta que el color lisado cambie de verde a rojo, azul, verde bajo luz blanca. Retirar la alícuota del homogeneizado celular y reservarla para almacenarla como muestra celular total representativa.Distribuir el homogeneizado resultante en ocho tubos de ultracentrífuga de tres mililitros llenos hasta un máximo de 2,5 mililitros en cada tubo. Superponga este homogeneizado con 400 microlitros de medio R, produciendo un gradiente de paso. Equilibre cuidadosamente los tubos agregando medio R adicional según sea necesario antes de centrifugar los tubos.El tilacoide y otros orgánulos más pesados, incluyendo cualquier cuerpo de polihidroxialcanoato, muestran formación de pellets, mientras que los plastoglobullos forman una almohadilla aceitosa amarilla en o cerca de la parte superior del gradiente de sacarosa. Coseche la almohadilla flotante resultante de plastoglóbulos crudos con una jeringa, como se demostró anteriormente, y deposite la cosecha en un tubo de dos mililitros. Raspe los plastoglóbulos del lado de la pared del tubo de la centrífuga con una punta de aguja si es necesario.Continúe con el procesamiento de cianobacterias o almacene plastoglóbulos crudos a menos 80 grados centígrados y purifique más tarde. Para cosechar los plastoglóbulos puros utilizando el método de procesamiento de tejido vegetal, prepare el gradiente de sacarosa descrito anteriormente utilizando 500 microlitros de plastoglóbulos crudos, 400 microlitros de R medio 0.2 y 400 microlitros de R medio. Después de alícuota los plastoglóbulos puros y congelar rápidamente las alícuotas en nitrógeno líquido, almacénelos a menos 80 grados centígrados o liofilícelos en polvo seco.Para cosechar plastoglóbulos puros de cianobacterias, cree un gradiente de sacarosa, como se mencionó anteriormente, utilizando 500 microlitros de plastoglóbulos crudos, 750 microlitros de medio R 0.7 y 750 microlitros de medio R 0.2. Después de la centrifugación, recoger los plastoglóbulos puros en un tubo de 1,5 mililitros y alícuota los plastoglóbulos puros. Una vez hecho esto, congele rápidamente las alícuotas de plastoglóbulos puros en nitrógeno líquido y guárdelas directamente a menos 80 grados centígrados o liofilícelas hasta obtener un polvo seco.En este método, se observó una cantidad significativa de plastoglóbulo o material de gota de lípidos flotando en la capa superior del cojín de sacarosa. Después de la centrifugación posterior, se obtuvieron plastoglóbulos purificados en o cerca de la superficie del gradiente de sacarosa. Después del aislamiento exitoso de plastoglobulos, los inmunoblots desarrollados para la evaluación de la pureza utilizando anticuerpos generados contra la fibrilina 1a de Arabidopsis thaliana y la subunidad D1 del fotosistema II de Arabidopsis thaliana mostraron que los homólogos de fibrilina se asociaron principalmente con tilacoides que con los plastoglobulos.Para garantizar la extracción eficiente y concentrada de la almohadilla flotante, coloque el orificio de la aguja de la jeringa justo debajo de la superficie líquida del tampón mientras está completamente sumergido, luego tire suavemente hacia arriba. Las muestras aisladas de plastoglóbulos son susceptibles de estudios proteómicos o lipidómicos posteriores y se han utilizado para demostrar los cambios en la composición proteína-lípido objetivo en diferentes condiciones ambientales. Esta técnica ha facilitado nuevos estudios del plastoglobulo, incluyendo el descubrimiento de la actividad asociada a la proteína quinasa y la presencia de complejos proteicos oligoméricos a través de la investigación bioquímica posterior.

Research

JoVE Journal

Biology

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