تحمل البكتيريا مثل E.coli جينات مقاومة للمضادات الحيوية في البلازميدات المترافقة. يمكن العثور على هذه البكتيريا في المستشفيات ، وتعيش كمتعايشات في الحيوانات ، وفي البيئات المائية. البلازميدات المترافقة الطبيعية النقل الأفقي للجينات بين السلالات البكتيرية المختلفة.
نقدم المعادن للكشف عن البلازميدات المترافقة وكفاءة اقتران التكوين. هذه التقنية بسيطة وحساسة. إنه حساس لأنه يستخدم علامات للبلازميد والمتبرع والمتلقي.
هذه العلامات قابلة للاختيار ، مما يعني أنه يمكنها تحديد الأحداث الفردية في مجموعات سكانية كبيرة جدا. البروتوكولات التي نقدمها مفيدة لدراسة تطور مقاومة المضادات الحيوية والمراقبة الوبائية ، أي مراقبة تدفق الجينات المقاومة للأدوية. سيوضح الإجراء كايسون وارنر ، طالب دكتوراه من مختبري ، وبيبر سانت كلير ، طالب جامعي من مختبر CAMS.
في اليوم الأول ، قم بخط المتبرعين والمتلقي بشكل منفصل من مخزون الجلسرين على الوسائط C وهو MacConkey agar بدون مضادات حيوية واحتضانه طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم الثاني ، قم بتسمية أنبوب مزرعة سعة 14 ملليلتر لكل متبرع ومتلقي. حدد مستعمرة واحدة لكل متبرع ومتلقي وقم بزراعتها في ملليلتر من مرق مولر هينتون عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية.
في اليوم الثالث ، قم بقياس الكثافة البصرية ل 10 أضعاف الثقافة الملحية المخففة بين عشية وضحاها عند 600 نانومتر دون دوامة. إذا لزم الأمر ، استخدم محلول ملحي معقم لضبط الكثافة البصرية إلى اثنين. قم بتسمية أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر كأنبوب تزاوج ، مع الإشارة إلى سلالات المتبرع والمتلقي.
انقل 500 ميكرولتر من التعليق المعدل لكل متبرع ومتلقي في أنبوب التزاوج وامزج التعليق برفق عن طريق الانقلاب. جهاز طرد مركزي أنبوب التزاوج في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق عند 500 G.ماصة من 800 ميكرولتر من المادة الطافية من أنبوب التزاوج دون إزعاج الحبيبات ، وترك 200 ميكرولتر في الأنبوب. احتضان أنبوب التزاوج لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية.
علاوة على ذلك ، كعنصر تحكم سلبي ، قم بخط ثقافة المتبرعين بين عشية وضحاها على الوسائط B والمتلقين على الوسائط A واحتضان اللوحات طوال الليل عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، في اليوم الرابع ، أضف 800 ميكرولتر من المحلول الملحي إلى أنبوب التزاوج وأعد تعليقه عن طريق الدوامة. قم بعمل تخفيفات تسلسلية لتعليق التزاوج وأضف 100 ميكرولتر من كل تخفيف على ألواح الوسائط.
بمجرد تجفيف الألواح ، احتضنها لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية واحسب تكرار الاقتران لكل متبرع أو لكل مستلم كما هو موضح في المخطوطة. بعد استخراج الحمض النووي من جدران الخلايا البكتيرية باستخدام طريقة بسيطة لاستخراج تحضير الغليان ، قم بتسمية أنبوب سعة 1.5 ملليلتر كتجمع في أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل المطلوبة باسم الجين والعينة. في الأنبوب المسمى بالبركة ، أضف الماء المعقم ، والمزيج الرئيسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل ، والبادئات ، والبلمرة.
امزج برفق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 10 مرات على الأقل في بيئة باردة. أضف قالب الحمض النووي إلى الأنبوب المقابل وقم بتأمين أنابيب PCR بأغطية. ضع أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل في جهاز التدوير الحراري وابدأ برنامج جينات المقاومة و replicons كما هو موضح في المخطوطة.
لتأكيد amplicon ، قم بإعداد هلام agarose بنسبة 1٪ عن طريق إضافة agarose و TAE buffer في قارورة 250 ملليلتر وقم بإذابة الأغاروز باستخدام الميكروويف. بمجرد أن يبرد محلول الأغاروز إلى حوالي 55 درجة مئوية ، تحت غطاء الدخان ، أضف ستة ميكرولترات من SYBR Green واخلطها. صب الجل في صينية محكمة الغلق بشريط لاصق لتجنب الانسكاب واترك الجل يتماسك لمدة 15 إلى 25 دقيقة حتى يظهر التعكر.
بعد إزالة الشريط اللاصق ، ضع الجل في غرفة الرحلان الكهربائي وأضف المخزن المؤقت TAE لتغطية الجل. امزج خمسة ميكرولترات من صبغة تحميل هلام الحمض النووي ست مرات مع 25 ميكرولترا من كل تفاعل عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 10 مرات على الأقل. ثم قم بتحميل الخليط في الآبار عن طريق تجنب الفقاعات.
بعد إضافة أربعة ميكرولترات من سلم الحمض النووي لزوج كيلو قاعدة واحد في البئر الأول ، أغلق غطاء الغرفة وقم بتشغيل الجل لمدة 60 دقيقة عند 120 فولت و 400 مللي أمبير. تصور الجل تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية وتسجيل الصورة. ميز أجار ماكونكي المتبرعين الإيجابيين للاكتوز الذين أنتجوا مستعمرات وردية كبيرة من المتلقي و transconjugants ، والتي كانت سلبية اللاكتوز وأنتجت مستعمرات صفراء شاحبة أصغر.
كانت كفاءات الاقتران الخمسة لسلالة مانحة SSW4955 كلها ضمن نفس الترتيب من حيث الحجم ، مما يشير إلى أنه يمكن اكتشاف تعبئة البلازميد الاقتراني بغض النظر عن الاختيار المستخدم لتحديد هوية الاقتران المرافق. في حين أظهرت سلالة المتبرع SSW7037 كفاءة اقتران أقل بثلاث مرات ، مما يسمح بمقارنة كفاءات الاقتران لمختلف المتبرعين وأنواع البلازميد مع نفس المتلقين. أكد الرحلان الكهربائي الهلامي لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل وجود replicons المتوقعة في المرافقات.
يعتمد هذا الفحص تماما على العلامات القابلة للتحديد. يجب أن تكون الضوابط في مكانها الصحيح للتأكد من أن كل اختيار يعمل ويجب تأكيد الاقتران اللوني أو بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. يمكن تكييف البروتوكولات المعروضة هنا لدراسة الاقتران في الجسم الحي أو نماذج الأغشية الحيوية ، ولدراسة المتغيرات التي تعدل كفاءة الاقتران.
هذا البروتوكول للكشف عن البلازميدات القابلة للتعبئة على نطاق واسع سيضيف بشكل كبير إلى فهمنا لتدفق الجينات عبر البيئة ، ودراسة المتغيرات التي تؤثر على كفاءة الاقتران.
