Bakterier som E. coli bærer antibiotikaresistente gener i konjugative plasmider. Denne bakterie kan findes på hospitaler, der lever som kommensale hos dyr og i vandmiljøer. Naturlige konjugative plasmider horisontal overførsel af gener mellem forskellige bakterielinjer.
Vi præsenterer metaller til påvisning af konjugative plasmider og formationskonjugeringseffektivitet. Denne teknik er enkel og følsom. Det er følsomt, fordi det bruger markører for plasmidet, donoren og modtageren.
Disse markører kan vælges, hvilket betyder, at de kan identificere enkelthændelser i meget store populationer. De protokoller, vi præsenterer, er nyttige til at studere udviklingen af antibiotikaresistens og til epidemiologisk overvågning, det vil sige at overvåge strømmen af lægemiddelresistente gener. Caison Warner, en ph.d.-studerende fra mit laboratorium, og Pepper St.Clair, en bachelorstuderende fra CAMS-laboratoriet, vil demonstrere proceduren.
På dag ét skal du separat stribe donorerne og modtageren fra glycerollagre på medier C, som er MacConkey-agar uden antibiotika og inkubere natten over ved 37 grader Celsius. På dag to mærkes et 14 ml kulturrør for hver donor og modtager. Vælg en enkelt koloni af hver donor og modtager, og dyrk dem i to milliliter Mueller Hinton Broth ved 200 RPM i 18 timer ved 37 grader Celsius.
På dag tre måles den optiske tæthed af 10 gange saltvand fortyndet natten over dyrket kultur ved 600 nanometer uden hvirvelstrøm. Brug om nødvendigt steriliseret saltopløsning til at justere den optiske densitet til to. Mærk et 1,5 ml mikrocentrifugerør som et parringsrør, der angiver donor- og modtagerstammerne.
Overfør 500 mikroliter af den justerede suspension af hver donor og modtager i parringsrøret og bland forsigtigt suspensionen ved inversion. Centrifuger parringsrøret ved stuetemperatur i 10 minutter ved 500 G.Pipette 800 mikroliter supernatant ud af parringsrøret uden at forstyrre pelleten, så der efterlades 200 mikroliter i røret. Inkuber parringsrøret i 18 timer ved 37 grader Celsius.
Som en negativ kontrol skal du desuden stribe donorernes kultur natten over på medier B og modtagere på medier A og inkubere pladerne natten over ved 37 grader Celsius. Efter inkubation, på dag fire, tilsættes 800 mikroliter saltopløsning til parringsrøret og resuspenderes ved hvirvelstrøm. Der foretages serielle fortyndinger af parringssuspensionen, og der tilsættes 100 mikroliter af hver fortynding på medieplader.
Når pladerne er tørret, inkuberes de i 18 timer ved 37 grader Celsius, og bøjningsfrekvensen beregnes pr. donor eller pr. modtager som beskrevet i manuskriptet. Efter ekstraktion af DNA fra bakteriecellevæggene ved hjælp af en simpel kogeforberedelsesekstraktionsmetode mærkes et 1,5 milliliter rør som en pool i de krævede PCR-rør med navnet på genet og prøven. I røret mærket som pool tilsættes sterilt vand, PCR-masterblanding, primere og polymerase.
Bland forsigtigt ved pipettering op og ned mindst 10 gange i et afkølet miljø. Tilføj skabelon-DNA'et til det tilsvarende rør, og fastgør PCR-rørene med hætter. Placer PCR-rørene i termocyklisten og start programmet for resistensgener og replicons som beskrevet i manuskriptet.
Til amplicon bekræftelse fremstilles en 1% agarosegel ved at tilsætte agarose og TAE-buffer i en 250 ml kolbe og smelte agaroseen ved hjælp af en mikrobølgeovn. Når agaroseopløsningen er afkølet til ca. 55 grader Celsius, tilsættes seks mikroliter SYBR Green under en damphætte og blandes. Hæld gelen i en bakke forseglet med tape for at undgå spild og lad gelen sætte sig i 15 til 25 minutter, indtil der opstår turbiditet.
Når du har fjernet klæbebåndet, skal du placere gelen i elektroforesekammeret og tilføje TAE-buffer for at dække gelen. Bland fem mikroliter seks gange DNA-gelbelastende farvestof med 25 mikroliter af hver reaktion ved pipettering op og ned mindst 10 gange. Læg derefter blandingen i brønde ved at undgå bobler.
Efter tilsætning af fire mikroliter af et kilobasepar DNA-stige i den første brønd, luk kammerlåget og kør gelen i 60 minutter ved 120 volt og 400 milliampere. Visualiser gelen under UV-lys og optag billedet. MacConkey agar skelnede mellem de laktosepositive donorer, der producerede store lyserøde kolonier fra modtageren og transkonjuganter, som var laktosenegative og producerede mindre lysegule kolonier.
De fem konjugationseffektivitetsgevinster for en donorstamme SSW4955 var alle inden for samme størrelsesorden, hvilket indikerer, at mobiliseringen af konjugativt plasmid kan detekteres uanset den selektion, der anvendes til transkonjugantidentifikation. Mens donorstammen SSW7037 viste en konjugeringseffektivitet tre gange lavere, hvilket muliggør sammenligning af konjugeringseffektivitet for forskellige donorer og plasmidtyper med de samme modtagere. Gelelektroforese af PCR-produkter bekræftede tilstedeværelsen af forventede replicons i transkonjuganter.
Denne analyse afhænger helt af valgbare markører. Der skal være kontroller på plads for at bekræfte, at hvert valg fungerer, og transkonjuganter skal bekræftes kolorimetrisk eller ved PCR. De protokoller, der præsenteres her, kan tilpasses til undersøgelse af konjugation in vivo eller biofilmmodeller og til undersøgelse af variabler, der modulerer konjugationseffektivitet.
Denne protokol til påvisning af mobiliserbare plasmider i stor skala vil i høj grad øge vores forståelse af strømmen af gener på tværs af miljøet og til at studere de variabler, der påvirker effektiviteten af konjugering.