Name: pulldown assay coupled with co-expression in bacteria cells as a time-efficient tool for testing challenging protein-protein interactions
Uploaded: 2022-12-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل مشاريع مؤسسة العلوم الروسية 19-74-30026 (تطوير الطريقة والتحقق من صحتها) و 19-74-10099 (مقايسات التفاعل بين البروتين والبروتين) ؛ ومن قبل وزارة العلوم والتعليم العالي في الاتحاد الروسي - منحة 075-15-2019-1661 (تحليل تفاعلات البروتين والبروتين التمثيلية).

يظهر التمثيل التخطيطي لسير عمل الطريقة في الشكل 1.
1. التحول المشترك للإشريكية القولونية
<ol><li>تحضير متجهات التعبير للبروتينات المستهدفة باستخدام طرق الاستنساخ القياسية. ملاحظة: عادة ما تكون نقطة البداية الجيدة هي استخدام نواقل pGEX / pMAL التقلي...

<ol>
	<li>Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions:+Pulldown+assays.">Protein-protein interactions: Pulldown assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).</li><li>Rose, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+dimerization,+coactivator+recognition+and+MODY3+mutations+in+HNF-1alpha.">Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).</li><li>Bonchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+diversity+and+homodimerization+specificity+of+zinc-finger-associated+domains+in+Drosophila.">Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila.</a> Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).</li><li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors.">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112 (2), 193-205 (2003).</li><li>Badonyi, M., Marsh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+protein+complex+interfaces+have+evolved+to+promote+co-translational+assembly.">Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly.</a> Elife. 11, 79602 (2022).</li><li>Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cotranslational+maturation+of+newly+synthesized+proteins.">Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins.</a> Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).</li><li>Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cotranslational+protein+maturation+in+bacteria.">Mechanisms of cotranslational protein maturation in bacteria.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 689755 (2021).</li><li>Shiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+assembly+of+protein+complexes+in+eukaryotes+revealed+by+ribosome+profiling.">Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling.</a> Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).</li><li>Shieh, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operon+structure+and+co-translational+subunit+association+direct+protein+assembly+in+bacteria.">Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria.</a> Science. 350 (6261), 678-680 (2015).</li><li>Bertolini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+nascent+proteins+translated+by+adjacent+ribosomes+drive+homomer+assembly.">Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly.</a> Science. 371 (6524), 57-64 (2021).</li><li>Bonchuk, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+highly+similar+spatial+organization+of+zinc-finger+associated+domains+with+a+very+low+sequence+similarity.">Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity.</a> Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).</li><li>Justin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+oncogenic+histone+H3K27M+inhibition+of+human+polycomb+repressive+complex+2.">Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2.</a> Nature Communications. 7, 11316 (2016).</li><li>Lariviere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+mediator+head+module.">Structure of the mediator head module.</a> Nature. 492 (7429), 448-451 (2012).</li><li>Taylor, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+T4+baseplate+and+its+function+in+triggering+sheath+contraction.">Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction.</a> Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).</li><li>Samara, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+assembly+and+function+of+the+SAGA+deubiquitinating+module.">Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module.</a> Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).</li><li>Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+assembly+and+activation+of+the+heterotetrameric+SAGA+histone+H2B+deubiquitinase+module.">Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module.</a> Cell. 141 (4), 606-617 (2010).</li><li>Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+ferritin:+modulation+of+subunit+stoichiometry+in+bacterial+expression+systems.">Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems.</a> Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).</li><li>Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+replication+of+plasmid+p15A+and+comparative+studies+on+the+nucleotide+sequences+around+the+origin+of+related+plasmids.">The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids.</a> Cell. 32 (1), 119-129 (1983).</li><li>Nijkamp, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+nucleotide+sequence+of+the+bacteriocinogenic+plasmid+CloDF13.">The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13.</a> Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).</li><li>Som, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+replication+of+Escherichia+coli+plasmid+RSF+1030.">Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030.</a> Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).</li><li>Tsao, K. L., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+production+of+two+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli+by+manipulating+plasmid+copy+number:+high-level+expression+of+heterodimeric+Ras+farnesyltransferase.">Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase.</a> Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).</li><li>Nallamsetty, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubility-enhancing+proteins+MBP+and+NusA+play+a+passive+role+in+the+folding+of+their+fusion+partners.">Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners.</a> Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).</li><li>Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+two-hybrid+assay+to+identify+interacting+proteins.">Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70 (2019).</li><li>Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+two-hybrid+(F2H)+assay+for+direct+analysis+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).</li><li>Fiebitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mammalian+two-hybrid+screening+for+protein-protein+interactions+using+transfected+cell+arrays.">High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays.</a> BMC Genomics. 9, 68 (2008).</li><li>Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+and+Sgfl1+proteins+form+alternative+complexes+with+ENY2+proteins.">CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins.</a> Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).</li><li>Maksimenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+new+insulator+proteins,+Pita+and+ZIPIC,+target+CP190+to+chromatin.">Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin.</a> Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).</li><li>Sabirov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+functional+role+of+the+interaction+between+CP190+and+the+architectural+protein+Pita+in+Drosophila+melanogaster.">Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster.</a> Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16 (2021).</li><li>Dong, S., Provart, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyses+of+protein+interaction+networks+using+computational+tools.">Analyses of protein interaction networks using computational tools.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).</li></ol>

تسمح الطريقة الموصوفة باختبار تفاعلات البروتين والبروتين التي لا يمكن تجميعها بكفاءة في المختبر وتتطلب تعبيرا مشتركا. هذه الطريقة هي واحدة من الطرق القليلة المناسبة لدراسة البروتينات غير المتجانسة ، والتي هي أيضا قادرة على homodimerization لأنه ، عند تنقيتها بشكل منفصل ، تشكل هذه البروتين?...

يستخدم السحب التقليدي على نطاق واسع لدراسة تفاعلات البروتينوالبروتين 1. ومع ذلك ، غالبا ما لا تتفاعل البروتينات النقية بشكل فعال في المختبر2,3 ، وبعضها غير قابل للذوبان بدون شريكهاالملزم 4,5. قد تتطلب هذه البروتينات تجميعا متعديا مشتركا أو وجود مرافقين جزيئيين5،6،7،8،9. هناك قيد آخر للسحب التقليدي وهو اختبار نشاط التعدد غير المتجانس المحتمل بين المجالات التي يمكن أن توجد كمتجانسات متجانسة مستقرة مجمعة بشكل مشترك8،10 ، حيث لا يمكن للعديد منها الانفصال وإعادة الارتباط في المختبر خلال وقت الحضانة. وجد أن التعبير المشترك مفيد في التغلب على مثل هذه المشاكل 3,11. تم استخدام التعبير المشترك باستخدام النواقل المتوافقة في البكتيريا بنجاح لتنقية المجمعات الجزيئية الكبيرة متعددة الوحدات الفرعية ، بما في ذلك المركب القمعي متعدد المشبك PRC2 12 ، وحدة رأس وسيط RNA polymeraseII 13 ، صفيحة الأساس للبكتيريا T414 ، وحدة deubiquitinylase المعقدة SAGA15،16 ، والفيريتين17. أصول النسخ المتماثل المستخدمة بشكل شائع للتعبير المشترك هي ColE1 و p15A18 و CloDF1319 و RSF20. في نظام التعبير Duet المتاح تجاريا ، يتم دمج هذه الأصول مع جينات مقاومة مختلفة للمضادات الحيوية ومواقع استنساخ متعددة ملائمة لإنتاج ناقلات polycistronic ، مما يسمح بالتعبير عن ما يصل إلى ثمانية بروتينات. هذه الأصول لها أرقام نسخ مختلفة ويمكن استخدامها في مجموعات مختلفة لتحقيق مستويات تعبير متوازنة للبروتينات المستهدفة21. لاختبار تفاعلات البروتين والبروتين ، يتم استخدام علامات تقارب مختلفة ؛ الأكثر شيوعا هي 6xHistidine و glutathione-S-transferase (GST) وبروتين ربط المالتوز (MBP) ، ولكل منها تقارب محدد مع الراتنج المقابل. تعمل GST و MBP أيضا على تعزيز قابلية ذوبان واستقرار البروتينات الموسومة22.
كما تم تطوير عدد من الطرق التي تنطوي على التعبير المشترك للبروتين في الخلايا حقيقية النواة ، وأبرزها مقايسة الخميرة ثنائية الهجين (Y2H) 23. اختبار Y2H رخيص وسهل ويسمح باختبار تفاعلات متعددة ؛ ومع ذلك ، يستغرق سير العمل أكثر من 1 أسبوع لإكماله. هناك أيضا عدد قليل من المقايسات القائمة على خلايا الثدييات الأقل استخداما ، على سبيل المثال ، مقايسة الفلورسنت ثنائية الهجين (F2H) 24 ومقايسة تفاعل البروتين والبروتين في مجموعة الخلايا (CAPPIA) 25. اختبار F2H سريع نسبيا ، مما يسمح بمراقبة تفاعلات البروتين في بيئتها الخلوية الأصلية ، ولكنه يتضمن استخدام معدات تصوير باهظة الثمن. كل هذه الطرق لها ميزة على التعبير بدائية النواة التي توفر الترجمة حقيقية النواة الأصلية وبيئة قابلة للطي. ومع ذلك ، فإنها تكتشف التفاعل بشكل غير مباشر ، إما عن طريق التنشيط النسخي أو عن طريق نقل الطاقة الفلورية ، والتي غالبا ما تنتج القطع الأثرية. أيضا ، قد تحتوي الخلايا حقيقية النواة على شركاء تفاعل آخرين للبروتينات ذات الأهمية ، والتي يمكن أن تتداخل مع اختبار التفاعلات الثنائية بين بروتينات حقيقيات النوى العليا.
تصف الدراسة الحالية طريقة للتعبير المشترك البكتيري للبروتينات الموسومة بشكل تفاضلي تليها تقنيات السحب التقليدية. تسمح هذه الطريقة بدراسة التفاعلات بين البروتينات المستهدفة التي تتطلب التعبير المشترك. إنه أكثر كفاءة من حيث الوقت مقارنة بالسحب التقليدي ، مما يسمح باختبار الدفعات لأهداف متعددة ، مما يجعله مفيدا في معظم الحالات. يعد التعبير المشترك باستخدام المتجهات المتوافقة أكثر ملاءمة من التعبير المشترك متعدد السيسترونيك لأنه لا يتطلب خطوة استنساخ شاقة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-ELEMENT probe</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>630-0586</td>
			<td>The high throughput 8-element sonicator probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose resin</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8021</td>
			<td>Resin for purification of MBP-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)&#160;</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69450-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R (Z605212)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A9782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione agarose</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>16100</td>
			<td>Resin for purification of GST-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni-NTA Superflow Agarose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25214</td>
			<td>Resin for purification of 6xHis-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>414753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pACYCDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71147</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCDFDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71340</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail VII</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539138</td>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSFDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71341</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VC505 sonicator</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>CV334</td>
			<td>Ultrasonic liquid processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A6285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pulldown assay coupled with co-expression in bacteria cells as a time-efficient tool for testing challenging protein-protein interactions

Pulldown هو اختبار تفاعل البروتين والبروتين سهل الاستخدام ويستخدم على نطاق واسع. ومع ذلك ، فإن لها قيودا في دراسة مجمعات البروتين التي لا تتجمع بشكل فعال في المختبر. قد تتطلب هذه المجمعات تجميعا متعديا مشتركا ووجود مرافقين جزيئيين ؛ إما أنها تشكل أوليغومرات مستقرة لا يمكنها الانفصال وإعادة الارتباط في المختبر أو تكون غير مستقرة بدون شريك ملزم. للتغلب على هذه المشاكل ، من الممكن استخدام طريقة تعتمد على التعبير المشترك البكتيري للبروتينات الموسومة بشكل تفاضلي باستخدام مجموعة من النواقل المتوافقة متبوعة بتقنيات السحب التقليدية. يعد سير العمل أكثر كفاءة من حيث الوقت مقارنة بالقائمة المنسدلة التقليدية لأنه يفتقر إلى الخطوات التي تستغرق وقتا طويلا للتنقية المنفصلة للبروتينات المتفاعلة وحضانتها التالية. ميزة أخرى هي قابلية استنساخ أعلى بسبب عدد أقل بكثير من الخطوات وفترة زمنية أقصر تتعرض فيها البروتينات الموجودة في البيئة في المختبر للتحلل البروتيني والأكسدة. تم تطبيق الطريقة بنجاح لدراسة عدد من تفاعلات البروتين والبروتين عندما وجد أن التقنيات الأخرى في المختبر غير مناسبة. يمكن استخدام هذه الطريقة لاختبار تفاعلات البروتين والبروتين على دفعات. تظهر النتائج التمثيلية لدراسات التفاعلات بين مجال BTB والبروتينات المضطربة جوهريا ، و heterodimers من المجالات المرتبطة بإصبع الزنك.

تم استخدام الطريقة الموصوفة بشكل روتيني مع العديد من الأهداف المختلفة. تظهر هنا بعض النتائج التمثيلية التي من المحتمل ألا يمكن الحصول عليها باستخدام تقنيات السحب التقليدية. الأول هو دراسة DIMERIZATION محددة ZAD (المجال المرتبط بإصبع الزنك)11. تشكل ZADs ثنائيات مستقرة ومحددة ، مع إمكاني...

Watch this Scientific Journal Video about Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions at JoVE.com

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

هنا ، نصف طريقة للتعبير البكتيري المشترك للبروتينات الموسومة تفاضليا باستخدام مجموعة من النواقل المتوافقة ، تليها تقنيات السحب التقليدية لدراسة مجمعات البروتين التي لا يمكن أن تتجمع في المختبر.

مقايسة السحب إلى جانب التعبير المشترك في خلايا البكتيريا كأداة فعالة من حيث الوقت لاختبار التفاعلات الصعبة بين البروتين والبروتين

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

تسمح هذه الطريقة بدراسة تكوينات مجمعات البروتين التي تتطلب تعبيرا مشتركا لعينات اختبار فعالة ، مثل تكوين heterodimers. تتمثل الإمكانات النهائية الرئيسية لهذه الطريقة في استغلال التعبير المشترك للبروتينات المدروسة ذات العلامات التفاضلية باستخدام مجموعات من النواقل المتوافقة لتعزيز التجميع المعقد الفعال ، إلى جانب سير العمل الفعال من حيث الوقت وقابلية التوسع مما يسمح باختبار التصحيح السريع للتفاعلات المتعددة. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة للفحص السريع للتعبير الأمثل للبروتين وظروف التنقية.يساعد العرض المرئي على تنفيذ الخطوات المهمة للبروتوكول بشكل صحيح مثل إعداد التعبير المشترك وتعطيل الخلية وخطوات القائمة المنسدلة اللاحقة. للبدء ، تنمو سلالة الإشريكية القولونية BL21 (DE3) في وسائط Luria-Bertani ، أو LB ، عند 37 درجة مئوية إلى كثافة بصرية ، أو OD ، من 0.1 إلى 0.2. أجهزة الطرد المركزي ملليلتر واحد من التعليق البكتيري لمدة دقيقة واحدة عند 9،000 غرام عند أربع درجات مئوية وتجاهل المادة الطافية.ثم أضف 0.5 ملليلتر من محلول تحويل الجليد البارد ، أو TB ، واحتضانه لمدة 10 دقائق على الجليد. في نهاية الحضانة ، أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية عند 8،000 G عند أربع درجات مئوية وتجاهل المادة الطافية. ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول السل ، و 100 نانوجرام من كل ناقل ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة على الجليد.يسخن على حرارة 42 درجة مئوية لمدة 150 ثانية ، ثم يبرد على الجليد لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من وسائط LB بدون مضادات حيوية واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي وإعادة تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من وسائط LB قبل طلاء التعليق على لوحة أجار LB تحتوي على 0.5٪ جلوكوز ومضادات حيوية مقابلة.احتضان اللوحة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، اغسل الخلايا من اللوحة بملليلتر من وسائط LB إلى 50 ملليلتر من وسائط LB مع المضادات الحيوية المقابلة. أضف أيونات المعادن أو غيرها من العوامل المساعدة المعروفة قبل تخزين القسمة مع 20٪ من الجلسرين عند 70 درجة مئوية تحت الصفر للتجارب اللاحقة.تنمو الخلايا مع دوران ثابت من 220 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية إلى OD من 0.5 إلى 0.7. قم بتبريد الثقافة إلى درجة حرارة الغرفة وإضافة IPTG إلى تركيز نهائي يبلغ ملليمول واحد. قم بتخزين حصة 20 ميكرولتر من تعليق الخلية كعنصر تحكم في العينة غير المستحثة.احتضان الخلايا بين عشية وضحاها عند 220 دورة في الدقيقة عند 18 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قسم التعليق البكتيري إلى قسمين وقم بتخزين حصص 20 ميكرولتر لتأكيد تعبير البروتين. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية المتبقية في 4،000 غرام لمدة 15 دقيقة.لمقايسة السحب ، أعد تعليق الكريات في ملليلتر واحد من محلول التحلل المثلج البارد مع مثبطات الأنزيم البروتيني وعوامل التقليل المضافة مباشرة قبل التجربة. اضبط تركيبة المخزن المؤقت للبروتينات المختبرة. تعطيل الخلايا عن طريق صوتنة على الجليد وتخزين حصص 20 ميكرولتر للكهربائي.أجهزة الطرد المركزي في 16،000 غرام لمدة 30 دقيقة وجمع 20 ميكرولتر من المحللة الموضحة للرحلان الكهربائي. قم بموازنة الراتنج مع ملليلتر واحد من محلول تحلل الثلج البارد لمدة 10 دقائق ، ثم جهاز طرد مركزي عند 2،000 جم لمدة 30 ثانية وتخلص من المادة الطافية. أضف محللات الخلية إلى الراتنج واحتضانها لمدة 10 دقائق بدوران ثابت يبلغ 15 دورة في الدقيقة.ثم ، أجهزة الطرد المركزي وتجاهل المادة الطافية قبل جمع 20 ميكرولتر من الجزء غير المنضم للتحليل. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للغسيل المثلج واحتضانه لمدة دقيقة واحدة. مرة أخرى ، أجهزة الطرد المركزي وتجاهل طاف.بعد ذلك ، قم بإجراء غسلتين طويلتين باستخدام عازل غسيل بارد مثلج. بعد الغسيل الثاني ، قم بإزالة البروتينات المرتبطة ب 50 ميكرولتر من محلول الشطف في شاكر عند 1،200 دورة في الدقيقة عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تحليل البروتينات المستخلصة مع SDS بولي أكريلاميد هلام الكهربائي.تظهر هنا دراسات حول المجال المرتبط بإصبع الزنك ، أو ZAD ، وثنائي الهومو في البروتين المرتبط بالمالتوز ، أو MBP ، ومقايسات السحب 6xHistidin. يظهر التعبير المشترك ل MBP و Thioredoxin 6xHistidine-used ZADs نشاطا جيدا وقابلا للتكرار ، حيث يظهر كنطاق إضافي في نتائج SDS-PAGE لمقايسة MBP المنسدلة. يوضح هنا مثال آخر على استخدام الطريقة لدراسة التكوين المركب البديل.في مقايسة التعبير المشترك ، تفاعل ENY2 الموسوم ب 6xHistidine مع كل من Sgf11 و MBP-CTCF الموسوم بضريبة السلع والخدمات ، ولكن لم يكن GST-Sgf11 موجودا في عمليات سحب MBP والعكس صحيح. يتم عرض مقارنة خطوة بخطوة للفترات الزمنية المطلوبة في سير عمل مقايسة القائمة المنسدلة التقليدية مقارنة بالقائمة المنسدلة المقترنة بالتعبير المشترك هنا. نتائج استخدام كلتا التقنيتين لدراسة نفس التفاعل بين مجال BTB لبروتين CP190 والمجال C الموسوم بضريبة السلع والخدمات لبروتين ذبابة الفاكهة CTCF موضحة هنا.يعد الاختيار الصحيح لاختبار التقارب والذوبان ، Thioredoxin أو GST أو MBP ، أمرا بالغ الأهمية للتنفيذ الفعال للفحص. خطوة حاسمة أخرى هي تعطيل الخلايا بسرعة وموحدة. يوصى بشدة باستخدام مجسات صوتنة متعددة الأطراف.تسمح هذه الطريقة بالدراسة المباشرة لتشكيل heterodimer بين مجالات البروتين التي تشكل بخلاف ذلك متجانسات لا تنفصل أثناء حضانة البروتينات المنقاة في الفحص المنسدل التقليدي.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

تباين الخواص مضان كأداة لدراسة التفاعلات البروتين البروتين

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

الاستفادة من مجمع بين الافراج عن الإثيلين، حمض 2-Chloroethylphosphonic، كأداة لدراسة استجابة الإثيلين في البكتيريا

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

الببتيدات اختراق الخلية بيوتينيلاتيد لدراسة تفاعلات البروتين البروتين داخل الخلايا

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems

تنويعات على سلبية وصمة عار أساليب الميكروسكوب الإلكتروني: أدوات للتصدي لتحدي الأنظمة

Negative stain electron microscopy (EM) allows relatively simple and quick observation of macromolecules and macromolecular complexes through the use of ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

تحليل الطيفي تقلب Fluorescence من تفاعلات البروتين البروتين في الخلية جهات الاتصال

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

تطبيق قياس التداخل الحيوي (BLI) لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين في النسخ

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

التفاعلات مع وغشاء التغلغل من الميتوكوندريا الدماغ بواسطة ألياف الليفية اميلويد

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-تقارب تنقية مقرونة تسلسل الحمض النووي الريبي في البكتيريا إيجابية الغرام

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...