Name: ex vivo analysis of mechanically activated ca2+ transients in urothelial cells
Uploaded: 2022-09-28T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Analysis of Mechanically Activated Ca2+ Transients in Urothelial Cells at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse R01DK119183 (an G.A. und M.D.C.) und S10OD028596 (an G.A.) sowie durch die Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores des Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307) unterstützt.

Die Pflege und der Umgang mit den Tieren wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pittsburgh durchgeführt. Für die vorliegende Studie wurden weibliche, 2-4 Monate alte C57Bl/6J-Mäuse verwendet. Die Mäuse wurden kommerziell erworben (siehe Materialtabelle).
1. Montage und Einrichtung der Ausrüstung
<ol><li>Führen Sie eine Ca2+ -Bildgebung mit einem aufrechten Mikroskop durch, das mit ein...

<ol>
	<li>Kunau, R. T., Webb, H. L., Borman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+the+relationship+between+the+flow+rate+of+tubular+fluid+and+potassium+transport+in+the+distal+tubule+of+the+rat.">Characteristics of the relationship between the flow rate of tubular fluid and potassium transport in the distal tubule of the rat.</a> Journal of Clinical Investigation. 54 (6), 1488-1495 (1974).</li><li>Engbretson, B. G., Stoner, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+potassium+secretion+by+rabbit+cortical+collecting+tubule+in+vitro.">Flow-dependent potassium secretion by rabbit cortical collecting tubule in vitro.</a> American Journal of Physiology. 253 (5), 896-903 (1987).</li><li>Satlin, L. M., Sheng, S., Woda, C. B., Kleyman, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Na(+)+channels+are+regulated+by+flow.">Epithelial Na(+) channels are regulated by flow.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 280 (6), 1010-1018 (2001).</li><li>Woda, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+flow-stimulated+potassium+secretion+in+rabbit+cortical+collecting+duct:+functional+and+molecular+aspects.">Ontogeny of flow-stimulated potassium secretion in rabbit cortical collecting duct: functional and molecular aspects.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 285 (4), 629-639 (2003).</li><li>Malnic, G., Berliner, R. W., Giebisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+dependence+of+K++secretion+in+cortical+distal+tubules+of+the+rat.">Flow dependence of K+ secretion in cortical distal tubules of the rat.</a> American Journal of Physiology. 256 (5), 932-941 (1989).</li><li>Khuri, R. N., Strieder, W. N., Giebisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+flow+rate+and+potassium+intake+on+distal+tubular+potassium+transfer.">Effects of flow rate and potassium intake on distal tubular potassium transfer.</a> American Journal of Physiology. 228 (4), 1249-1261 (1975).</li><li>Good, D. W., Wright, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+influences+on+potassium+secretion:+sodium+concentration+and+fluid+flow+rate.">Luminal influences on potassium secretion: sodium concentration and fluid flow rate.</a> American Journal of Physiology. 236 (2), 192-205 (1979).</li><li>Wong, K. R., Berry, C. A., Cogan, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+dependence+of+chloride+transport+in+rat+S1+proximal+tubules.">Flow dependence of chloride transport in rat S1 proximal tubules.</a> American Journal of Physiology. 269 (6), 870-875 (1995).</li><li>Garvin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+absorption+by+isolated+perfused+rat+proximal+straight+tubules.">Glucose absorption by isolated perfused rat proximal straight tubules.</a> American Journal of Physiology. 259 (4), 580-586 (1990).</li><li>Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropuncture+study+of+renal+potassium+excretion+in+the+rat.">Micropuncture study of renal potassium excretion in the rat.</a> American Journal of Physiology. 206 (4), 674-686 (1964).</li><li>Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropuncture+study+of+distal+tubular+potassium+and+sodium+transport+in+rat+nephron.">Micropuncture study of distal tubular potassium and sodium transport in rat nephron.</a> American Journal of Physiology. 211 (3), 529-547 (1966).</li><li>Cabral, P. D., Garvin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+flow+regulates+NO+and+O2(-)+along+the+nephron.">Luminal flow regulates NO and O2(-) along the nephron.</a> American Journal of Physiology. 300 (5), 1047-1053 (2011).</li><li>Raghavan, V., Rbaibi, Y., Pastor-Soler, N. M., Carattino, M. D., Weisz, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress-dependent+regulation+of+apical+endocytosis+in+renal+proximal+tubule+cells+mediated+by+primary+cilia.">Shear stress-dependent regulation of apical endocytosis in renal proximal tubule cells mediated by primary cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8506-8511 (2014).</li><li>Lewis, S. A., de Moura, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+membrane+area+of+rabbit+urinary+bladder+increases+by+fusion+of+intracellular+vesicles:+an+electrophysiological+study.">Apical membrane area of rabbit urinary bladder increases by fusion of intracellular vesicles: an electrophysiological study.</a> The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 123-136 (1984).</li><li>Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+control+of+micturition.">The neural control of micturition.</a> Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).</li><li>Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+urothelium:+life+in+a+liquid+environment.">The urothelium: life in a liquid environment.</a> Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).</li><li>Khandelwal, P., Abraham, S. N., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+and+physiology+of+the+uroepithelium.">Cell biology and physiology of the uroepithelium.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 297 (6), 1477-1501 (2009).</li><li>Sachs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-activated+ion+channels:+what+are+they.">Stretch-activated ion channels: what are they.</a> Physiology. 25 (1), 50-56 (2010).</li><li>Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+ion+channels:+molecules+of+mechanotransduction.">Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction.</a> Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).</li><li>Ranade, S. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Na++channels+are+activated+by+laminar+shear+stress.">Epithelial Na+ channels are activated by laminar shear stress.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (6), 4120-4126 (2004).</li><li>Ross, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+in+mechanotransduction.">Integrins in mechanotransduction.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 613-618 (2013).</li><li>Dieterle, M. P., Husari, A., Rolauffs, B., Steinberg, T., Tomakidi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins,+cadherins+and+channels+in+cartilage+mechanotransduction:+perspectives+for+future+regeneration+strategies.">Integrins, cadherins and channels in cartilage mechanotransduction: perspectives for future regeneration strategies.</a> Expert Reviews in Molecular Medicine. 23, 14 (2021).</li><li>Huveneers, S., de Rooij, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+systems+at+the+cadherin-F-actin+interface.">Mechanosensitive systems at the cadherin-F-actin interface.</a> Journal of Cell Science. 126, 403-413 (2013).</li><li>Sun, Z., Guo, S. S., F&#228;ssler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+mechanotransduction.">Integrin-mediated mechanotransduction.</a> Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.+Pfl&#252;gers+Archiv.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pfl&#252;gers Archiv.</a> European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics.">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).</li><li>Sun, X. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+GCaMPs+for+improved+tracking+of+neuronal+activity.">Fast GCaMPs for improved tracking of neuronal activity.</a> Nature Communications. 4, 2170 (2013).</li><li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+for+PIEZO1+and+PIEZO2+in+urothelial+mechanotransduction+and+lower+urinary+tract+interoception.">Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception.</a> JCI Insight. 6 (19), 152984 (2021).</li><li>Durnin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+bladder+model+with+detrusor+smooth+muscle+removed+to+analyse+biologically+active+mediators+released+from+the+suburothelium.">An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium.</a> The Journal of Physiology. 597 (6), 1467-1485 (2019).</li><li>Delmas, P., Coste, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-gated+ion+channels+in+sensory+systems.">Mechano-gated ion channels in sensory systems.</a> Cell. 155 (2), 278-284 (2013).</li><li>Tavernarakis, N., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degenerins.+At+the+core+of+the+metazoan+mechanotransducer.">Degenerins. At the core of the metazoan mechanotransducer.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 940 (1), 28-41 (2001).</li><li>Peyronnet, R., Tran, D., Girault, T., Frachisse, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+channels:+feeling+tension+in+a+world+under+pressure.">Mechanosensitive channels: feeling tension in a world under pressure.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 558 (2014).</li><li>Blount, P., Iscla, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+with+bacterial+mechanosensitive+channels,+from+discovery+to+physiology+to+pharmacological+target.">Life with bacterial mechanosensitive channels, from discovery to physiology to pharmacological target.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 84 (1), 00055 (2020).</li><li>Booth, I. R., Miller, S., M&#252;ller, A., Lehtovirta-Morley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+bacterial+mechanosensitive+channels.">The evolution of bacterial mechanosensitive channels.</a> Cell Calcium. 57 (3), 140-150 (2015).</li></ol>

Alle Organismen und scheinbar die meisten Zelltypen exprimieren Ionenkanäle, die auf mechanische Reize reagieren 20,33,34,35,36,37. Die Funktion dieser mechanisch aktivierten Kanäle wurde überwiegend mit der Patch-Clamp-Technik untersucht. Aufgrund von Zugänglichkeitsproblemen waren Patch-Clamp-Studien von mechanisch akti...

Epithelzellen in den Harnwegen sind mechanischen Kräften ausgesetzt, wenn das Harnfiltrat durch die Nephrone wandert, und der Urin wird aus dem Nierenbecken gepumpt und wandert durch die Harnleiter, um in der Harnblase gespeichert zu werden. Es ist seit langem bekannt, dass mechanische Kräfte (z. B. Scherspannung und Dehnung), die von Flüssigkeiten auf die Epithelzellen ausgeübt werden, die die Harnwege auskleiden, die Rückresorption von Protein im proximalen Tubulus und von gelösten Stoffen im distalen Nephronregulieren 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13, sowie die Speicherung von Urin in der Harnblase und Miktion14,15,16,17.
Die Umwandlung mechanischer Reize in elektrische und biochemische Signale, ein Prozess, der als Mechanotransduktion bezeichnet wird, wird durch Proteine vermittelt, die auf die Verformung zellulärer Strukturen oder der zugehörigen extrazellulären Matrix 18,19,20,21 reagieren. Mechanisch aktivierte Ionenkanäle sind einzigartig in dem Sinne, dass sie als Reaktion auf Änderungen der Membranspannung, des Drucks oder der Scherspannung von einem geschlossenen Zustand in einen offenen permeablen Zustand übergehen 18,19,20,21,22. Darüber hinaus könnenCa2+-Transienten durch Integrin-vermittelte Mechanotransduktion oder durch Aktivierung mechanoresponsiver Adhäsionssysteme an den Zell-Zell-Verbindungen23,24,25,26 initiiert werden. Die Funktion des Ionenkanals wird üblicherweise mit der Patch-Clamp-Technik beurteilt, bei der eine Gigaohm-Dichtung zwischen der Zellmembran und der Patchpipette27 gebildet wird. Zellen, die sich in tiefen Gewebeschichten mit einer dichten extrazellulären Matrix (z. B. Nierentubuli) befinden oder von einer physikalischen Barriere (z. B. Glykokalyx) umgeben sind, sind jedoch mit einer Glasmikropipette schwer zugänglich. Ebenso können Zellen, die eingebettete oder integrale Bestandteile von Geweben mit schlechter mechanischer Stabilität sind (z. B. das Urothel), mit der Patch-Clamp-Technik nicht ohne weiteres untersucht werden. Da viele mechanisch aktivierte Ionenkanäle für Ca2+ durchlässig sind, besteht ein alternativer Ansatz darin, ihre Aktivität durch Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung einesCa2+-sensitiven Farbstoffs oder genetisch kodierter Calciumindikatoren (GECIs) wie GCaMP zu bewerten. Jüngste Anstrengungen im Bereich des Protein-Engineerings haben den Dynamikbereich, die Empfindlichkeit und die Reaktion von GECIs28,29,30 signifikant erhöht, und Fortschritte in der Genetik haben ihre Expression in bestimmten Zellpopulationen ermöglicht, was sie ideal für die Untersuchung der Mechanotransduktion geeignet macht.
Das Urothel, das geschichtete Epithel, das das Innere der Harnblase bedeckt, fungiert als Barriere, die die Diffusion von gelösten Stoffen im Urin in das Blaseninterstitium verhindert, fungiert aber auch als Schallkopf, der die Fülle der Blase wahrnimmt und diese Ereignisse an die darunter liegenden Nerven und die Muskulatur weiterleitet16. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Kommunikation zwischen dem Urothel und dem darunter liegenden Gewebe die mechanisch aktivierten Ionenkanäle Piezo1 und Piezo231 erfordert. Um mechanisch induzierte Ca2+-Transienten in Urothelzellen zu bewerten, wurde eine neue Technik entwickelt, die den adenoviralen Gentransfer nutzt, um denCa2+-Sensor GCaMP5G in Urothelzellen zu exprimieren. Diese Technik verwendet eine Schleimhautblattpräparation, die einen einfachen Zugang zur äußersten Schirmzellschicht ermöglicht, und ein computergestütztes System zur gleichzeitigen mechanischen Stimulation einzelner Zellen mit einer geschlossenen Glasmikropipette und zur Aufzeichnung von Fluoreszenzänderungen im Laufe der Zeit.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20x Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMPlanFL N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 G &#190;&#8221; catheter</td>
			<td>Medline&#160;</td>
			<td>Suresite IV slide&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPlanFL N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog/digital converter</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>Ab6556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam splitter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T495lpxr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bipolar temperature controller&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>21114-1L</td>
			<td>1 M solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 488&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter&#160;</td>
			<td>Chroma&#160;</td>
			<td>ET470/40X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries Corning 8250 glass</td>
			<td>Warner Instruments&#160;</td>
			<td>G85150T-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline heater&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>793590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Lambda XL&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manifold pump tubing</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-190-510</td>
			<td>ID 1.52 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manifold pump tubing</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-190-533</td>
			<td>ID 2.79 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice&#160;</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>664</td>
			<td>2-4 months old female C57BL/6J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige&#160;</td>
			<td>MF-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36964&#160;</td>
			<td>Slowfade Diamond Antifade with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pClamp software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Version 10.4</td>
			<td>Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Minipuls 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezoelectric actuator</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PAS005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette holder</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PP-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick exchange heated base with perfusion and adapter ring kit</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>QE-1</td>
			<td>Quick exchange platform fits 35 mm dish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine-phalloidin&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Plot</td>
			<td>Systat Software Inc</td>
			<td>Version 14.0</td>
			<td>Scientific graphing and data analysis software&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>Dow</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel open-loop piezo controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MDT694B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square grid holder pad</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>10520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>AD Surgical</td>
			<td>S-S618R13</td>
			<td>6-0 Sylk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon mounting rod</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Use to mount the piezoelectric actuator in the micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14171129</td>
			<td>Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Digital I/O device&#160;</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI USB-6501</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo analysis of mechanically activated ca2+ transients in urothelial cells

Mechanisch aktivierte Ionenkanäle sind biologische Wandler, die mechanische Reize wie Dehnungs- oder Scherkräfte in elektrische und biochemische Signale umwandeln. Bei Säugetieren sind mechanisch aktivierte Kanäle essentiell für die Erkennung äußerer und innerer Reize in so unterschiedlichen Prozessen wie Berührungsempfindung, Gehör, Regulierung des Volumens roter Blutkörperchen, Basalblutdruckregulierung und Suffizienzgefühl in der Harnblase. Während die Funktion von mechanisch aktivierten Ionenkanälen in der In-vitro-Umgebung mit der Patch-Clamp-Technik ausgiebig untersucht wurde, bleibt die Beurteilung ihrer Funktion in ihrer natürlichen Umgebung eine schwierige Aufgabe, oft aufgrund des begrenzten Zugangs zu den Expressionsstellen dieser Kanäle (z. B. afferente Terminals, Merkel-Zellen, Barorezeptoren und Nierentubuli) oder Schwierigkeiten bei der Anwendung der Patch-Clamp-Technik (z. B. die apikalen Oberflächen von Urothelschirmzellen). Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Bewertung mechanisch evozierter Ca 2+ Transienten unter Verwendung des Fluoreszenzsensors GCaMP5G in einer ex vivo urothelialen Präparation, einer Technik, die leicht für die Untersuchung von mechanisch evozierten Ca2+ -Ereignissen in anderen nativen Gewebepräparaten angepasst werden könnte.

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Technik zur Bewertung mechanisch evozierter Ca2+-Transienten in Regenschirmzellen unter Verwendung des fluoreszierendenCa2+-Sensors GCaMP5G. Die adenovirale Transduktion wurde verwendet, um GCaMP5G in Urothelzellen zu exprimieren, da sie eine hohe Effizienz aufweist und ein erhöhtes Expressionsniveau erzeugt. Fluoreszenzbilder von gefärbten Kryoschnitten aus einer transduzierten Blase sind in Abbildung 2D dargestellt. Für die...

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Ex Vivo Analysis of Mechanically Activated Ca2+ Transients in Urothelial Cells

Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Bewertung der Funktion von mechanisch aktivierten Ionenkanälen in nativen Urothelzellen unter Verwendung des fluoreszierendenCa2+ -Sensors GCaMP5G.

Ex Vivo Analyse von mechanisch aktivierten Ca2+ Transienten in Urothelzellen

Mechanically activated ion channels are biological transducers that convert mechanical stimuli such as stretch or shear forces into electrical and ...

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Untersuchung von mechanisch evozierten Calciumereignissen in einem ex vivo urothelialen Präparat. Die Technik ist relativ einfach auszuführen und könnte angepasst werden, um mechanisch evozierte Kalziumereignisse in anderen nativen Gewebepräparaten zu untersuchen. Stellen Sie die Mikropipetten her, indem Sie das Kapillarglas in den Abzieher einsetzen und mit den Kapillarhalteknöpfen einstellen.Ziehen Sie die Glaskapillare in zwei Schritten gemäß den Anweisungen des Herstellers. Schließen Sie die Spitze der Mikropipetten mit einer Mikroschmiede, wobei der Einstellknopf für die Heizung auf 60 eingestellt ist. Nachdem Sie die Blase und den Beckenknochen der eingeschläferten Maus freigelegt haben, knacken Sie den Beckenknochen, um die Harnröhre freizulegen, und kanülieren Sie die Harnröhre mit einem 24-Gauge-Katheter.Verwenden Sie eine 6-0-Naht, um den Katheter an der Harnröhre zu befestigen. Ernten Sie die Blase und die Harnröhre und befestigen Sie sie an einem Silikonkautschuk-Halterpad, das in der Aufzeichnungslösung gebadet ist. Trennen Sie die Blasenschleimhaut mit einer feinen Pinzette von der darunter liegenden Muskelschicht.Schneiden Sie die Blasenschleimhaut auf und fixieren Sie sie mit dem Urothel nach oben zu einem Silikonelastomereinsatz im Boden einer Gewebekulturschale mit einem Durchmesser von 35 Millimetern. Montieren Sie die Gewebekulturschale mit der festgesteckten Blasenschleimhaut im Mikroskoptisch, der mit einem Kulturschaleninkubator mit Widerstandsheizelementen ausgestattet ist. Perfundieren Sie die Zellkulturschale kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit von 1,7 Millilitern pro Minute mit einer Aufzeichnungslösung, die mit einer Inline-Heizung auf 37 Grad Celsius erwärmt wurde.Halten Sie die Temperatur des Inkubators und der Lösungen für Gewebeschalen mit einem bipolaren Zweikanal-Temperaturregler bei ca. 37 Grad Celsius. Um mechanisch induzierte Calciumionen-Transienten aufzuzeichnen, tauchen Sie die Mikropipette in die Aufzeichnungslösung. Bewegen Sie die Mikropipette bei Hellfeldbeleuchtung mit einem Scanobjektiv mit geringer Vergrößerung in die Mitte des Feldes.Bewegen Sie den Mikromanipulator in der vertikalen Ebene und stellen Sie den Fokus so ein, dass die Pipette in die Nähe der Oberfläche des Urothelgewebes bewegt wird. Wechseln Sie zum Objektiv mit höherer Vergrößerung und numerischer Apertur, das für die Immunfluoreszenz geeignet ist. Stellen Sie den Mikromanipulator auf fein ein und bewegen Sie die Pipette in die Nähe der Oberseite der Zielzelle.Passen Sie bei Bedarf den Fokus und die Position der Pipette an. Öffnen Sie das Stimulationsprotokoll in der Elektrophysiologie-Software und stellen Sie es auf Wiedergabe ein. Passen Sie den Fokus an und drücken Sie im Experiment-Manager auf Start, um die Datenerfassung zu starten.Dieser steuert den piezoelektrischen Aktor an und erzeugt eine Datei mit den Bildern des Experiments. Wenn die Zelle stimuliert wird, wird eine Zunahme der Fluoreszenz beobachtet. Um die Fluoreszenzintensität zu quantifizieren, öffnen Sie die Bilddatei in der Bildgebungssoftware und wählen Sie das Zähl- und Messfenster.Spielen Sie den Film ab, um die stimulierte Zelle zu identifizieren. Wählen Sie das Polygonwerkzeug aus, und zeichnen Sie einen ROI an den Rändern der Zelle, die gestochen wurde. Wechseln Sie zum Messfenster, wählen Sie das Intensitätsprofil aus, setzen Sie die Messung auf Überstunden, die Ergebnisse auf Durchschnitt, die Hintergrundsubtraktion auf Keine, und drücken Sie dann auf Ausführen.Die mittlere Fluoreszenzintensität wird über die Zeit berechnet. Um die Intensitätsprofildaten zu exportieren, klicken Sie auf das Excel-Symbol im Ergebnisfenster des Intensitätsprofils und führen Sie eine Datenanalyse mit wissenschaftlicher Grafik- und Datenanalysesoftware durch. In dieser Studie wurde die Regenschirmzelle gestochen, um mechanisch evozierte Kalzium-Transienten zu beurteilen.Das nach 10 Sekunden aufgenommene Bild zeigt eine fluoreszierende Ansicht der stimulierenden Pipette, die auf einer Regenschirmzelle positioniert ist und einen fluoreszierenden Kalziumsensor GCaMP5G exprimiert. Die mechanische Stimulation des Calciumsensors der Regenschirmzelle bewirkt eine Verformung, gefolgt von einem schnellen Anstieg der Fluoreszenzemission. Die Grafik zeigt eine Änderung der Fluoreszenzintensität, die als Funktion der Zeit für mehrere Zellen aufgetragen wird.Das Stochern ruft in den meisten Regenschirmzellen, die mit einem fluoreszierenden Kalziumsensor transduziert werden, eine Kalziumreaktion hervor. Der wichtigste Schritt ist die Entnahme der Blase und der Harnröhre, gefolgt von der Befestigung auf einem Silikonkautschuk-Halterpad. Vermeiden Sie Gewebeschäden, wenn Sie die Blasenschleimhaut von der darunter liegenden Muskelschicht trennen.Bildgebende Verfahren wie das hier beschriebene können einzigartige Einblicke in die Art und Weise geben, wie mechanoaktivierte Kanäle Veränderungen in ihrer natürlichen Umgebung senden und physiologische Reaktionen erzeugen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Analysis of Mechanically Activated Ca2+ Transients in Urothelial Cells

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

Ex vivo-Kultur der Patient Tissue &amp; Prüfung von Gentransfer

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Forschung

Medizin

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular Profiling von der invasiven Tumor-Microenvironment in einem 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells und<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Fibroblasten

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust Studieren

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

In vivo und ex vivo Ansätze für Eierstockkrebs Metastatische Colonization von Milky Punktstrukturen in Peritoneal Fettgewebe Studieren

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Depletion von Maus-Zellen aus menschlichem Tumorxenografte deutlich verbessert Downstream-Analyse von Zielzellen

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

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Vorbereitende Schritte für die Messung der Reaktivität in Maus retinalen Arteriolen Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

Ein kleines Tier Modell der Ex Vivo Normothermic Leber Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Ex-Vivo Expansion von hämatopoetischen Stammzellen aus menschlichen Nabelschnur Blut abgeleitet CD34+ Zellen mit Valproinsäure

Umbilical cord blood (UCB) units provide an alternative source of human hematopoietic stem cells (HSCs) for patients who require allogeneic bone marrow ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Murine Präzisionsgeschnittene Leberscheiben als Ex-Vivo-Modell der Leberbiologie

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...