Name: pulldown assay coupled with co-expression in bacteria cells as a time-efficient tool for testing challenging protein-protein interactions
Uploaded: 2022-12-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Russian Science Foundation-projekterne 19-74-30026 (metodeudvikling og validering) og 19-74-10099 (protein-protein-interaktionsassays); og af Den Russiske Føderations ministerium for videnskab og videregående uddannelse-tilskud 075-15-2019-1661 (analyse af repræsentative protein-proteininteraktioner).

Den skematiske gengivelse af metodearbejdsgangen er vist i figur 1.
1. Samtidig omdannelse af E. coli
<ol><li>Forbered ekspressionsvektorer for målproteiner ved hjælp af standardkloningsmetoder. BEMÆRK: Typisk er et godt udgangspunkt at bruge konventionelle pGEX/pMAL-vektorer med et ampicillingenresistensgen og ColE1-oprindelse til ekspression af GST/MBP-mærkede proteiner og en kompatibel vektor med p15A- eller RSF-oprindelse og ...

<ol>
	<li>Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions:+Pulldown+assays.">Protein-protein interactions: Pulldown assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).</li><li>Rose, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+dimerization,+coactivator+recognition+and+MODY3+mutations+in+HNF-1alpha.">Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).</li><li>Bonchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+diversity+and+homodimerization+specificity+of+zinc-finger-associated+domains+in+Drosophila.">Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila.</a> Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).</li><li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors.">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112 (2), 193-205 (2003).</li><li>Badonyi, M., Marsh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+protein+complex+interfaces+have+evolved+to+promote+co-translational+assembly.">Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly.</a> Elife. 11, 79602 (2022).</li><li>Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cotranslational+maturation+of+newly+synthesized+proteins.">Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins.</a> Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).</li><li>Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cotranslational+protein+maturation+in+bacteria.">Mechanisms of cotranslational protein maturation in bacteria.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 689755 (2021).</li><li>Shiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+assembly+of+protein+complexes+in+eukaryotes+revealed+by+ribosome+profiling.">Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling.</a> Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).</li><li>Shieh, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operon+structure+and+co-translational+subunit+association+direct+protein+assembly+in+bacteria.">Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria.</a> Science. 350 (6261), 678-680 (2015).</li><li>Bertolini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+nascent+proteins+translated+by+adjacent+ribosomes+drive+homomer+assembly.">Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly.</a> Science. 371 (6524), 57-64 (2021).</li><li>Bonchuk, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+highly+similar+spatial+organization+of+zinc-finger+associated+domains+with+a+very+low+sequence+similarity.">Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity.</a> Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).</li><li>Justin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+oncogenic+histone+H3K27M+inhibition+of+human+polycomb+repressive+complex+2.">Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2.</a> Nature Communications. 7, 11316 (2016).</li><li>Lariviere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+mediator+head+module.">Structure of the mediator head module.</a> Nature. 492 (7429), 448-451 (2012).</li><li>Taylor, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+T4+baseplate+and+its+function+in+triggering+sheath+contraction.">Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction.</a> Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).</li><li>Samara, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+assembly+and+function+of+the+SAGA+deubiquitinating+module.">Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module.</a> Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).</li><li>Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+assembly+and+activation+of+the+heterotetrameric+SAGA+histone+H2B+deubiquitinase+module.">Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module.</a> Cell. 141 (4), 606-617 (2010).</li><li>Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+ferritin:+modulation+of+subunit+stoichiometry+in+bacterial+expression+systems.">Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems.</a> Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).</li><li>Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+replication+of+plasmid+p15A+and+comparative+studies+on+the+nucleotide+sequences+around+the+origin+of+related+plasmids.">The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids.</a> Cell. 32 (1), 119-129 (1983).</li><li>Nijkamp, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+nucleotide+sequence+of+the+bacteriocinogenic+plasmid+CloDF13.">The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13.</a> Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).</li><li>Som, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+replication+of+Escherichia+coli+plasmid+RSF+1030.">Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030.</a> Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).</li><li>Tsao, K. L., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+production+of+two+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli+by+manipulating+plasmid+copy+number:+high-level+expression+of+heterodimeric+Ras+farnesyltransferase.">Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase.</a> Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).</li><li>Nallamsetty, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubility-enhancing+proteins+MBP+and+NusA+play+a+passive+role+in+the+folding+of+their+fusion+partners.">Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners.</a> Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).</li><li>Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+two-hybrid+assay+to+identify+interacting+proteins.">Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70 (2019).</li><li>Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+two-hybrid+(F2H)+assay+for+direct+analysis+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).</li><li>Fiebitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mammalian+two-hybrid+screening+for+protein-protein+interactions+using+transfected+cell+arrays.">High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays.</a> BMC Genomics. 9, 68 (2008).</li><li>Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+and+Sgfl1+proteins+form+alternative+complexes+with+ENY2+proteins.">CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins.</a> Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).</li><li>Maksimenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+new+insulator+proteins,+Pita+and+ZIPIC,+target+CP190+to+chromatin.">Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin.</a> Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).</li><li>Sabirov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+functional+role+of+the+interaction+between+CP190+and+the+architectural+protein+Pita+in+Drosophila+melanogaster.">Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster.</a> Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16 (2021).</li><li>Dong, S., Provart, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyses+of+protein+interaction+networks+using+computational+tools.">Analyses of protein interaction networks using computational tools.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).</li></ol>

Den beskrevne metode tillader test af protein-proteininteraktioner, der ikke effektivt kan samles in vitro og kræver co-ekspression. Metoden er en af de få egnede metoder til undersøgelse af heterodimeriserende proteiner, som også er i stand til homodimerisering, da sådanne proteiner, når de renses separat, danner stabile homodimerer, som oftest ikke kan dissocieres og associeres igen under eksperimentet 3,11.
Arbejdsgan...

Konventionel pulldown bruges i vid udstrækning til at studere protein-proteininteraktioner1. Imidlertid interagerer oprensede proteiner ofte ikke effektivt in vitro2,3, og nogle af dem er uopløselige uden deres bindingspartner 4,5. Sådanne proteiner kan kræve co-translationel samling eller tilstedeværelse af molekylære chaperoner 5,6,7,8,9. En anden begrænsning ved konventionel pulldown er testning af mulig heteromultimeriseringsaktivitet mellem domæner, der kan eksistere som stabile homo-oligomerer samlet co-translationelt 8,10, da mange af dem ikke kan dissociere og re-associere in vitro i inkubationstiden. Samudtryk viste sig at være nyttigt til at overvinde sådanne problemer 3,11. Co-ekspression ved hjælp af kompatible vektorer i bakterier blev med succes anvendt til at rense store multi-subunit makromolekylære komplekser, herunder polycomb repressive complex PRC212, RNA polymerase II mediator head module13, bacteriophage T4 baseplate 14, SAGA complex deubiquitinylase module 15,16 og ferritin 17. Replikeringsoprindelser, der almindeligvis bruges til co-ekspression, er ColE1, p15A18, CloDF1319 og RSF20. I det kommercielt tilgængelige Duet-ekspressionssystem kombineres disse oprindelser med forskellige antibiotikaresistensgener og praktiske flere kloningssteder for at producere polycistroniske vektorer, hvilket tillader ekspression af op til otte proteiner. Disse oprindelser har forskellige kopinumre og kan anvendes i forskellige kombinationer for at opnå afbalancerede ekspressionsniveauer af målproteiner21. For at teste protein-proteininteraktioner anvendes forskellige affinitetsmærker; de mest almindelige er 6xhistidin, glutathion-S-transferase (GST) og maltosebindende protein (MBP), som hver især har en specifik affinitet til den tilsvarende harpiks. GST og MBP forbedrer også opløseligheden og stabiliteten af mærkede proteiner22.
Der er også udviklet en række metoder, der involverer proteinco-ekspression i eukaryote celler, hvoraf den mest fremtrædende er gær-to-hybrid-assay (Y2H)23. Y2H-analysen er billig, nem og tillader test af flere interaktioner; Imidlertid tager dens arbejdsgang mere end 1 uge at fuldføre. Der er også nogle få mindre hyppigt anvendte pattedyrcellebaserede assays, for eksempel fluorescerende to-hybrid assay (F2H)24 og cell array protein-protein interaction assay (CAPPIA)25. F2H-analysen er relativt hurtig, hvilket gør det muligt at observere proteininteraktioner i deres oprindelige cellulære miljø, men involverer brug af dyrt billeddannelsesudstyr. Alle disse metoder har en fordel i forhold til prokaryot ekspression, der giver det oprindelige eukaryote oversættelses- og foldemiljø; Imidlertid registrerer de interaktion indirekte, enten ved transkriptionel aktivering eller ved fluorescerende energioverførsel, som ofte producerer artefakter. Eukaryote celler kan også indeholde andre interaktionspartnere af proteiner af interesse, hvilket kan forstyrre testningen af binære interaktioner mellem proteiner af højere eukaryoter.
Denne undersøgelse beskriver en metode til bakteriel co-ekspression af differentielt mærkede proteiner efterfulgt af konventionelle pulldown-teknikker. Metoden gør det muligt at studere interaktioner mellem målproteiner, der kræver co-ekspression. Det er mere tidseffektivt sammenlignet med traditionel pulldown, hvilket tillader batchtest af flere mål, hvilket gør det fordelagtigt i de fleste tilfælde. Co-ekspression ved hjælp af kompatible vektorer er mere praktisk end polycistronisk co-ekspression, da det ikke kræver et besværligt kloningstrin.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-ELEMENT probe</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>630-0586</td>
			<td>The high throughput 8-element sonicator probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose resin</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8021</td>
			<td>Resin for purification of MBP-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)&#160;</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69450-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R (Z605212)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A9782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione agarose</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>16100</td>
			<td>Resin for purification of GST-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni-NTA Superflow Agarose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25214</td>
			<td>Resin for purification of 6xHis-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>414753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pACYCDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71147</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCDFDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71340</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail VII</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539138</td>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSFDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71341</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VC505 sonicator</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>CV334</td>
			<td>Ultrasonic liquid processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A6285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pulldown assay coupled with co-expression in bacteria cells as a time-efficient tool for testing challenging protein-protein interactions

Pulldown er et let og udbredt protein-protein interaktionsassay. Det har dog begrænsninger i at studere proteinkomplekser, der ikke samles effektivt in vitro. Sådanne komplekser kan kræve co-translationel samling og tilstedeværelsen af molekylære chaperoner; Enten danner de stabile oligomerer, som ikke kan adskille og re-associere in vitro eller er ustabile uden en bindende partner. For at overvinde disse problemer er det muligt at anvende en metode baseret på bakteriel co-ekspression af differentielt mærkede proteiner ved hjælp af et sæt kompatible vektorer efterfulgt af de konventionelle pulldown-teknikker. Arbejdsgangen er mere tidseffektiv sammenlignet med traditionel pulldown, fordi den mangler de tidskrævende trin med separat oprensning af interagerende proteiner og deres efterfølgende inkubation. En anden fordel er en højere reproducerbarhed på grund af et betydeligt mindre antal trin og en kortere periode, hvor proteiner, der findes i in vitro-miljøet , udsættes for proteolyse og oxidation. Metoden blev med succes anvendt til at studere en række protein-protein-interaktioner, når andre in vitro-teknikker viste sig at være uegnede. Metoden kan anvendes til batchtest af protein-protein-interaktioner. Repræsentative resultater er vist for undersøgelser af interaktioner mellem BTB-domæne og iboende uordnede proteiner og af heterodimerer af zinkfingerassocierede domæner.

Den beskrevne metode blev rutinemæssigt brugt med mange forskellige mål. Her præsenteres nogle repræsentative resultater, som sandsynligvis ikke kan opnås ved hjælp af konventionelle pulldown-teknikker. Den første er undersøgelsen af specifik ZAD (zink-finger-associeret domæne) dimerisering11. ZAD'er danner stabile og specifikke dimerer, hvor heterodimerer kun er mulige mellem nært beslægtede domæner inden for paraloge grupper. Dimererne dannet af disse domæner er stabile og dissocier...

Watch this Scientific Journal Video about Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions at JoVE.com

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Her beskriver vi en metode til bakteriel co-ekspression af differentielt mærkede proteiner ved hjælp af et sæt kompatible vektorer, efterfulgt af de konventionelle pulldown-teknikker til at studere proteinkomplekser, der ikke kan samles in vitro.

Pulldown-analyse kombineret med co-ekspression i bakterieceller som et tidseffektivt værktøj til test af udfordrende protein-protein-interaktioner

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

Denne metode gør det muligt at studere formationer af proteinkomplekser, der kræver co-ekspression for effektive testprøver, såsom dannelsen af heterodimerer. Hovedpotentialet i denne metode er at udnytte co-ekspression af differentielt mærkede studerede proteiner ved hjælp af kombinationer af kompatible vektorer for at fremme effektiv kompleks samling sammen med tidseffektiv arbejdsgang og skalerbarhed, der muliggør hurtig patch-test af flere interaktioner. Denne metode kan også anvendes til hurtig screening af optimal proteinekspression og oprensningsbetingelser.Visuel demonstration hjælper med at udføre kritiske trin i protokollen korrekt, f.eks. opsætning af co-ekspression, celleafbrydelse og efterfølgende rullemenutrin. Til at begynde med vokser Escherichia coli BL21 (DE3) stamme i Luria-Bertani eller LB, medier ved 37 grader Celsius til en optisk tæthed eller OD på 0,1 til 0,2. Der centrifugeres en milliliter bakterieopslæmning i et minut ved 9.000 G ved fire grader Celsius, og supernatanten kasseres.Derefter tilsættes 0,5 ml iskold transformationsbuffer eller TB og inkuberes i 10 minutter på is. Ved inkubationens afslutning centrifugeres i 30 sekunder ved 8.000 G ved fire grader Celsius og supernatanten kasseres. Derefter tilsættes 100 mikroliter TB-buffer, 100 nanogram af hver vektor og inkuberes i 30 minutter på is.Opvarm ved 42 grader Celsius i 150 sekunder, og afkøl derefter på is i et minut. Derefter tilsættes en milliliter LB-medier uden antibiotika og inkuberes ved 37 grader Celsius i 90 minutter. Efter inkubation centrifugeres og resuspenderes pelleten i 100 mikroliter LB-medier, inden suspensionen pletteres på en LB-agarplade indeholdende 0,5% glucose og tilsvarende antibiotika.Inkuber pladen natten over ved 37 grader Celsius. Den følgende dag skylles cellerne fra pladen med to ml LB-medier i 50 ml LB-medier med tilsvarende antibiotika. Tilsæt metalioner eller andre kendte co-faktorer, før du opbevarer en prøve med 20% glycerol ved minus 70 grader Celsius til efterfølgende forsøg.Vok cellerne med en konstant rotation på 220 RPM ved 37 grader Celsius til en OD på 0,5 til 0,7. Afkøl kulturen til stuetemperatur og tilsæt IPTG til en endelig koncentration på en millimol. Der opbevares en 20 mikroliter delprøve cellesuspension som kontrol af den ikke-inducerede prøve.Inkuber cellerne natten over ved 220 RPM ved 18 grader Celsius. Den næste dag opdeles bakteriesuspensionen i to dele og opbevares 20 mikroliter alikvoter for at bekræfte proteinekspression. Centrifuger den resterende cellesuspension ved 4.000 G i 15 minutter.Til pulldown-analyse resuspenderes pellets i en milliliter iskold lysisbuffer med proteasehæmmere og reduktionsmidler tilsat umiddelbart før eksperimentet. Juster buffersammensætningen for de testede proteiner. Forstyrre cellerne ved sonikering på is og opbevar en 20-mikroliter alikvote til elektroforese.Centrifuger ved 16.000 G i 30 minutter og saml 20 mikroliter af det klarede lysat til elektroforese. Harpiksen afbalanceres med en milliliter iskold lysisbuffer i 10 minutter, centrifugeres derefter ved 2.000 G i 30 sekunder og kasseres supernatanten. Tilsæt cellelysater til harpiksen og inkuber i 10 minutter ved en konstant rotation på 15 RPM.Derefter centrifugeres supernatanten og kasseres, inden der opsamles 20 mikroliter af den ubundne fraktion til analyse. Derefter tilsættes en milliliter iskold vaskebuffer og inkuberes i et minut. Der centrifugeres igen og kasseres supernatanten.Udfør derefter to lange vaske med iskold vaskebuffer. Efter den anden vask elueres de bundne proteiner med 50 mikroliter elueringsbuffer i en ryster ved 1.200 RPM ved fire grader Celsius i 10 minutter. Analyser de eluerede proteiner med SDS polyacrylamidgelelektroforese.Undersøgelser af zinkfingerassocieret domæne eller ZAD, homo-dimerisering i maltosebindende protein eller MBP og 6xhistidin-pulldown-assays er vist her. Co-ekspressionen af MBP og Thioredoxin 6xHistidin-smeltede ZAD'er viser god og reproducerbar homodimeriseringsaktivitet, der vises som et ekstra bånd i SDS-PAGE-resultaterne af MBP-pulldown-assayet. Et andet eksempel på at bruge metoden til at studere alternativ kompleks dannelse er vist her.I co-ekspressionsanalysen interagerede 6xHistidine-tagget ENY2 både med GST-mærket Sgf11 og MBP-CTCF, men der var ingen GST-Sgf11 til stede i MBP-pulldowns og omvendt. En trinvis sammenligning af påkrævede tidsintervaller i arbejdsgangen for det konventionelle pulldown-assay sammenlignet med pulldown koblet til co-expression vises her. Resultaterne af at bruge begge teknikker til at studere den samme interaktion mellem BTB-domænet for CP190-proteinet og det GST-mærkede C-terminale domæne for Drosophila CTCF-protein er vist her.Det korrekte valg af affinitets- og opløselighedstest, thioredoxin, GST eller MBP, er afgørende for effektiv udførelse af analysen. Et andet kritisk trin er hurtig og ensartet celleforstyrrelse. Det anbefales stærkt at bruge multi-tip sonikator sonder.Denne metode tillader direkte undersøgelse af heterodimerdannelsen mellem proteindomæner, der ellers danner homodimerer, der ikke ville adskilles under inkubation af oprensede proteiner i konventionel pulldown-analyse.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescens Anisotropi som værktøj til at studere protein-protein interaktioner

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

Udnytte den Ethylen-frigivende forbindelse, 2-Chloroethylphosphonic Acid, som værktøj til at studere Ethylen Respons Bacteria

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylated celle-gennemtrængende peptider til at studere intracellulær Protein-protein interaktioner

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems

Variationer på Negative pletten Elektron Mikroskopi metoder: værktøjer til håndtering af udfordrende systemer

Negative stain electron microscopy (EM) allows relatively simple and quick observation of macromolecules and macromolecular complexes through the use of ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Et fluorescens udsving spektroskopi Assay af Protein-Protein interaktioner på celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Anvendelse af Biolayer interferometri (BLI) til undersøgelse af protein-protein interaktioner i transkriptionen

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaktioner med og membran Permeabilisering af hjernen mitochondrier af amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-Affinitetsrensning kombineret med RNA-sekventering i gram-positive bakterier

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...