Name: plastoglobule lipid droplet isolation from plant leaf tissue and cyanobacteria
Uploaded: 2022-10-06T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria at JoVE.com

Forskningen i Lundquists labbgrupp stöds av anslag från NSF (MCB-2034631) och USDA (MICL08607) till P.K.L. Författarna tackar Dr. Carrie Hiser (MSU) för stöd i utvecklingen av den cyanobakteriella plastoglobuleisoleringsmetoden.

1. Isolering av rå plastoglobule
<ol><li>Extraktion av råplastoglobulat från obelastad bladvävnad av majs<ol><li>Skaffa sex friska majsplantor som är cirka 3 veckor gamla och nästan i V5-tillväxtstadiet, väger cirka 120 g.</li>
		<li>Klipp av alla löv vid basen av stammen, doppa dem snabbt i ett isbad och transportera till kylrummet.</li>
		<li>Arbeta under en grön säkerhetslampa, ta bort majsbladen från isbadet och klipp dem i mindre bitar (cirka 5 cm x 5 cm) med sax.</li>
		<li>Mal försi...

<ol>
	<li>Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+throughout+the+evolutionary+tree.">Lipid droplets throughout the evolutionary tree.</a> Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).</li><li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+network+of+the+Arabidopsis+plastoglobule+proteome+based+on+quantitative+proteomics+and+genome-wide+coexpression+analysis.">The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis.</a> Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).</li><li>Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+of+plastoglobules+in+chloroplasts+and+chromoplasts.+A+surprising+site+for+differential+accumulation+of+metabolic+enzymes.">Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes.</a> Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).</li><li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+plastoglobule+kinases+ABC1K1+and+ABC1K3+causes+conditional+degreening,+modified+prenyl-lipids,+and+recruitment+of+the+jasmonic+acid+pathway.">Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway.</a> The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).</li><li>Vidi, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tocopherol+cyclase+(VTE1)+localization+and+vitamin+E+accumulation+in+chloroplast+plastoglobule+lipoprotein+particles.">Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+and+the+fine+structure+of+plastids.">Plastoglobuli and the fine structure of plastids.</a> Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).</li><li>Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+in+different+types+of+plastids+from+Allium+cepa+L.">Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L.</a> Planta. 72 (1), 1-13 (1966).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Plastoglobuli+von+Spinat,+ihre+Gr&#246;&#946;e,+Isolierung+und+Lipochinonzusammensetzung.">Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gr&#246;&#946;e, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung.</a> Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+and+lipoquinone+content+of+chloroplasts+from+Cereus+peruvianus+(L)+Mill.">Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill.</a> Planta. 87 (4), 304-310 (1969).</li><li>Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromoplast+ultrastructure+of+Capsicum+carotenoid+mutants+I.+Ultrastructure+and+carotenoid+composition+of+a+new+mutant.">Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant.</a> Zeitschrift f&#252;r Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).</li><li>Hansmann, P., Sitte, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+molecular+structure+of+chromoplast+globules+of+Viola+tricolor.">Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor.</a> Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).</li><li>Steinmuller, D., Tevini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+function+of+plastoglobuli+:+I.+Isolation+and+purification+from+chloroplasts+and+chromoplasts.">Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts.</a> Planta. 163 (2), 201-207 (1985).</li><li>Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proteins+associated+with+plastoglobules+isolated+from+pea+(Pisum+sativum+L.)+chloroplasts.">Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts.</a> Planta. 208 (1), 107-113 (1999).</li><li>Grennan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobule+proteome.">Plastoglobule proteome.</a> Plant Physiology. 147 (2), 443-445 (2008).</li><li>Peramuna, A., Summers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+occurrence+of+lipid+droplets+in+the+cyanobacterium+Nostoc+punctiforme.">Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme.</a> Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).</li><li>Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobules+are+lipoprotein+subcompartments+of+the+chloroplast+that+are+permanently+coupled+to+thylakoid+membranes+and+contain+biosynthetic+enzymes.">Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes.</a> The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).</li><li>Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid+lipid+droplets+at+the+crossroads+of+prenylquinone+metabolism.">Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).</li><li>Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plastoglobules+in+metabolite+repair+in+the+tocopherol+redox+cycle.">Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).</li><li>Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+functional+connections+between+cytoplasmic+and+chloroplast+triacylglycerol+storage.">Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage.</a> Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).</li><li>Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+isolation+from+Arabidopsis+thaliana+leaves.">Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves.</a> Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).</li><li>Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+changes+of+Arabidopsis+thaliana+plastoglobules+facilitate+thylakoid+membrane+remodeling+under+high+light+stress.">Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress.</a> Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).</li><li>Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plastoglobule-localized+protein+AtABC1K6+is+a+Mn2+-dependent+kinase+necessary+for+timely+transition+to+reproductive+growth.">The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth.</a> Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).</li><li>Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+topology+and+membrane+interaction+characteristics+of+plastoglobule-localized+AtFBN1a+and+AtLOX2.">Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2.</a> Plant Signalling &amp; Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).</li><li>Besagni, C., Piller, L. E., Br&#233;h&#233;lin, C., Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plastoglobules+from+Arabidopsis+Plastids+for+Proteomic+Analysis+and+Other+Studies.">Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies.</a> Chloroplast Research in Arabidopsis. , 223-239 (2011).</li><li>Yang, H., Murphy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+preparation,+sucrose+density+gradients+and+two-phase+separation+fractionation+from+five-day-old+Arabidopsis+seedlings.">Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings.</a> Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).</li><li>Kelekar, P., Wei, M., Yang, P., Pazour, G. J., King, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Radial+Spoke+Proteins.">Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins.</a> Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. 92, 181-196 (2009).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear-encoded+synthesis+of+the+D1+subunit+of+photosystem+II+increases+photosynthetic+efficiency+and+crop+yield.">Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield.</a> Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy+reveals+that+senescence+induces+in-situ+and+vacuolar+degradation+of+plastoglobules+in+aging+watermelon+leaves.">Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves.</a> Micron. 80, 135-144 (2016).</li><li>Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+FIBRILLIN4+gene+expression+in+apple+decreases+plastoglobule+plastoquinone+content.">Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content.</a> PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).</li><li>Singh, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIBRILLIN4+is+required+for+plastoglobule+development+and+stress+resistance+in+apple+and+Arabidopsis.">FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gardenia+carotenoid+cleavage+dioxygenase+4a+is+an+efficient+tool+for+biotechnological+production+of+crocins+in+green+and+non-green+plant+tissues.">Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues.</a> Plant Biotechnology Journal. , (2022).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian Journal of Biochemistry &amp; Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li></ol>

För att minimera fysiologiska/biokemiska förändringar i materialet och skydda vissa foto- och termolabila prenyllipidpigment som är en rik komponent i plastoglobuler är det viktigt att utföra isoleringen vid 4 °C och skyddas mot ljus. Som angivits ovan utförs de första stegen i kylrummet under en säkerhetslampa med en grönemitterande glödlampa. De efterföljande stegen som utförs i laboratoriet är under nedtonade ljus och använder is eller kyld centrifugering. Av liknande skäl är införandet av färska p...

Den nuvarande förståelsen av plastoglobulens sammansättning och funktion har framkommit genom detaljerade proteomiska och lipidomiska studier 1,2,3,4,5. Sådana studier har fått stor hjälp av en snabb och effektiv isoleringsmetod som förlitar sig på deras mycket låga densitet för effektiv separation med sackarosgradienter. Initiala metoder för plastoglobuleisolering uppnåddes från arter som bokträdet (Fagus sylvatica), skotsk kvast (Sarothamnus scoparius), lök (Allium cepa), spenat (Spinacia oleracea), pensé (Viola tricolor), peppar (Capsicum annuum) och ärter (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. En uppdaterad metod för att isolera kloroplastplastoglobuler på ett effektivare och bättre avkastande sätt presenterades senare av Ytterberg et al.3,14. Medan vi ursprungligen användes för studier av plastoglobuler av Arabidopsis thaliana bladkloroplaster, har vi framgångsrikt använt denna uppdaterade metod för frisk bladvävnad från andra växtarter, både monocot och dicot, inklusive majs (Zea mays), tomat (Solanum lycopersicum), lovegrass (Eragrostis nindensis), lila falsk brom (Brachypodium distachyon) och vild tobak (Nicotiana benthamiana ; opublicerade resultat). Dessutom har isoleringsmetoden framgångsrikt anpassats till plastoglobulerna av cyanobakterier, inklusive Synechocystis sp. PCC 6803 och Anabaena sp. PCC 712015, och den uttorkade bladvävnaden från uppståndelseväxten, E. nindensis.
Kloroplastplastoglobuler av frisk bladvävnad är fysiskt anslutna till tylakoidmembranen16. Trots denna fysiska kontinuitet upprätthåller de två kloroplastunderfacken distinkta lipid- och proteinkompositioner, även om det reglerade utbytet av lipid och protein mellan de två facken har föreslagits 2,4,17,18,19. Faktum är att en intressant hemifusionsmodell nyligen har föreslagits för handel med neutrala lipider mellan kloroplaster och cytosol19. På grund av den fysiska kontinuiteten hos plastoglobuler och tylakoider börjar isoleringsmetoden med frisk bladvävnad med uppsamlingen av ett pelleterat råtylakoidpreparat, som därefter ultraljudas för att separera plastoglobulerna från tylakoiderna, vilket står i kontrast till metoder som används för att isolera cytosoliska lipiddroppar20 . Ultracentrifugering på en sackaroskudde flyter sedan plastoglobulerna med låg densitet upp genom sackarosen och separerar dem effektivt från tylakoiderna, kärnorna och annat material med hög densitet. Däremot finns plastoglobuler i cyanobakterier, liksom de i torkad bladvävnad, uppenbarligen in vivo i en fritt flytande form. Därför innebär deras isolering direkt flytande på en sackarosgradient. Denna artikel visar isoleringsmetoden från frisk bladvävnad och visar vidare två variationer som kan användas för att isolera plastoglobuler från uttorkad bladvävnad eller cyanobakteriella kulturer, vilket kraftigt utökar den fysiologiska bredden och evolutionära sammanhanget där plastoglobuler kan studeras.
Isolerade plastoglobuler kan därefter användas för valfritt antal nedströmsanalyser för att undersöka molekylära egenskaper. Vi har använt de isolerade plastoglobulerna från A. thaliana bladvävnad för omfattande proteomisk och lipidomisk analys under olika miljöförhållanden eller genotyper, vilket visar selektiv modifiering av protein- och lipidkomposition vid anpassning till stress 2,4,21,22. Dessutom har in vitro-kinasanalyser som visar transfosforyleringsaktivitet associerad med isolerade plastoglobuler utförts 22, de oligomera tillstånden för proteinkomponenter har undersökts med användning av inhemsk gelelektrofores 21 och proteas-rakningsanalyser har utförts23.
Den främsta fördelen med denna metod är procedurens relativa hastighet. Enligt vår erfarenhet kan protokollen som beskrivs nedan slutföras helt inom cirka 4 timmar. En alternativ metod för att isolera plastoglobuler från bladvävnad har beskrivits, vilket möjliggör samtidig isolering av andra kloroplastunderfack24. Denna alternativa metod erbjuder några tydliga fördelar när kvantitativ jämförelse med de andra kloroplastunderfacken är nödvändig eller önskad. Denna alternativa metod är emellertid också mer tråkig och kommer att ge ett signifikant lägre utbyte av isolerade plastoglobuler från jämförbara mängder bladvävnad. När en fokuserad studie av plastoglobuler är målet är den metod som beskrivs här det optimala valet. Icke desto mindre kan totala blad- och råtylakoidalikvoter samlas in under provberedningen, och det rekommenderas starkt att göra det för att ha referensprover för efterföljande jämförelse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AEBSF</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antipain.2HCl</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>H-1765.0050BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>A6106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B8385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>35675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Proliant Biological</td>
			<td>68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chymostatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eragrostis nindensis</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-64</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure cell (model FA-079)</td>
			<td>SLM/Aminco</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron shaking incubator</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-ramidon.2 Na</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>M16050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced Cysteine</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>101444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ortho-vanadate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyrophosphate &#183; 10H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18&#34;</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synechocystis sp. PCC 6803</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-TL Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A95761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring Blender (1.2 L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58977-227</td>
			<td>Commercial blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zea mays</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plastoglobule lipid droplet isolation from plant leaf tissue and cyanobacteria

Plastoglobule lipiddroppar är ett dynamiskt underfack av växtkloroplaster och cyanobakterier. De finns allestädes närvarande bland fotosyntetiska arter och tros tjäna en central roll i anpassningen och ombyggnaden av tylakoidmembranet under snabbt föränderliga miljöförhållanden. Förmågan att isolera plastoglobuler med hög renhet har i hög grad underlättat deras studier genom proteomiska, lipidomiska och andra metoder. Med plastoglobuler med hög renhet och utbyte är det möjligt att undersöka deras lipid- och proteinsammansättning, enzymatisk aktivitet och proteintopologi, bland andra möjliga molekylära egenskaper. Denna artikel presenterar ett snabbt och effektivt protokoll för isolering av plastoglobuler från kloroplaster av växtbladvävnad och presenterar metodologiska variationer för isolering av plastoglobuler och relaterade lipiddroppstrukturer från majsblad, den torkade bladvävnaden i uppståndelseväxten, Eragrostis nindensis och cyanobakterien, Synechocystis sp. PCC 6803. Isolering är beroende av den låga densiteten hos dessa lipidrika partiklar, vilket underlättar deras rening genom sackarosdensitetsflotation. Denna metod kommer att visa sig vara värdefull i studien av plastoglobuler från olika arter.

Efter avslutad steg 1 i protokollet bör man lätt kunna se en betydande mängd plastoglobule / lipiddroppmaterial som flyter på (eller nära) det övre lagret av sackaroskudden (figur 1B-C). Andra fraktioner kan också samlas in i detta skede. Till exempel kommer tylakoiderna att pelleteras och kan suspenderas på nytt med medium R 0,2 för efterföljande analyser. Efter efterföljande centrifugering erhålls renade plastoglobuler vid eller nära sackarosg...

Watch this Scientific Journal Video about Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria at JoVE.com

Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

Ett snabbt och effektivt protokoll presenteras för isolering av plastoglobulelipiddroppar associerade med olika fotosyntetiska organismer. Den framgångsrika beredningen av isolerade plastoglobuler är ett avgörande första steg som föregår detaljerade molekylära undersökningar såsom proteomiska och lipidomiska analyser.

Plastoglobule lipiddroppisolering från växtbladvävnad och cyanobakterier

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...

Isoleringen av mycket rena plastoglobuler är avgörande för deras studie. Ett snabbt och effektivt protokoll för deras isolering som underlättar deras nedströms biokemiska undersökning presenteras här. Den främsta fördelen med denna metod är den relativa hastigheten på förfarandet och dess anpassningsförmåga till många växtarter och miljöförhållanden.Särskild försiktighet måste iakttas vid ultraljudsbehandling tylakoid resuspensioner för att säkerställa tillräcklig kraft för att strip plastoglobuler från tylakoider och med efterföljande extraktion av plastoglobuler från sackaros gradient. Att demonstrera denna procedur kommer att vara Dr.Elsinraju Devadasu, en postdoktoral forskare i mitt laboratorium, och Febri Susanto, doktorand i mitt laboratorium. Börja med att förvärva tre veckor gamla plantor av sex friska majs, med V5-tillväxtstadium och väger cirka 120 gram.Klipp av alla löv vid basen av stammen och dunka dem snabbt i ett isbad innan du transporterar dem till kylrummet. Arbeta under en grön säkerhetslampa, ta bort majsbladen från isbadet och klipp dem i mindre fem gånger fem centimeter bitar med sax. Mal försiktigt och noggrant hälften av den klippta bladvävnaden i 350 ml av slipbufferten på en nivå lägre än sju på en kommersiell mixer.Starta och stoppa mixern fem till sex gånger för att säkerställa att alla löv skärs. Filtrera homogenatet genom ett lager av 25 mikron nylonduk på en stor tratt till fyra 250-milliliter centrifugflaskor. Efter att ha upprepat blandningssteget med den återstående klippta bladvävnaden, fördela filtratet jämnt mellan de fyra flaskorna.Ta bort en alikvot av bladfiltratet och lägg det åt sidan för lagring som ett representativt totalbladprov. Därefter centrifugera filtratet i sex minuter vid 1 840 G och fyra grader Celsius. Häll av den resulterande supernatanten och, med mjuka virvlande rörelser av borsten, resuspendera pelleten i 12 ml medium R 0,2, innehållande 0,2 molar sackaros.Efter återsuspendering av pelleten i en flaska, tillsätt suspensionen till nästa flaska och upprepa resuspensionen för att slå samman suspensionerna i en flaska. Fördela den poolade suspensionen mellan sex tre-milliliter ultracentrifugrör och nå en maximal volym på 2,5 ml i varje rör. Använd sedan tipset sonicator vid en amplitud av 100%att sonikera varje rör fyra gånger för 10 sekunder vardera.Se till att hålla ljudsignalhornet nedsänkt och borta från vätskeytan för att förhindra skumning. Flytta långsamt ultraljudshornet upp och ner i upphängningen under varje omgång. Medan alternerande de fyra rören, återför varje rör till en ishink efter varje ultraljudsbehandling så att provet svalnar.När du är klar, centrifugera den sonikerade råa tylakoidsuspensionen vid 150 000 G i 30 minuter vid fyra grader Celsius. Skumma kuddeytan med en spruta och 22 gauge nål och skörda den resulterande gula och oljiga flytande dynan av råa plastoglobuler från sackaroskudden. Återvinn cirka 500 mikroliter från varje rör och deponera dem i ett 2,0 ml rör.Samla rå thylakoid aliquots före och efter ultraljudsbehandling och frisättning av plastoglobuler. När du är klar, fortsätt antingen växtvävnadsbearbetningen eller förvara de råa plastoglobulerna vid minus 80 grader Celsius och rena dem senare. Odla 50 ml synechocystis-arter PCC 6802-kultur i BG11-media i 7 till 10 dagar för att nå den stationära fasen.Använd en spektrofotometer och justera celldensiteten till en optisk densitet på 2,0 vid 750 nanometer. För att avlägsna polysackariderna, centrifugera 50 ml kultur och ta bort supernatanten. Upprepa tvättningen av cellerna i 50 ml buffert A två gånger.Återsuspendera den tvättade pelleten i 25 ml buffert A och bryt cellerna med en fransk tryckcell vid 1 100 pund kvadrattum. Upprepa processen tre gånger under kalla förhållanden tills den lyserade färgen ändras från grönt till rött, blått, grönt under vitt ljus. Avlägsna alikvoten av cellhomogenatet och lägg den åt sidan för lagring som ett representativt totalcellprov.Fördela det resulterande homogenatet i åtta tre-milliliter ultracentrifugrör fyllda till högst 2,5 ml i varje rör. Överlägg detta homogenat med 400 mikroliter medium R, vilket ger en steggradient. Balansera rören försiktigt genom att tillsätta ytterligare medium R efter behov innan rören centrifugeras.Tylakoiden och andra tyngre organeller, inklusive eventuella polyhydroxyalkanoatkroppar, visar pelletsbildning, medan plastoglobuler bildar en gul oljig dyna på eller nära toppen av sackarosgradienten. Skörda den resulterande flytande dynan av råa plastoglobuler med en spruta, som visats tidigare, och deponera skörden i ett två-milliliter rör. Skrapa bort plastoglobuler från sidan av ultracentrifugrörsväggen med en nålspets om det behövs.Fortsätt antingen med cyanobakteriebearbetning eller lagra råa plastoglobuler vid minus 80 grader Celsius och rena senare. För att skörda de rena plastglobulerna med hjälp av växtvävnadsbearbetningsmetoden, förbered sackarosgradienten som beskrivits tidigare med 500 mikroliter råplastglobuler, 400 mikroliter medium R 0,2 och 400 mikroliter medium R.Efter centrifugering skörda den resulterande flytande dynan av rena plastglobuler i ett två-milliliter rör. Efter alikvotering av de rena plastglobulerna och blixtfrysning av alikvoterna i flytande kväve, antingen förvara dem vid minus 80 grader Celsius eller frysa dem till ett torrt pulver.För att skörda rena plastoglobuler från cyanobakterier, skapa en sackarosgradient, som tidigare nämnts, med 500 mikroliter av de råa plastglobulerna, 750 mikroliter medium R 0,7 och 750 mikroliter medium R 0,2. Efter centrifugering samlas de rena plastglobulerna i ett 1,5 ml rör och alikvot de rena plastglobulerna. När du är klar, frys de rena plastoglobulerna alikvoter i flytande kväve och förvara dem direkt vid minus 80 grader Celsius eller frystorka till ett torrt pulver.I denna metod sågs en betydande mängd plastoglobul eller lipiddroppmaterial flyta på det övre lagret av sackaroskudden. Efter efterföljande centrifugering erhölls renade plastoglobuler vid eller nära ytan av sackarosgradienten. Efter framgångsrik isolering av plastoglobuler visade immunoblots som utvecklats för renhetsbedömning med antikroppar upphöjda mot arabidopsis thaliana fibrillin 1a och arabidopsis thaliana fotosystem II subenhet D1 att fibrillinhomologerna primärt var associerade med tylakoider än plastoglobulerna.För att säkerställa effektiv och koncentrerad extraktion av den flytande dynan, placera sprutnålöppningen strax under buffertens vätskeyta medan den är helt nedsänkt och dra sedan försiktigt upp. Isolerade plastoglobulprover är mottagliga för efterföljande proteomiska eller lipidomiska studier och har använts för att visa förändringarna i den riktade protein-lipidkompositionen under olika miljöförhållanden. Denna teknik har underlättat nya studier av plastoglobul, inklusive upptäckten av associerad proteinkinasaktivitet och närvaron av oligomera proteinkomplex genom efterföljande biokemisk undersökning.

Research

JoVE Journal

Biology

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

LeafJ: En ImageJ Plugin för halvautomatisk bladform Mätning

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Effektiv och snabb isolering av tidigt stadium embryon från<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Frön

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Isolering av livskraftig flercelliga körtlar från Tissue av köttätande växt, Nepenthes</i

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Isolering och analysen av sammansättningen av Kutikula Lipid Polyester monomerer

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Snabb Lipid Droplet isolering protokoll använder en väletablerad organell isolering Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Dissektion och lipid dropp färgning av Oenocyter i Drosophila larver

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

Förbereda och föda upp axeniska insekter med vävnadsodlade plantor för värd-tarmmikrobiotainteraktionsstudier av bladbaggen

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

Isolering och karakterisering av intakt fycobilisome i Cyanobakterier

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Isolering och analys av spårbara och funktionaliserade extracellulära vesiklar från plasma och fasta vävnader

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Isolering, karakterisering och terapeutisk tillämpning av extracellulära vesiklar från odlade humana mesenkymala stamceller

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...