Name: ex vivo analysis of mechanically activated ca2+ transients in urothelial cells
Uploaded: 2022-09-28T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Analysis of Mechanically Activated Ca2+ Transients in Urothelial Cells at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами NIH R01DK119183 (для G.A. и M.D.C.) и S10OD028596 (для G.A.), а также ядрами визуализации клеток и модельных организмов почек Питтсбургского центра исследований почек (P30DK079307).

Уход за животными и обращение с ними осуществлялись в соответствии с Комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Питтсбурга. Для настоящего исследования использовались самки мышей C57Bl/6J в возрасте 2-4 месяцев. Мыши были получены коммерчески (см. Таблицу материал?...

<ol>
	<li>Kunau, R. T., Webb, H. L., Borman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+the+relationship+between+the+flow+rate+of+tubular+fluid+and+potassium+transport+in+the+distal+tubule+of+the+rat.">Characteristics of the relationship between the flow rate of tubular fluid and potassium transport in the distal tubule of the rat.</a> Journal of Clinical Investigation. 54 (6), 1488-1495 (1974).</li><li>Engbretson, B. G., Stoner, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+potassium+secretion+by+rabbit+cortical+collecting+tubule+in+vitro.">Flow-dependent potassium secretion by rabbit cortical collecting tubule in vitro.</a> American Journal of Physiology. 253 (5), 896-903 (1987).</li><li>Satlin, L. M., Sheng, S., Woda, C. B., Kleyman, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Na(+)+channels+are+regulated+by+flow.">Epithelial Na(+) channels are regulated by flow.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 280 (6), 1010-1018 (2001).</li><li>Woda, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+flow-stimulated+potassium+secretion+in+rabbit+cortical+collecting+duct:+functional+and+molecular+aspects.">Ontogeny of flow-stimulated potassium secretion in rabbit cortical collecting duct: functional and molecular aspects.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 285 (4), 629-639 (2003).</li><li>Malnic, G., Berliner, R. W., Giebisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+dependence+of+K++secretion+in+cortical+distal+tubules+of+the+rat.">Flow dependence of K+ secretion in cortical distal tubules of the rat.</a> American Journal of Physiology. 256 (5), 932-941 (1989).</li><li>Khuri, R. N., Strieder, W. N., Giebisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+flow+rate+and+potassium+intake+on+distal+tubular+potassium+transfer.">Effects of flow rate and potassium intake on distal tubular potassium transfer.</a> American Journal of Physiology. 228 (4), 1249-1261 (1975).</li><li>Good, D. W., Wright, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+influences+on+potassium+secretion:+sodium+concentration+and+fluid+flow+rate.">Luminal influences on potassium secretion: sodium concentration and fluid flow rate.</a> American Journal of Physiology. 236 (2), 192-205 (1979).</li><li>Wong, K. R., Berry, C. A., Cogan, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+dependence+of+chloride+transport+in+rat+S1+proximal+tubules.">Flow dependence of chloride transport in rat S1 proximal tubules.</a> American Journal of Physiology. 269 (6), 870-875 (1995).</li><li>Garvin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+absorption+by+isolated+perfused+rat+proximal+straight+tubules.">Glucose absorption by isolated perfused rat proximal straight tubules.</a> American Journal of Physiology. 259 (4), 580-586 (1990).</li><li>Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropuncture+study+of+renal+potassium+excretion+in+the+rat.">Micropuncture study of renal potassium excretion in the rat.</a> American Journal of Physiology. 206 (4), 674-686 (1964).</li><li>Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropuncture+study+of+distal+tubular+potassium+and+sodium+transport+in+rat+nephron.">Micropuncture study of distal tubular potassium and sodium transport in rat nephron.</a> American Journal of Physiology. 211 (3), 529-547 (1966).</li><li>Cabral, P. D., Garvin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+flow+regulates+NO+and+O2(-)+along+the+nephron.">Luminal flow regulates NO and O2(-) along the nephron.</a> American Journal of Physiology. 300 (5), 1047-1053 (2011).</li><li>Raghavan, V., Rbaibi, Y., Pastor-Soler, N. M., Carattino, M. D., Weisz, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress-dependent+regulation+of+apical+endocytosis+in+renal+proximal+tubule+cells+mediated+by+primary+cilia.">Shear stress-dependent regulation of apical endocytosis in renal proximal tubule cells mediated by primary cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8506-8511 (2014).</li><li>Lewis, S. A., de Moura, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+membrane+area+of+rabbit+urinary+bladder+increases+by+fusion+of+intracellular+vesicles:+an+electrophysiological+study.">Apical membrane area of rabbit urinary bladder increases by fusion of intracellular vesicles: an electrophysiological study.</a> The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 123-136 (1984).</li><li>Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+control+of+micturition.">The neural control of micturition.</a> Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).</li><li>Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+urothelium:+life+in+a+liquid+environment.">The urothelium: life in a liquid environment.</a> Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).</li><li>Khandelwal, P., Abraham, S. N., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+and+physiology+of+the+uroepithelium.">Cell biology and physiology of the uroepithelium.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 297 (6), 1477-1501 (2009).</li><li>Sachs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-activated+ion+channels:+what+are+they.">Stretch-activated ion channels: what are they.</a> Physiology. 25 (1), 50-56 (2010).</li><li>Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+ion+channels:+molecules+of+mechanotransduction.">Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction.</a> Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).</li><li>Ranade, S. S., Syeda, R., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+activated+ion+channels.">Mechanically activated ion channels.</a> Neuron. 87 (6), 1162-1179 (2015).</li><li>Cox, C. D., Bavi, N., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+principles+of+ion-channel-mediated+mechanosensory+transduction.">Biophysical principles of ion-channel-mediated mechanosensory transduction.</a> Cell Reports. 29 (1), 1-12 (2019).</li><li>Carattino, M. D., Sheng, S., Kleyman, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Na++channels+are+activated+by+laminar+shear+stress.">Epithelial Na+ channels are activated by laminar shear stress.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (6), 4120-4126 (2004).</li><li>Ross, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+in+mechanotransduction.">Integrins in mechanotransduction.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 613-618 (2013).</li><li>Dieterle, M. P., Husari, A., Rolauffs, B., Steinberg, T., Tomakidi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins,+cadherins+and+channels+in+cartilage+mechanotransduction:+perspectives+for+future+regeneration+strategies.">Integrins, cadherins and channels in cartilage mechanotransduction: perspectives for future regeneration strategies.</a> Expert Reviews in Molecular Medicine. 23, 14 (2021).</li><li>Huveneers, S., de Rooij, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+systems+at+the+cadherin-F-actin+interface.">Mechanosensitive systems at the cadherin-F-actin interface.</a> Journal of Cell Science. 126, 403-413 (2013).</li><li>Sun, Z., Guo, S. S., F&#228;ssler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+mechanotransduction.">Integrin-mediated mechanotransduction.</a> Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.+Pfl&#252;gers+Archiv.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pfl&#252;gers Archiv.</a> European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics.">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).</li><li>Sun, X. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+GCaMPs+for+improved+tracking+of+neuronal+activity.">Fast GCaMPs for improved tracking of neuronal activity.</a> Nature Communications. 4, 2170 (2013).</li><li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+for+PIEZO1+and+PIEZO2+in+urothelial+mechanotransduction+and+lower+urinary+tract+interoception.">Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception.</a> JCI Insight. 6 (19), 152984 (2021).</li><li>Durnin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+bladder+model+with+detrusor+smooth+muscle+removed+to+analyse+biologically+active+mediators+released+from+the+suburothelium.">An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium.</a> The Journal of Physiology. 597 (6), 1467-1485 (2019).</li><li>Delmas, P., Coste, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-gated+ion+channels+in+sensory+systems.">Mechano-gated ion channels in sensory systems.</a> Cell. 155 (2), 278-284 (2013).</li><li>Tavernarakis, N., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degenerins.+At+the+core+of+the+metazoan+mechanotransducer.">Degenerins. At the core of the metazoan mechanotransducer.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 940 (1), 28-41 (2001).</li><li>Peyronnet, R., Tran, D., Girault, T., Frachisse, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+channels:+feeling+tension+in+a+world+under+pressure.">Mechanosensitive channels: feeling tension in a world under pressure.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 558 (2014).</li><li>Blount, P., Iscla, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+with+bacterial+mechanosensitive+channels,+from+discovery+to+physiology+to+pharmacological+target.">Life with bacterial mechanosensitive channels, from discovery to physiology to pharmacological target.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 84 (1), 00055 (2020).</li><li>Booth, I. R., Miller, S., M&#252;ller, A., Lehtovirta-Morley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+bacterial+mechanosensitive+channels.">The evolution of bacterial mechanosensitive channels.</a> Cell Calcium. 57 (3), 140-150 (2015).</li></ol>

Все организмы и, по-видимому, большинство типов клеток экспрессируют ионные каналы, которые реагируют на механические раздражители 20,33,34,35,36,37. Функция этих механически активиров...

Эпителиальные клетки в мочевыводящих путях подвергаются механическим воздействиям, когда фильтрат мочи проходит через нефроны, а моча откачивается из почечной лоханки и проходит через мочеточники для хранения в мочевом пузыре. Давно признано, что механические силы (например, напряжение сдвига и растяжение), действующие жидкостями на эпителиальные клетки, выстилающие мочевыводящие пути, регулируют реабсорбцию белка в проксимальных канальцах и растворенных веществ в дистальном отделе нефрона 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13, а также накопление мочи в мочевом пузыре и мочеиспускании14,15,16,17.
Преобразование механических стимулов в электрические и биохимические сигналы, процесс, называемый механотрансдукцией, опосредуется белками, которые реагируют на деформацию клеточных структур или связанного с ними внеклеточного матрикса 18,19,20,21. Механически активированные ионные каналы уникальны в том смысле, что они переходят из замкнутого состояния в открытое проницаемое состояние в ответ на изменения натяжения мембраны, давления или напряжения сдвига 18,19,20,21,22. Кроме того, переходные процессы Ca2+ могут быть инициированы интегрин-опосредованной механотрансдукцией или активацией механочувствительных адгезионных систем на межклеточных соединениях23,24,25,26. Функцию ионного канала обычно оценивают с помощью метода пластыря-зажима, который включает образование гигаомного уплотнения между клеточной мембраной и пластырем-пипеткой27. Однако клетки, расположенные в глубоких тканевых слоях с плотным внеклеточным матриксом (например, почечные канальцы) или окруженные физическим барьером (например, гликокаликсом), труднодоступны с помощью стеклянной микропипетки. Аналогичным образом, клетки, встроенные или являющиеся неотъемлемыми частями тканей с плохой механической стабильностью (например, уротелий), не могут быть легко изучены с помощью метода пластыря. Поскольку многие механически активированные ионные каналы проницаемы для Ca 2+, альтернативным подходом является оценка их активности с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием Ca2+-чувствительного красителя или генетически кодируемых кальциевых индикаторов (GECI), таких как GCaMP. Недавние усилия в области белковой инженерии значительно увеличили динамический диапазон, чувствительность и реакцию GECI28,29,30, а достижения в области генетики позволили их экспрессию в определенных клеточных популяциях, что сделало их идеально подходящими для изучения механотрансдукции.
Уротелий, многослойный эпителий, покрывающий внутреннюю часть мочевого пузыря, функционирует как барьер, предотвращая диффузию растворенных веществ в моче в интерстиций мочевого пузыря, но также функционирует как преобразователь, определяя наполненность мочевого пузыря и сообщая об этих событиях нижележащим нервам и мускулатуре16. Предыдущие исследования показали, что для связи между уротелием и подлежащими тканями требуются механически активированные ионные каналы Piezo1 и Piezo231. Для оценки механически индуцированных переходных процессов Ca 2+ в уротелиальных клетках была разработана новая описанная методика, которая использует перенос генов аденовируса для экспрессии датчика Ca2+ GCaMP5G в уротелиальных клетках. В этом методе используется подготовка листа слизистой оболочки, которая обеспечивает легкий доступ к самому внешнему зонтичному клеточному слою, и компьютерная система для одновременной механической стимуляции отдельных клеток с помощью закрытой стеклянной микропипетки и регистрации изменений флуоресценции с течением времени.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20x Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMPlanFL N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 G &#190;&#8221; catheter</td>
			<td>Medline&#160;</td>
			<td>Suresite IV slide&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPlanFL N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog/digital converter</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>Ab6556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam splitter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T495lpxr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bipolar temperature controller&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>21114-1L</td>
			<td>1 M solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 488&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter&#160;</td>
			<td>Chroma&#160;</td>
			<td>ET470/40X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries Corning 8250 glass</td>
			<td>Warner Instruments&#160;</td>
			<td>G85150T-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline heater&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>793590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Lambda XL&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manifold pump tubing</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-190-510</td>
			<td>ID 1.52 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manifold pump tubing</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-190-533</td>
			<td>ID 2.79 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice&#160;</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>664</td>
			<td>2-4 months old female C57BL/6J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige&#160;</td>
			<td>MF-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36964&#160;</td>
			<td>Slowfade Diamond Antifade with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pClamp software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Version 10.4</td>
			<td>Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Minipuls 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezoelectric actuator</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PAS005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette holder</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PP-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick exchange heated base with perfusion and adapter ring kit</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>QE-1</td>
			<td>Quick exchange platform fits 35 mm dish&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine-phalloidin&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Plot</td>
			<td>Systat Software Inc</td>
			<td>Version 14.0</td>
			<td>Scientific graphing and data analysis software&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>Dow</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel open-loop piezo controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MDT694B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square grid holder pad</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>10520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>AD Surgical</td>
			<td>S-S618R13</td>
			<td>6-0 Sylk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon mounting rod</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Use to mount the piezoelectric actuator in the micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14171129</td>
			<td>Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Digital I/O device&#160;</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI USB-6501</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo analysis of mechanically activated ca2+ transients in urothelial cells

Механически активируемые ионные каналы являются биологическими преобразователями, которые преобразуют механические стимулы, такие как силы растяжения или сдвига, в электрические и биохимические сигналы. У млекопитающих механически активированные каналы необходимы для обнаружения внешних и внутренних раздражителей в таких разнообразных процессах, как ощущение осязания, слух, регуляция объема эритроцитов, регуляция базального артериального давления и ощущение наполненности мочевого пузыря. В то время как функция механически активированных ионных каналов была широко изучена в условиях in vitro с использованием метода патч-зажима, оценка их функции в их естественной среде остается сложной задачей, часто из-за ограниченного доступа к сайтам экспрессии этих каналов (например, афферентным терминалям, клеткам Меркеля, барорецепторам и почечным канальцам) или трудностей с применением метода патч-зажима (например, апикальные поверхности уротелиальных зонтичных клеток). В этом протоколе описывается процедура оценки механически вызванных переходных процессов Ca 2+ с использованием флуоресцентного датчика GCaMP5G в уротелиальном препарате ex vivo, метод, который может быть легко адаптирован для изучения механически вызванных событий Ca2+ в других препаратах нативной ткани.

Настоящий протокол описывает метод оценки механически вызванных переходных процессов Ca 2+ в зонтичных клетках с использованием флуоресцентного датчика Ca2+ GCaMP5G. Аденовирусная трансдукция использовалась для экспрессии GCaMP5G в уротелиальных клетках из-за ее высокой эффективн...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Analysis of Mechanically Activated Ca2+ Transients in Urothelial Cells at JoVE.com

Ex Vivo Analysis of Mechanically Activated Ca2+ Transients in Urothelial Cells

Этот протокол описывает методологию оценки функции механически активированных ионных каналов в нативных уротелиальных клетках с использованием флуоресцентного датчика Ca2+ GCaMP5G.

Ex Vivo Анализ механически активированных переходных процессовCa 2+ в уротелиальных клетках

Mechanically activated ion channels are biological transducers that convert mechanical stimuli such as stretch or shear forces into electrical and ...

Этот протокол описывает метод изучения механически вызванного кальциевого события в уротелиальном препарате ex vivo. Этот метод относительно прост в исполнении, и он может быть адаптирован для изучения механически вызванного кальциевого события в других нативных тканевых препаратах. Изготовьте микропипетки, поместив капиллярное стекло в съемник и отрегулировав его с помощью капиллярно-удерживающих ручек.Вытяните стеклянный капилляр в два этапа в соответствии с инструкциями производителя. Закройте наконечник микропипетки с помощью микрокузницы с ручкой регулировки нагревателя, установленной на 60. Обнажив мочевой пузырь и тазовую кость усыпленной мыши, расколите тазовую кость, чтобы обнажить мочеиспускательный канал, и канюзируйте уретру с помощью катетера 24-го калибра.Используйте шов 6-0, чтобы закрепить катетер на мочеиспускательном канале. Соберите мочевой пузырь и уретру и прикрепите их к прокладке-держателю из силиконовой резины, залитой записывающим раствором. Отделите слизистую оболочку мочевого пузыря от нижележащего мышечного слоя тонкими щипцами.Разрежьте слизистую оболочку мочевого пузыря и прикрепите ее уротелием вверх к вставке из силиконового эластомера на дно чашки для культивирования тканей диаметром 35 миллиметров. Установите чашку для культивирования тканей с закрепленной слизистой оболочкой мочевого пузыря в столике микроскопа, оснащенном инкубатором для культивирования с резистивными нагревательными элементами. Непрерывно перфузируйте чашку для клеточных культур со скоростью 1,7 миллилитра в минуту записывающим раствором, нагретым до 37 градусов Цельсия с помощью встроенного нагревателя.Поддерживайте температуру инкубатора и растворов для тканевых блюд примерно на уровне 37 градусов Цельсия с помощью двухканального биполярного регулятора температуры. Для регистрации механически индуцированных переходных процессов ионов кальция погрузите микропипетку в записывающий раствор. При ярком освещении, используя сканирующий объектив с малым увеличением, переместите микропипетку в центр поля.Переместите микроманипулятор в вертикальной плоскости и отрегулируйте фокус, чтобы переместить пипетку у поверхности уротелиальной ткани. Переключитесь на объектив с большим увеличением и числовой апертурой, подходящий для иммунофлуоресценции. Установите микроманипулятор в тонкое положение и переместите пипетку в верхнюю часть клетки-мишени.При необходимости отрегулируйте фокус и положение пипетки. Откройте протокол стимуляции в программе электрофизиологии и настройте его на воспроизведение. Отрегулируйте фокус и нажмите кнопку «Пуск» в диспетчере экспериментов, чтобы начать сбор данных.Это приводит в действие пьезоэлектрический привод и генерирует файл с изображениями эксперимента. При стимуляции клетки наблюдается усиление флуоресценции. Чтобы количественно оценить интенсивность флуоресценции, откройте файл изображения в программном обеспечении для обработки изображений и выберите окно подсчета и измерения.Воспроизведите фильм, чтобы идентифицировать стимулированную клетку. Выберите инструмент «Многоугольник» и нарисуйте ROI на границах ячейки, в которую было вставлено. Перейдите в окно измерения, выберите профиль интенсивности, установите для измерения значение сверхурочное, результаты — на среднее, фоновое вычитание — на нет, а затем нажмите «Выполнить».Средняя интенсивность флуоресценции будет вычисляться с течением времени. Чтобы экспортировать данные профиля интенсивности, щелкните значок Excel в окне результатов профиля интенсивности и выполните анализ данных с помощью научного графика и программного обеспечения для анализа данных. В этом исследовании зонтичная клетка была ткнута для оценки механически вызванных переходных процессов кальция.Изображение, полученное за 10 секунд, показывает флуоресцентный вид стимулирующей пипетки, расположенной поверх зонтичной клетки, экспрессирующей флуоресцентный датчик кальция GCaMP5G. Механическая стимуляция зонтичной клетки, экспрессирующей кальций, вызывает деформацию с последующим быстрым увеличением излучения флуоресценции. График демонстрирует изменение интенсивности флуоресценции, построенное в зависимости от времени для нескольких клеток.Тыкание вызывает кальциевую реакцию в большинстве зонтичных клеток, трансдуцируемых флуоресцентным кальциевым датчиком. Наиболее важным этапом является сбор мочевого пузыря и мочеиспускательного канала с последующим прикреплением их к прокладке держателя из силиконовой резины. Избегайте повреждения тканей при отделении слизистой оболочки мочевого пузыря от нижележащего мышечного слоя.Методы визуализации, подобные описанному здесь, могут дать уникальное представление о том, как механоактивируемые каналы посылают изменения в их родной среде и генерируют физиологические реакции.

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Analysis of Mechanically Activated Ca2+ Transients in Urothelial Cells

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

Экс Vivo культуры тканей пациента и изучение генов доставки

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Молекулярная профилирования из инвазивным опухоли микроокружения в 3-мерной модели клеток колоректального рака и<em&gt; Экс естественных</em&gt; Фибробласты

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

<em&gt; Экс естественных</em&gt; Модель для изучения действия гормонов в груди человека

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

В Vivo и экс Vivo подходы к изучению рака яичников метастатического колонизации Млечного Местная структур в брюшной жировой

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Изучение рака поджелудочной железы стволовых клеток Характеристики для разработки новых стратегий лечения

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Истощение мышиных клеток из ксенотрансплантатов опухолей человека значительно улучшает Downstream Анализ клеток-мишеней

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Шаги подготовки для измерения реактивности в мыши артериол сетчатки Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

Мелких животных модель Ex Vivo нормотермических печени перфузии

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Ex Vivo расширение гемопоэтических стволовых клеток из человеческой пуповинной крови производные CD34+ клеток с помощью вальпроевая кислота

Umbilical cord blood (UCB) units provide an alternative source of human hematopoietic stem cells (HSCs) for patients who require allogeneic bone marrow ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Murine Точность Cut печени фрагменты, как Ex Vivo Модель печени биологии

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...