Name: plastoglobule lipid droplet isolation from plant leaf tissue and cyanobacteria
Uploaded: 2022-10-06T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria at JoVE.com

Lundquist laboratuvar grubundaki araştırmalar, NSF (MCB-2034631) ve USDA'dan (MICL08607) P.K.L.'ye verilen hibelerle desteklenmektedir. Yazarlar, siyanobakteriyel plastoglobül izolasyon yönteminin geliştirilmesindeki desteği için Dr. Carrie Hiser'e (MSU) teşekkür eder.

1. Ham plastoglobül izolasyonu
<ol><li>Stressiz mısır yaprağı dokusundan ham plastoglobül ekstraksiyonu<ol><li>Yaklaşık 3 haftalık ve yaklaşık V5 büyüme aşamasında, yaklaşık 120 g ağırlığında altı sağlıklı mısır fidanı edinin.</li>
		<li>Sapın tabanındaki tüm yaprakları kesin, hızla bir buz banyosuna batırın ve soğuk odaya taşıyın.</li>
		<li>Yeşil bir güvenlik lambası altında çalışırken, mısır yapraklarını buz banyosundan çıkarın ve makas kullanar...

<ol>
	<li>Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+throughout+the+evolutionary+tree.">Lipid droplets throughout the evolutionary tree.</a> Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).</li><li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+network+of+the+Arabidopsis+plastoglobule+proteome+based+on+quantitative+proteomics+and+genome-wide+coexpression+analysis.">The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis.</a> Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).</li><li>Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+of+plastoglobules+in+chloroplasts+and+chromoplasts.+A+surprising+site+for+differential+accumulation+of+metabolic+enzymes.">Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes.</a> Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).</li><li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+plastoglobule+kinases+ABC1K1+and+ABC1K3+causes+conditional+degreening,+modified+prenyl-lipids,+and+recruitment+of+the+jasmonic+acid+pathway.">Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway.</a> The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).</li><li>Vidi, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tocopherol+cyclase+(VTE1)+localization+and+vitamin+E+accumulation+in+chloroplast+plastoglobule+lipoprotein+particles.">Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+and+the+fine+structure+of+plastids.">Plastoglobuli and the fine structure of plastids.</a> Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).</li><li>Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+in+different+types+of+plastids+from+Allium+cepa+L.">Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L.</a> Planta. 72 (1), 1-13 (1966).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Plastoglobuli+von+Spinat,+ihre+Gr&#246;&#946;e,+Isolierung+und+Lipochinonzusammensetzung.">Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gr&#246;&#946;e, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung.</a> Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobuli+and+lipoquinone+content+of+chloroplasts+from+Cereus+peruvianus+(L)+Mill.">Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill.</a> Planta. 87 (4), 304-310 (1969).</li><li>Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromoplast+ultrastructure+of+Capsicum+carotenoid+mutants+I.+Ultrastructure+and+carotenoid+composition+of+a+new+mutant.">Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant.</a> Zeitschrift f&#252;r Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).</li><li>Hansmann, P., Sitte, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+molecular+structure+of+chromoplast+globules+of+Viola+tricolor.">Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor.</a> Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).</li><li>Steinmuller, D., Tevini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+function+of+plastoglobuli+:+I.+Isolation+and+purification+from+chloroplasts+and+chromoplasts.">Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts.</a> Planta. 163 (2), 201-207 (1985).</li><li>Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proteins+associated+with+plastoglobules+isolated+from+pea+(Pisum+sativum+L.)+chloroplasts.">Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts.</a> Planta. 208 (1), 107-113 (1999).</li><li>Grennan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobule+proteome.">Plastoglobule proteome.</a> Plant Physiology. 147 (2), 443-445 (2008).</li><li>Peramuna, A., Summers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+occurrence+of+lipid+droplets+in+the+cyanobacterium+Nostoc+punctiforme.">Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme.</a> Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).</li><li>Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastoglobules+are+lipoprotein+subcompartments+of+the+chloroplast+that+are+permanently+coupled+to+thylakoid+membranes+and+contain+biosynthetic+enzymes.">Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes.</a> The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).</li><li>Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid+lipid+droplets+at+the+crossroads+of+prenylquinone+metabolism.">Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).</li><li>Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plastoglobules+in+metabolite+repair+in+the+tocopherol+redox+cycle.">Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).</li><li>Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+functional+connections+between+cytoplasmic+and+chloroplast+triacylglycerol+storage.">Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage.</a> Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).</li><li>Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+isolation+from+Arabidopsis+thaliana+leaves.">Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves.</a> Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).</li><li>Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+changes+of+Arabidopsis+thaliana+plastoglobules+facilitate+thylakoid+membrane+remodeling+under+high+light+stress.">Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress.</a> Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).</li><li>Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plastoglobule-localized+protein+AtABC1K6+is+a+Mn2+-dependent+kinase+necessary+for+timely+transition+to+reproductive+growth.">The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth.</a> Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).</li><li>Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+topology+and+membrane+interaction+characteristics+of+plastoglobule-localized+AtFBN1a+and+AtLOX2.">Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2.</a> Plant Signalling &amp; Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).</li><li>Besagni, C., Piller, L. E., Br&#233;h&#233;lin, C., Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plastoglobules+from+Arabidopsis+Plastids+for+Proteomic+Analysis+and+Other+Studies.">Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies.</a> Chloroplast Research in Arabidopsis. , 223-239 (2011).</li><li>Yang, H., Murphy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+preparation,+sucrose+density+gradients+and+two-phase+separation+fractionation+from+five-day-old+Arabidopsis+seedlings.">Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings.</a> Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).</li><li>Kelekar, P., Wei, M., Yang, P., Pazour, G. J., King, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Radial+Spoke+Proteins.">Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins.</a> Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. 92, 181-196 (2009).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear-encoded+synthesis+of+the+D1+subunit+of+photosystem+II+increases+photosynthetic+efficiency+and+crop+yield.">Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield.</a> Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy+reveals+that+senescence+induces+in-situ+and+vacuolar+degradation+of+plastoglobules+in+aging+watermelon+leaves.">Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves.</a> Micron. 80, 135-144 (2016).</li><li>Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+FIBRILLIN4+gene+expression+in+apple+decreases+plastoglobule+plastoquinone+content.">Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content.</a> PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).</li><li>Singh, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIBRILLIN4+is+required+for+plastoglobule+development+and+stress+resistance+in+apple+and+Arabidopsis.">FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gardenia+carotenoid+cleavage+dioxygenase+4a+is+an+efficient+tool+for+biotechnological+production+of+crocins+in+green+and+non-green+plant+tissues.">Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues.</a> Plant Biotechnology Journal. , (2022).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian Journal of Biochemistry &amp; Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li></ol>

Malzemedeki fizyolojik / biyokimyasal değişiklikleri en aza indirmek ve plastoglobüllerin zengin bir bileşeni olan bazı foto-ve termo-kararsız prenil-lipid pigmentlerini korumak için, izolasyonun 4 ° C'de yapılması ve ışıktan korunması kritik öneme sahiptir. Yukarıda belirtildiği gibi, ilk adımlar soğuk odada yeşil yayan bir ampul kullanılarak bir güvenlik lambasının altında gerçekleştirilir. Laboratuvarda gerçekleştirilen sonraki adımlar soluk ışıklar altındadır ve buz veya soğutulmu?...

Plastoglobül kompozisyonu ve fonksiyonunun güncel anlayışı ayrıntılı proteomik ve lipidomik çalışmalarla ortaya çıkmıştır 1,2,3,4,5. Bu tür çalışmalar, sakkaroz gradyanları kullanılarak verimli ayırma için çok düşük yoğunluklarına dayanan hızlı ve etkili bir izolasyon yöntemi ile büyük ölçüde desteklenmiştir. Plastoglobul izolasyonunun ilk yöntemleri, kayın ağacı (Fagus sylvatica), viski süpürgesi (Sarothamnus scoparius), soğan (Allium cepa), ıspanak (Spinacia oleracea), hercai menekşe (Viola tricolor), biber (Capsicum annuum) ve bezelye (Pisum sativum) 6,7,8,9,10,11 gibi türlerden elde edildi. ,12,13. Kloroplast plastoglobülleri daha verimli ve daha iyi verimli bir şekilde izole etmek için güncellenmiş bir yöntem daha sonra Ytterberg ve ark.3,14 tarafından sunulmuştur. Başlangıçta Arabidopsis thaliana yaprak kloroplastlarının plastoglobüllerinin incelenmesi için kullanılırken, bu güncellenmiş yöntemi, mısır (Zea mays), domates (Solanum lycopersicum), lovegrass (Eragrostis nindensis), mor sahte brom (Brachypodium distachyon) ve yabani tütün (Nicotiana benthamiana) dahil olmak üzere hem monokot hem de dikot gibi diğer bitki türlerinin sağlıklı yaprak dokusu için başarıyla kullandık. ; yayınlanmamış sonuçlar). Ayrıca, izolasyon yöntemi, Synechocystis sp. PCC 6803 ve Anabaena sp. PCC 712015 ve diriliş bitkisinin kurutulmuş yaprak dokusu E. nintensis dahil olmak üzere siyanobakterilerin plastoglobüllerine başarıyla uyarlanmıştır.
Sağlıklı yaprak dokusunun kloroplast plastoglobülleri tilakoid membranlara fiziksel olarak bağlıdır16. Bu fiziksel sürekliliğe rağmen, iki kloroplast alt bölmesi farklı lipit ve protein bileşimlerini korur, ancak iki bölme arasındaki düzenlenmiş lipit ve protein değişimiönerilmiştir 2,4,17,18,19. Aslında, son zamanlarda kloroplastlar ve sitosol19 arasındaki nötr lipitlerin kaçakçılığı için ilginç bir hemifüzyon modeli önerilmiştir. Plastoglobüllerin ve tilakoidlerin fiziksel sürekliliği nedeniyle, sağlıklı yaprak dokusu ile izolasyon yöntemi, daha sonra plastoglobülleri tilakoidlerden ayırmak için sonikleştirilen peletlenmiş ham tilakoid preparatının toplanmasıyla başlar, bu da sitozolik lipit damlacıklarını izole etmek için kullanılan yöntemlerin aksinedir20 . Bir sakkaroz yastığı üzerindeki ultrasantrifüjleme daha sonra düşük yoğunluklu plastoglobülleri sakkaroz boyunca yüzdürür ve onları tilakoidlerden, çekirdeklerden ve diğer yüksek yoğunluklu malzemelerden etkili bir şekilde ayırır. Buna karşılık, siyanobakterilerdeki plastoglobüllerin yanı sıra kurutulmuş yaprak dokusundakiler, serbest yüzen bir formda in vivo olarak açıkça bulunur. Bu nedenle, izolasyonları doğrudan bir sakkaroz gradyanı üzerinde yüzmeyi içerir. Bu makale, sağlıklı yaprak dokusundan izolasyon yöntemini göstermektedir ve ayrıca plastoglobülleri kurutulmuş yaprak dokusundan veya siyanobakteriyel kültürlerden izole etmek için kullanılabilecek iki varyasyonu göstererek, plastoglobüllerin çalışılabileceği fizyolojik genişliği ve evrimsel bağlamı büyük ölçüde genişletmektedir.
İzole plastoglobüller daha sonra moleküler özellikleri araştırmak için herhangi bir sayıda aşağı akış analizi için kullanılabilir. A. thaliana yaprak dokusundan izole plastoglobülleri, farklı çevresel koşullar veya genotipler altında kapsamlı proteomik ve lipidomik analiz için kullandık ve stres 2,4,21,22'ye adaptasyonda protein ve lipit bileşiminin seçici modifikasyonunu gösterdik. Ek olarak, izole plastoglobüllerle ilişkili trans-fosforilasyon aktivitesini gösteren in vitro kinaz testleri22, protein bileşenlerinin oligomerik durumları doğal jel elektroforezi 21 kullanılarak araştırıldı ve proteaz tıraş testleri23 yapıldı.
Bu yöntemin birincil yararı, prosedürün göreceli hızıdır. Deneyimlerimize göre, aşağıda özetlenen protokoller yaklaşık 4 saat içinde tamamen tamamlanabilir. Plastoglobülleri yaprak dokusundan izole etmek için alternatif bir yöntem tanımlanmıştır, bu da diğer kloroplast alt bölmelerinin eşzamanlı izolasyonuna izin verir24. Bu alternatif yöntem, diğer kloroplast alt bölmeleriyle kantitatif karşılaştırma gerektiğinde veya istendiğinde bazı açık avantajlar sunar. Bununla birlikte, bu alternatif yöntem aynı zamanda daha sıkıcıdır ve karşılaştırılabilir miktarlarda yaprak dokusundan izole plastoglobüllerin önemli ölçüde daha düşük verimini sağlayacaktır. Plastoglobüllerin odaklanmış bir çalışması amaçlandığında, burada özetlenen metodoloji en uygun seçimdir. Bununla birlikte, numune hazırlama sırasında toplam yaprak ve ham tilakoid alikotlar toplanabilir ve daha sonraki karşılaştırmalar için referans numunelere sahip olmak için bunu yapmanız şiddetle tavsiye edilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AEBSF</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antipain.2HCl</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>H-1765.0050BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>A6106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B8385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>35675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Proliant Biological</td>
			<td>68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chymostatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eragrostis nindensis</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-64</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure cell (model FA-079)</td>
			<td>SLM/Aminco</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron shaking incubator</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-ramidon.2 Na</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>M16050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced Cysteine</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>101444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ortho-vanadate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyrophosphate &#183; 10H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18&#34;</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synechocystis sp. PCC 6803</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-TL Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A95761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring Blender (1.2 L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58977-227</td>
			<td>Commercial blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zea mays</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plastoglobule lipid droplet isolation from plant leaf tissue and cyanobacteria

Plastoglobül lipit damlacıkları, bitki kloroplastlarının ve siyanobakterilerin dinamik bir alt bölmesidir. Fotosentetik türler arasında her yerde bulunan, hızla değişen çevresel koşullar altında tilakoid membranın adaptasyonunda ve yeniden şekillenmesinde merkezi bir rol oynadığına inanılmaktadır. Yüksek saflıktaki plastoglobülleri izole etme kapasitesi, proteomik, lipidomik ve diğer metodolojiler yoluyla çalışmalarını büyük ölçüde kolaylaştırmıştır. Yüksek saflık ve verime sahip plastoglobüllerle, diğer olası moleküler özelliklerin yanı sıra lipit ve protein bileşimlerini, enzimatik aktivitelerini ve protein topolojilerini araştırmak mümkündür. Bu makalede, plastoglobüllerin bitki yaprağı dokusunun kloroplastlarından izolasyonu için hızlı ve etkili bir protokol sunulmakta ve plastoglobüllerin ve ilgili lipit damlacık yapılarının mısır yapraklarından, diriliş bitkisinin kurutulmuş yaprak dokusundan, Eragrostis nindensis'ten ve siyanobakteri, Synechocystis'ten izolasyonu için metodolojik varyasyonlar sunulmaktadır. sp. PCC 6803. İzolasyon, bu lipit bakımından zengin parçacıkların düşük yoğunluğuna dayanır ve bu da sakkaroz yoğunluğu yüzdürme ile saflaştırmalarını kolaylaştırır. Bu metodoloji, çeşitli türlerden plastoglobüllerin incelenmesinde değerli olduğunu kanıtlayacaktır.

Protokolün 1. adımının tamamlanmasının ardından, sakkaroz yastığının üst tabakası üzerinde (veya yakınında) yüzen önemli miktarda plastoglobül/lipit damlacık materyali kolayca görülebilmelidir (Şekil 1B-C). Bu aşamada diğer fraksiyonlar da toplanabilir. Örneğin, tilakoidler peletlenecek ve sonraki analizler için orta R 0.2 ile yeniden askıya alınabilir. Sonraki santrifüjlemeden sonra, Şekil 1A, <s...

Watch this Scientific Journal Video about Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria at JoVE.com

Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

Çeşitli fotosentetik organizmalarla ilişkili plastoglobül lipid damlacıklarının izolasyonu için hızlı ve etkili bir protokol sunulmaktadır. İzole plastoglobüllerin başarılı bir şekilde hazırlanması, proteomik ve lipidomik analizler gibi ayrıntılı moleküler araştırmalardan önce gelen çok önemli bir ilk adımdır.

Plastoglobül Lipid Damlacığı İzolasyonu Bitki Yaprağı Dokusu ve Siyanobakterilerden

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...

Son derece saf plastoglobüllerin izolasyonu, çalışmaları için kritik öneme sahiptir. İzolasyonları için aşağı akış biyokimyasal araştırmalarını kolaylaştıran hızlı ve etkili bir protokol burada sunulmaktadır. Bu yöntemin birincil yararı, prosedürün göreceli hızı ve çok sayıda bitki türüne ve çevresel koşullara uyarlanabilirliğidir.Plastoglobülleri tilakoidlerden sıyırmak için yeterli kuvveti sağlamak için tilakoid resüsitasyonlarını sonikleştirirken ve daha sonra sakkaroz gradyanından plastoglobüllerin çıkarılmasıyla özel dikkat gösterilmelidir. Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımda doktora sonrası araştırmacı olan Dr. Elsinraju Devadasu ve laboratuvarımda doktora öğrencisi olan Febri Susanto olacak. V5 büyüme aşamasına sahip ve yaklaşık 120 gram ağırlığında altı sağlıklı mısırın üç haftalık fidelerini edinerek başlayın.Sapın tabanındaki tüm yaprakları kesin ve soğuk odaya taşımadan önce hızla bir buz banyosuna batırın. Yeşil bir güvenlik lambası altında çalışırken, mısır yapraklarını buz banyosundan çıkarın ve makas kullanarak daha küçük beşe beş santimetrelik parçalara ayırın. Kırpılmış yaprak dokusunun yarısını, ticari bir karıştırıcıda yediden düşük bir seviyede öğütme tamponunun 350 mililitresinde nazikçe ve iyice öğütün.Tüm yaprakların kesildiğinden emin olmak için karıştırıcıyı beş ila altı kez başlatın ve durdurun. Homojenatı büyük bir huni üzerinde bir kat 25 mikron naylon bezden dört adet 250 mililitrelik santrifüj şişesine filtreleyin. Karıştırma adımını kalan kırpılmış yaprak dokusuyla tekrarladıktan sonra, filtradı dört şişe arasında eşit olarak bölün.Yaprak filtrasyonunun bir aliquotunu çıkarın ve temsili bir toplam yaprak örneği olarak saklanmak üzere bir kenara koyun. Daha sonra, filtratın altı dakika boyunca 1.840 G ve dört santigrat derecede santrifüj yapın. Elde edilen süpernatantı dökün ve fırçanın yumuşak döner hareketleriyle, peleti 0.2 molar sakkaroz içeren 12 mililitre orta R 0.2 içinde yeniden askıya alın.Pelet'i bir şişede yeniden askıya aldıktan sonra, süspansiyonu bir sonraki şişeye ekleyin ve süspansiyonları bir şişede toplamak için yeniden süspansiyonu tekrarlayın. Havuzlanmış süspansiyonu altı adet üç mililitrelik ultrasantrifüj tüp arasında dağıtın ve her tüpte maksimum 2,5 mililitre hacme ulaşın. Ardından, her tüpü her biri 10 saniye boyunca dört kez sonikleştirmek için% 100 genlikte uç sonicator'u kullanın.Köpüğü önlemek için sonicator boynuzunu suya batırılmış ve sıvı yüzeyden uzak tuttuğunuzdan emin olun. Her tur boyunca sonicator kornasını süspansiyon içinde yavaşça yukarı ve aşağı hareket ettirin. Dört tüpü değiştirirken, numunenin soğumasına izin vermek için her sonikasyondan sonra her tüpü bir buz kovasına geri döndürün.Bir kez bittiğinde, sonikleştirilmiş ham tilakoid süspansiyonunu dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 150.000 G'de santrifüj yapın. Bir şırınga ve 22 gauge iğne kullanarak yastık yüzeyini gözden geçirin ve elde edilen sarı ve yağlı yüzer ham plastoglobül pedini sakkaroz yastığından toplayın. Her tüpten yaklaşık 500 mikrolitre geri kazanın ve bunları 2.0 mililitrelik bir tüpe koyun.Plastoglobüllerin sonikasyonundan ve salınımından önce ve sonra ham thylakoid aliquots toplayın. Bir kez yapıldıktan sonra, bitki dokusu işlemeye devam edin veya ham plastoglobülleri eksi 80 santigrat derecede saklayın ve daha sonra saflaştırın. Sabit faza ulaşmak için BG11 ortamında 50 mililitre synechocystis türü PCC 6802 kültürünü 7 ila 10 gün boyunca büyütün.Bir spektrofotometre kullanarak, hücre yoğunluğunu 750 nanometrede 2.0 optik yoğunluğa ayarlayın. Polisakaritleri çıkarmak için, 50 mililitre kültürü santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. Hücrelerin 50 mililitre tampon A'da iki kez yıkanmasını tekrarlayın.Yıkanmış peleti 25 mililitre tampon A'da yeniden askıya alın ve hücreleri 1.100 pound inç karede bir Fransız basınç hücresi kullanarak kırın. Lised rengi yeşilden kırmızıya, maviye, yeşile beyaz ışık altında değişene kadar işlemi soğuk koşullarda üç kez tekrarlayın. Hücre homojenatının aliquot'unu çıkarın ve temsili bir toplam hücre örneği olarak saklanmak üzere bir kenara koyun.Elde edilen homojenatı her tüpte maksimum 2,5 mililitreye kadar doldurulmuş sekiz adet üç mililitrelik ultrasantrifüj tüpüne dağıtın. Bu homojenatı 400 mikrolitre orta R ile kaplayın ve bir adım gradyanı üretin. Tüpleri santrifüj etmeden önce gerektiğinde ilave ortam R ekleyerek tüpleri dikkatlice dengeleyin.Herhangi bir polihidroksyalkanoat cismi de dahil olmak üzere tilakoid ve diğer ağır organeller pelet oluşumu gösterirken, plastoglobüller sakkaroz gradyanının üstünde veya yakınında sarı yağlı bir ped oluşturur. Elde edilen yüzer ham plastoglobül pedini, daha önce gösterildiği gibi bir şırınga ile hasat edin ve hasadı iki mililitrelik bir tüpe koyun. Plastoglobülleri ultrasantrifüj tüp duvarının yan tarafından gerekirse bir iğne ucu ile kazıyın.Ya siyanobakteri işlemeye devam edin ya da ham plastoglobülleri eksi 80 santigrat derecede depolayın ve daha sonra saflaştırın. Bitki dokusu işleme yöntemini kullanarak saf plastoglobülleri hasat etmek için, 500 mikrolitre ham plastoglobül, 400 mikrolitre orta R 0.2 ve 400 mikrolitre orta R. Santrifüjlemeden sonra, elde edilen yüzer saf plastoglobül pedini iki mililitrelik bir tüpe toplayın. Saf plastoglobülleri alıkoyduktan ve alikotları sıvı azotta dondurduktan sonra, ya eksi 80 santigrat derecede saklayın ya da kuru bir toza liyofilize edin.Siyanobakterilerden saf plastoglobülleri hasat etmek için, daha önce de belirtildiği gibi, 500 mikrolitre ham plastoglobül, 750 mikrolitre orta R 0.7 ve 750 mikrolitre orta R 0.2 kullanarak bir sakkaroz gradyanı oluşturun. Santrifüjlemeden sonra, saf plastoglobülleri 1.5 mililitrelik bir tüpte toplayın ve saf plastoglobülleri aliquot edin. Tamamlandığında, saf plastoglobüller alikotlarını sıvı azotta flaş dondurun ve doğrudan eksi 80 santigrat derecede saklayın veya kuru bir toza liyofilize edin.Bu yöntemde sakkaroz yastığının üst tabakasında yüzen önemli miktarda plastoglobül veya lipid damlacık materyali görülmüştür. Daha sonraki santrifüjlemeden sonra, saflaştırılmış plastoglobüller sakkaroz gradyanının yüzeyinde veya yakınında elde edildi. Plastoglobüllerin başarılı bir şekilde izole edilmesinden sonra, arabidopsis thaliana fibrilin 1a ve arabidopsis thaliana fotosistem II alt ünitesi D1'e karşı yükseltilen antikorlar kullanılarak saflık değerlendirmesi için geliştirilen immünoblotlar, fibrilin homologlarının öncelikle plastoglobüllerden ziyade tilakoidlerle ilişkili olduğunu göstermiştir.Yüzer pedin verimli ve konsantre bir şekilde ekstraksiyonunu sağlamak için, şırınga iğne deliğini tamamen suya batırılmışken tamponun sıvı yüzeyinin hemen altına yerleştirin, ardından yavaşça yukarı çekin. İzole plastoglobül örnekleri, sonraki proteomik veya lipidomik çalışmalara uygundur ve farklı çevresel koşullar altında hedeflenen protein-lipid bileşimindeki değişiklikleri göstermek için kullanılmıştır. Bu teknik, ilişkili protein kinaz aktivitesinin keşfi ve daha sonraki biyokimyasal araştırmalarla oligomerik protein komplekslerinin varlığı da dahil olmak üzere plastoglobülün yeni çalışmalarını kolaylaştırmıştır.

Research

JoVE Journal

Biology

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

LeafJ: Yarı otomatik Yaprak Shape Ölçüm için bir ImageJ Plugin

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Erken evre Embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Tohumlar

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Bitki Tırnak Lipid Polyester Monomer İzolasyonu ve biçim Analizi

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Bir Well-established organel izolasyon Kit kullanarak hızlı Lipid damlacık yalıtım Protokolü

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Drosophila Larvalarında Oenositlerin Diseksiyonu ve Lipid Damlacık Boyaması

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

Yaprak Böceğinin Host-Gut Mikrobiyota Etkileşim Çalışmaları için Doku Kültürlü Fidanlarla Aksenik Böceklerin Hazırlanması ve Yetiştirilmesi

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

Siyanobakterilerde Bozulmamış Fitoidinin İzolasyonu ve Karakterizasyonu

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Plazma ve Solid Dokulardan İzlenebilir ve İşlevselleştirilmiş Hücre Dışı Veziküllerin İzlenmesi ve Analizi

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Kültürlenmiş İnsan Mezenkimal Kök Hücrelerinden Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Terapötik Uygulaması

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...