Name: pulldown assay coupled with co-expression in bacteria cells as a time-efficient tool for testing challenging protein-protein interactions
Uploaded: 2022-12-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de projecten 19-74-30026 (methodeontwikkeling en -validatie) en 19-74-10099 (eiwit-eiwitinteractietests); en door het ministerie van Wetenschap en Hoger Onderwijs van de Russische Federatie-subsidie 075-15-2019-1661 (analyse van representatieve eiwit-eiwitinteracties).

De schematische weergave van de methodeworkflow wordt weergegeven in figuur 1.
1. Co-transformatie van E. coli
<ol><li>Bereid expressievectoren voor doeleiwitten voor met behulp van standaard kloonmethoden. OPMERKING: Doorgaans is een goed uitgangspunt om conventionele pGEX / pMAL-vectoren te gebruiken met een ampicillineresistentiegen en ColE1-oorsprong voor de expressie van GST / MBP-gelabelde eiwitten en een compatibele vector met...

<ol>
	<li>Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions:+Pulldown+assays.">Protein-protein interactions: Pulldown assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).</li><li>Rose, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+dimerization,+coactivator+recognition+and+MODY3+mutations+in+HNF-1alpha.">Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).</li><li>Bonchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+diversity+and+homodimerization+specificity+of+zinc-finger-associated+domains+in+Drosophila.">Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila.</a> Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).</li><li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors.">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112 (2), 193-205 (2003).</li><li>Badonyi, M., Marsh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+protein+complex+interfaces+have+evolved+to+promote+co-translational+assembly.">Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly.</a> Elife. 11, 79602 (2022).</li><li>Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cotranslational+maturation+of+newly+synthesized+proteins.">Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins.</a> Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).</li><li>Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cotranslational+protein+maturation+in+bacteria.">Mechanisms of cotranslational protein maturation in bacteria.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 689755 (2021).</li><li>Shiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+assembly+of+protein+complexes+in+eukaryotes+revealed+by+ribosome+profiling.">Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling.</a> Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).</li><li>Shieh, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operon+structure+and+co-translational+subunit+association+direct+protein+assembly+in+bacteria.">Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria.</a> Science. 350 (6261), 678-680 (2015).</li><li>Bertolini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+nascent+proteins+translated+by+adjacent+ribosomes+drive+homomer+assembly.">Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly.</a> Science. 371 (6524), 57-64 (2021).</li><li>Bonchuk, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+highly+similar+spatial+organization+of+zinc-finger+associated+domains+with+a+very+low+sequence+similarity.">Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity.</a> Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).</li><li>Justin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+oncogenic+histone+H3K27M+inhibition+of+human+polycomb+repressive+complex+2.">Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2.</a> Nature Communications. 7, 11316 (2016).</li><li>Lariviere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+mediator+head+module.">Structure of the mediator head module.</a> Nature. 492 (7429), 448-451 (2012).</li><li>Taylor, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+T4+baseplate+and+its+function+in+triggering+sheath+contraction.">Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction.</a> Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).</li><li>Samara, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+assembly+and+function+of+the+SAGA+deubiquitinating+module.">Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module.</a> Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).</li><li>Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+assembly+and+activation+of+the+heterotetrameric+SAGA+histone+H2B+deubiquitinase+module.">Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module.</a> Cell. 141 (4), 606-617 (2010).</li><li>Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+ferritin:+modulation+of+subunit+stoichiometry+in+bacterial+expression+systems.">Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems.</a> Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).</li><li>Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+replication+of+plasmid+p15A+and+comparative+studies+on+the+nucleotide+sequences+around+the+origin+of+related+plasmids.">The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids.</a> Cell. 32 (1), 119-129 (1983).</li><li>Nijkamp, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+nucleotide+sequence+of+the+bacteriocinogenic+plasmid+CloDF13.">The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13.</a> Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).</li><li>Som, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+replication+of+Escherichia+coli+plasmid+RSF+1030.">Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030.</a> Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).</li><li>Tsao, K. L., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+production+of+two+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli+by+manipulating+plasmid+copy+number:+high-level+expression+of+heterodimeric+Ras+farnesyltransferase.">Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase.</a> Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).</li><li>Nallamsetty, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubility-enhancing+proteins+MBP+and+NusA+play+a+passive+role+in+the+folding+of+their+fusion+partners.">Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners.</a> Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).</li><li>Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+two-hybrid+assay+to+identify+interacting+proteins.">Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70 (2019).</li><li>Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+two-hybrid+(F2H)+assay+for+direct+analysis+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).</li><li>Fiebitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mammalian+two-hybrid+screening+for+protein-protein+interactions+using+transfected+cell+arrays.">High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays.</a> BMC Genomics. 9, 68 (2008).</li><li>Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+and+Sgfl1+proteins+form+alternative+complexes+with+ENY2+proteins.">CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins.</a> Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).</li><li>Maksimenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+new+insulator+proteins,+Pita+and+ZIPIC,+target+CP190+to+chromatin.">Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin.</a> Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).</li><li>Sabirov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+functional+role+of+the+interaction+between+CP190+and+the+architectural+protein+Pita+in+Drosophila+melanogaster.">Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster.</a> Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16 (2021).</li><li>Dong, S., Provart, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyses+of+protein+interaction+networks+using+computational+tools.">Analyses of protein interaction networks using computational tools.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).</li></ol>

De beschreven methode maakt het testen van eiwit-eiwitinteracties mogelijk die niet efficiënt in vitro kunnen worden geassembleerd en co-expressie vereisen. De methode is een van de weinige geschikte benaderingen voor het bestuderen van heterodimeriserende eiwitten, die ook in staat zijn tot homodimerisatie, omdat dergelijke eiwitten, wanneer ze afzonderlijk worden gezuiverd, stabiele homodimeren vormen die meestal niet kunnen dissociëren en opnieuw associëren tijdens het experiment <s...

Conventionele pulldown wordt veel gebruikt om eiwit-eiwitinteracties te bestuderen1. Gezuiverde eiwitten interageren echter vaak niet effectief in vitro2,3, en sommige zijn onoplosbaar zonder hun bindingspartner 4,5. Dergelijke eiwitten kunnen co-translationele assemblage of de aanwezigheid van moleculaire chaperonnes 5,6,7,8,9 vereisen. Een andere beperking van conventionele pulldown is het testen van mogelijke heteromultimerisatieactiviteit tussen domeinen die kunnen bestaan als stabiele homo-oligomeren die co-translationeel zijn geassembleerd 8,10, omdat velen van hen niet in vitro kunnen dissociëren en opnieuw associëren tijdens de incubatietijd. Co-expressie bleek nuttig te zijn bij het overwinnen van dergelijke problemen 3,11. Co-expressie met behulp van compatibele vectoren in bacteriën werd met succes gebruikt om grote multi-subunit macromoleculaire complexen te zuiveren, waaronder polycomb repressief complex PRC212, RNA polymerase II mediator head module13, bacteriofaag T4 basisplaat 14, SAGA complex deubiquitinylase module 15,16 en ferritine 17. Replicatiebronnen die vaak worden gebruikt voor co-expressie zijn ColE1, p15A18, CloDF1319 en RSF20. In het in de handel verkrijgbare Duet-expressiesysteem worden deze oorsprongen gecombineerd met verschillende antibioticaresistentiegenen en handige meerdere kloonsites om polycistronische vectoren te produceren, waardoor de expressie van maximaal acht eiwitten mogelijk is. Deze oorsprongen hebben verschillende kopienummers en kunnen in verschillende combinaties worden gebruikt om evenwichtige expressieniveaus van doeleiwittente bereiken 21. Om eiwit-eiwitinteracties te testen, worden verschillende affiniteitstags gebruikt; de meest voorkomende zijn 6xHistidine, glutathion-S-transferase (GST) en maltose-bindend eiwit (MBP), die elk een specifieke affiniteit hebben met de overeenkomstige hars. GST en MBP verbeteren ook de oplosbaarheid en stabiliteit van gelabelde eiwitten22.
Er zijn ook een aantal methoden ontwikkeld waarbij eiwitten co-expressie in eukaryote cellen gebruiken, waarvan de meest prominente gist twee-hybride assay (Y2H)23 is. Y2H-test is goedkoop, gemakkelijk en maakt het testen van meerdere interacties mogelijk; De workflow duurt echter meer dan 1 week om te voltooien. Er zijn ook een paar minder vaak gebruikte zoogdiercel-gebaseerde assays, bijvoorbeeld fluorescent two-hybrid assay (F2H)24 en cell array protein-protein interaction assay (CAPPIA)25. F2H-assay is relatief snel, waardoor eiwitinteracties in hun oorspronkelijke cellulaire omgeving kunnen worden waargenomen, maar omvat het gebruik van dure beeldvormingsapparatuur. Al deze methoden hebben een voordeel ten opzichte van prokaryote expressie die de oorspronkelijke eukaryote vertaal- en vouwomgeving biedt; Ze detecteren echter indirect interactie, hetzij door transcriptionele activering of door fluorescerende energieoverdracht, die vaak artefacten produceert. Ook kunnen eukaryote cellen andere interactiepartners van eiwitten van belang bevatten, die het testen van binaire interacties tussen eiwitten van hogere eukaryoten kunnen verstoren.
De huidige studie beschrijft een methode voor de bacteriële co-expressie van differentieel gelabelde eiwitten gevolgd door conventionele pulldown-technieken. De methode maakt het mogelijk om interacties tussen doeleiwitten te bestuderen die co-expressie vereisen. Het is tijdsefficiënter in vergelijking met traditionele pulldown, waardoor batchtests van meerdere doelen mogelijk zijn, waardoor het in de meeste gevallen voordelig is. Co-expressie met behulp van compatibele vectoren is handiger dan polycistronische co-expressie, omdat het geen moeizame kloonstap vereist.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-ELEMENT probe</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>630-0586</td>
			<td>The high throughput 8-element sonicator probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose resin</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8021</td>
			<td>Resin for purification of MBP-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)&#160;</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69450-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R (Z605212)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A9782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione agarose</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>16100</td>
			<td>Resin for purification of GST-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni-NTA Superflow Agarose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25214</td>
			<td>Resin for purification of 6xHis-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>414753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pACYCDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71147</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCDFDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71340</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail VII</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539138</td>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSFDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71341</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VC505 sonicator</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>CV334</td>
			<td>Ultrasonic liquid processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A6285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pulldown assay coupled with co-expression in bacteria cells as a time-efficient tool for testing challenging protein-protein interactions

Pulldown is een eenvoudige en veelgebruikte eiwit-eiwit interactie assay. Het heeft echter beperkingen bij het bestuderen van eiwitcomplexen die niet effectief in vitro assembleren. Dergelijke complexen kunnen co-translationele assemblage en de aanwezigheid van moleculaire chaperonnes vereisen; ofwel vormen ze stabiele oligomeren die in vitro niet kunnen dissociëren en opnieuw associëren, ofwel zijn ze instabiel zonder bindende partner. Om deze problemen te overwinnen, is het mogelijk om een methode te gebruiken die is gebaseerd op de bacteriële co-expressie van differentieel gelabelde eiwitten met behulp van een reeks compatibele vectoren gevolgd door de conventionele pulldown-technieken. De workflow is tijdsefficiënter in vergelijking met traditionele pulldown omdat het de tijdrovende stappen van afzonderlijke zuivering van interagerende eiwitten en hun daaropvolgende incubatie mist. Een ander voordeel is een hogere reproduceerbaarheid door een aanzienlijk kleiner aantal stappen en een kortere periode waarin eiwitten die in de in vitro omgeving voorkomen worden blootgesteld aan proteolyse en oxidatie. De methode werd met succes toegepast voor het bestuderen van een aantal eiwit-eiwitinteracties wanneer andere in vitro technieken ongeschikt bleken te zijn. De methode kan worden gebruikt voor het batchgewijs testen van eiwit-eiwitinteracties. Representatieve resultaten worden getoond voor studies van interacties tussen BTB-domein en intrinsiek ongeordende eiwitten, en van heterodimeren van zinkvinger-geassocieerde domeinen.

De beschreven methode werd routinematig gebruikt met veel verschillende doelen. Hier worden enkele representatieve resultaten gepresenteerd die waarschijnlijk niet kunnen worden verkregen met behulp van conventionele pulldown-technieken. De eerste is de studie van specifieke ZAD (Zinc-finger-associated domain) dimerisatie11. ZAD's vormen stabiele en specifieke dimeren, waarbij heterodimeren alleen mogelijk zijn tussen nauw verwante domeinen binnen paraloge groepen. De dimeren gevormd door deze dom...

Watch this Scientific Journal Video about Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions at JoVE.com

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Hier beschrijven we een methode voor de bacteriële co-expressie van differentieel gelabelde eiwitten met behulp van een reeks compatibele vectoren, gevolgd door de conventionele pulldown-technieken om eiwitcomplexen te bestuderen die niet in vitro kunnen worden samengevoegd.

Pulldown-test in combinatie met co-expressie in bacteriecellen als een tijdefficiënt hulpmiddel voor het testen van uitdagende eiwit-eiwitinteracties

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

Deze methode maakt het mogelijk om formaties van eiwitcomplexen te bestuderen die co-expressie vereisen voor efficiënte testmonsters, zoals de vorming van heterodimeren. Het belangrijkste eindpotentieel van deze methode is het benutten van de co-expressie van differentieel gelabelde bestudeerde eiwitten met behulp van combinaties van compatibele vectoren om efficiënte complexe assemblage te bevorderen, samen met een tijdefficiënte workflow en schaalbaarheid die snelle patch-testen van meerdere interacties mogelijk maken. Deze methode kan ook worden gebruikt voor een snelle screening van optimale eiwitexpressie- en zuiveringscondities.Visuele demonstratie helpt bij het correct uitvoeren van kritieke stappen van het protocol, zoals het instellen van co-expressies, celverstoring en daaropvolgende vervolgkeuzestappen. Om te beginnen, kweek Escherichia coli BL21 (DE3) stam in Luria-Bertani, of LB, media bij 37 graden Celsius tot een optische dichtheid, of OD, van 0,1 tot 0,2. Centrifugeer één milliliter van de bacteriële suspensie gedurende één minuut bij 9.000 G bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg.Voeg vervolgens 0,5 milliliter ijskoude transformatiebuffer of TB toe en incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Aan het einde van de incubatie, centrifugeer gedurende 30 seconden bij 8.000 G bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg. Voeg vervolgens 100 microliter TB-buffer toe, 100 nanogram van elke vector en inccubeer gedurende 30 minuten op ijs.Verwarm gedurende 150 seconden op 42 graden Celsius en koel vervolgens een minuut op ijs. Voeg vervolgens een milliliter LB-media toe zonder antibiotica en incubeer gedurende 90 minuten bij 37 graden Celsius. Na incubatie, centrifugeer en resuspensie de pellet in 100 microliter LB-media voordat u de suspensie op een LB-agarplaat met 0,5% glucose en bijbehorende antibiotica plaatst.Incubeer de plaat een nacht bij 37 graden Celsius. Spoel de cellen de volgende dag van de plaat met twee milliliter LB-media in 50 milliliter LB-media met bijbehorende antibiotica. Voeg metaalionen of andere bekende co-factoren toe voordat u een aliquot met 20% glycerol bij min 70 graden Celsius opslaat voor volgende experimenten.Kweek de cellen met een constante rotatie van 220 RPM bij 37 graden Celsius tot een OD van 0,5 tot 0,7. Koel de cultuur af tot kamertemperatuur en voeg IPTG toe tot een uiteindelijke concentratie van één millimol. Bewaar een aliquot van 20 microliter celsuspensie als controle van het niet-geïnduceerde monster.Incubeer de cellen 's nachts bij 220 RPM bij 18 graden Celsius. Verdeel de volgende dag de bacteriële suspensie in twee delen en bewaar aliquots van 20 microliter om de eiwitexpressie te bevestigen. Centrifugeer de resterende celsuspensie gedurende 15 minuten bij 4.000 G.Voor de pulldown-test resuspendeert u de pellets in één milliliter ijskoude lysisbuffer met proteaseremmers en reductiemiddelen die onmiddellijk voorafgaand aan het experiment zijn toegevoegd. Pas de buffersamenstelling aan voor de geteste eiwitten. Verstoor de cellen door ultrasoonapparaat op ijs en sla een aliquot van 20 microliter op voor elektroforese.Centrifugeer op 16.000 G gedurende 30 minuten en verzamel 20 microliter van het geklaarde lysaat voor elektroforese. Breng de hars in evenwicht met één milliliter ijskoude lysisbuffer gedurende 10 minuten, centrifugeer vervolgens gedurende 30 seconden op 2.000 G en gooi het supernatant weg. Voeg cellysaten toe aan de hars en incubeer gedurende 10 minuten bij een constante rotatie van 15 RPM.Centrifugeer vervolgens en gooi het supernatant weg voordat u 20 microliter van de ongebonden fractie verzamelt voor analyse. Voeg vervolgens een milliliter ijskoude wasbuffer toe en incubeer gedurende één minuut. Nogmaals, centrifugeer en gooi het supernatant weg.Voer vervolgens twee lange wasbeurten uit met ijskoude wasbuffer. Na de tweede wasbeurt, elueer de gebonden eiwitten met 50 microliter van de elutiebuffer in een shaker bij 1, 200 RPM bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Analyseer de geëlueerde eiwitten met SDS polyacrylamide gel elektroforese.Studies van het zinkvinger-geassocieerde domein, of ZAD, homo-dimerisatie in maltose-bindend eiwit, of MBP, en 6xHistidine pulldown assays worden hier getoond. De co-expressie van MBP en Thioredoxine 6xHistidine-gesmolten ZADs toont een goede en reproduceerbare homodimerisatie-activiteit, die als een extra band verschijnt in de SDS-PAGE-resultaten van de MBP pulldown-assay. Een ander voorbeeld van het gebruik van de methode om alternatieve complexe formatie te bestuderen, wordt hier getoond.In de co-expressietest had 6xHistidine-tagged ENY2 interactie met zowel GST-tagged Sgf11 als MBP-CTCF, maar er was geen GST-Sgf11 aanwezig in de MBP-pulldowns en vice versa. Een stapsgewijze vergelijking van de vereiste tijdsintervallen in de workflow van de conventionele pulldown-test in vergelijking met pulldown gekoppeld aan co-expressie wordt hier getoond. De resultaten van het gebruik van beide technieken om dezelfde interactie tussen het BTB-domein van het CP190-eiwit en het GST-gelabelde C-terminale domein van Drosophila CTCF-eiwit te bestuderen, worden hier weergegeven.De juiste keuze van affiniteits- en oplosbaarheidstest, Thioredoxine, GST of MBP, is van cruciaal belang voor de efficiënte uitvoering van de test. Een andere cruciale stap is snelle en uniforme celverstoring. Het wordt ten zeerste aanbevolen om multi-tip sonicator-sondes te gebruiken.Deze methode maakt de directe studie mogelijk van de heterodimeervorming tussen eiwitdomeinen die anders homodimeren vormen die niet zouden loskoppelen tijdens de incubatie van gezuiverde eiwitten in conventionele pulldown-assay.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescentie anisotropie als een instrument om eiwit-eiwit interacties te bestuderen

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

Gebruik makend van de Ethyleen-vrijmakende verbinding, 2-Chloroethylphosphonic zuur, als een instrument om ethyleenreactie in Bacteria Studie

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinyleerd cel-penetrating Peptides te bestuderen van intracellulaire eiwit-eiwitinteractie

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems

Variaties op negatieve vlek elektronenmicroscopie methoden: Tools voor de aanpak van de uitdagende systemen

Negative stain electron microscopy (EM) allows relatively simple and quick observation of macromolecules and macromolecular complexes through the use of ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Toepassing van Biolayer interferometrie (BLI) voor het bestuderen van eiwit-eiwit interacties in transcriptie

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interacties met en membraan Permeabilization van de mitochondriën van de hersenen door amyloid fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-Affinity Zuivering in combinatie met RNA Sequencing in Gram-Positieve Bacteriën

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...