Name: pulldown assay coupled with co-expression in bacteria cells as a time-efficient tool for testing challenging protein-protein interactions
Uploaded: 2022-12-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הרוסית למדע פרויקטים 19-74-30026 (פיתוח שיטה ותיקוף) ו 19-74-10099 (בדיקות אינטראקציה חלבון-חלבון); ועל ידי משרד המדע וההשכלה הגבוהה של הפדרציה הרוסית-מענק 075-15-2019-1661 (ניתוח של אינטראקציות חלבון-חלבון מייצג).

הייצוג הסכמטי של זרימת העבודה של השיטה מוצג באיור 1.
1. טרנספורמציה משותפת של E. coli
<ol><li>הכינו וקטורי ביטוי לחלבוני מטרה בשיטות שיבוט סטנדרטיות. הערה: בדרך כלל, נקודת התחלה טובה היא להשתמש בווקטורים קונבנציונליים של pGEX/pMAL הנושאים גן עמידות לאמפ...

<ol>
	<li>Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions:+Pulldown+assays.">Protein-protein interactions: Pulldown assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).</li><li>Rose, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+dimerization,+coactivator+recognition+and+MODY3+mutations+in+HNF-1alpha.">Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).</li><li>Bonchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+diversity+and+homodimerization+specificity+of+zinc-finger-associated+domains+in+Drosophila.">Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila.</a> Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).</li><li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors.">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112 (2), 193-205 (2003).</li><li>Badonyi, M., Marsh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+protein+complex+interfaces+have+evolved+to+promote+co-translational+assembly.">Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly.</a> Elife. 11, 79602 (2022).</li><li>Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cotranslational+maturation+of+newly+synthesized+proteins.">Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins.</a> Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).</li><li>Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cotranslational+protein+maturation+in+bacteria.">Mechanisms of cotranslational protein maturation in bacteria.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 689755 (2021).</li><li>Shiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+assembly+of+protein+complexes+in+eukaryotes+revealed+by+ribosome+profiling.">Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling.</a> Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).</li><li>Shieh, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operon+structure+and+co-translational+subunit+association+direct+protein+assembly+in+bacteria.">Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria.</a> Science. 350 (6261), 678-680 (2015).</li><li>Bertolini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+nascent+proteins+translated+by+adjacent+ribosomes+drive+homomer+assembly.">Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly.</a> Science. 371 (6524), 57-64 (2021).</li><li>Bonchuk, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+highly+similar+spatial+organization+of+zinc-finger+associated+domains+with+a+very+low+sequence+similarity.">Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity.</a> Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).</li><li>Justin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+oncogenic+histone+H3K27M+inhibition+of+human+polycomb+repressive+complex+2.">Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2.</a> Nature Communications. 7, 11316 (2016).</li><li>Lariviere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+mediator+head+module.">Structure of the mediator head module.</a> Nature. 492 (7429), 448-451 (2012).</li><li>Taylor, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+T4+baseplate+and+its+function+in+triggering+sheath+contraction.">Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction.</a> Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).</li><li>Samara, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+assembly+and+function+of+the+SAGA+deubiquitinating+module.">Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module.</a> Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).</li><li>Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+assembly+and+activation+of+the+heterotetrameric+SAGA+histone+H2B+deubiquitinase+module.">Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module.</a> Cell. 141 (4), 606-617 (2010).</li><li>Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+ferritin:+modulation+of+subunit+stoichiometry+in+bacterial+expression+systems.">Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems.</a> Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).</li><li>Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+replication+of+plasmid+p15A+and+comparative+studies+on+the+nucleotide+sequences+around+the+origin+of+related+plasmids.">The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids.</a> Cell. 32 (1), 119-129 (1983).</li><li>Nijkamp, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+nucleotide+sequence+of+the+bacteriocinogenic+plasmid+CloDF13.">The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13.</a> Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).</li><li>Som, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+replication+of+Escherichia+coli+plasmid+RSF+1030.">Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030.</a> Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).</li><li>Tsao, K. L., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+production+of+two+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli+by+manipulating+plasmid+copy+number:+high-level+expression+of+heterodimeric+Ras+farnesyltransferase.">Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase.</a> Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).</li><li>Nallamsetty, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubility-enhancing+proteins+MBP+and+NusA+play+a+passive+role+in+the+folding+of+their+fusion+partners.">Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners.</a> Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).</li><li>Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+two-hybrid+assay+to+identify+interacting+proteins.">Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70 (2019).</li><li>Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+two-hybrid+(F2H)+assay+for+direct+analysis+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).</li><li>Fiebitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mammalian+two-hybrid+screening+for+protein-protein+interactions+using+transfected+cell+arrays.">High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays.</a> BMC Genomics. 9, 68 (2008).</li><li>Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+and+Sgfl1+proteins+form+alternative+complexes+with+ENY2+proteins.">CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins.</a> Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).</li><li>Maksimenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+new+insulator+proteins,+Pita+and+ZIPIC,+target+CP190+to+chromatin.">Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin.</a> Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).</li><li>Sabirov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+functional+role+of+the+interaction+between+CP190+and+the+architectural+protein+Pita+in+Drosophila+melanogaster.">Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster.</a> Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16 (2021).</li><li>Dong, S., Provart, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyses+of+protein+interaction+networks+using+computational+tools.">Analyses of protein interaction networks using computational tools.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).</li></ol>

השיטה המתוארת מאפשרת בדיקה של אינטראקציות חלבון-חלבון שאינן ניתנות להרכבה יעילה במבחנה ודורשות ביטוי משותף. השיטה היא אחת הגישות המתאימות הבודדות לחקר חלבונים הטרודימריים, שגם הם מסוגלים להומודימריזציה, שכן כאשר הם מטוהרים בנפרד, חלבונים כאלה יוצרים הומודימרים יציבים שלרוב אינם יכ...

משיכה קונבנציונלית נמצאת בשימוש נרחב לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון1. עם זאת, חלבונים מטוהרים לעתים קרובות אינם מתקשרים ביעילות במבחנה2,3, וחלקם אינם מסיסים ללא שותפו הקושר 4,5. חלבונים כאלה עשויים לדרוש הרכבה משותפת או נוכחות של מלווים מולקולריים 5,6,7,8,9. מגבלה נוספת של משיכה קונבנציונלית היא בדיקת פעילות הטרומולטימריזציה אפשרית בין תחומים שיכולים להתקיים כהומו-אוליגומרים יציבים המורכבים בתרגום משותף 8,10, מכיוון שרבים מהם אינם יכולים להתנתק ולהתחבר מחדש במבחנה בזמן הדגירה. ביטוי משותף נמצא כיעיל בהתגברות על בעיות כאלה 3,11. ביטוי משותף באמצעות וקטורים תואמים בחיידקים שימש בהצלחה לטיהור קומפלקסים מקרומולקולריים מרובי יחידות גדולות, כולל קומפלקס דיכוי פוליקומב PRC212, RNA פולימראז II מתווך ראש מודול13, בקטריופאג T4 baseplate 14, SAGA קומפלקס deubiquitinylase מודול 15,16, ו ferritin 17. מקורות השכפול הנפוצים לביטוי משותף הם ColE1, p15A18, CloDF1319 ו-RSF20. במערכת הביטוי Duet הזמינה מסחרית, מקורות אלה משולבים עם גנים שונים של עמידות לאנטיביוטיקה ואתרי שיבוט מרובים נוחים ליצירת וקטורים פוליציסטרוניים, המאפשרים ביטוי של עד שמונה חלבונים. למקורות אלה יש מספרי העתקה שונים וניתן להשתמש בהם בשילובים שונים כדי להשיג רמות ביטוי מאוזנות של חלבוני מטרה21. כדי לבדוק אינטראקציות חלבון-חלבון, נעשה שימוש בתגי זיקה שונים; הנפוצים ביותר הם 6xHistidine, גלוטתיון-S-transferase (GST) וחלבון קושר מלטוז (MBP), שלכל אחד מהם זיקה ספציפית לשרף המתאים. GST ו- MBP גם משפרים את המסיסות והיציבות של חלבונים מתויגים22.
כמו כן פותחו מספר שיטות לביטוי משותף של חלבונים בתאים איקריוטים, הבולטת שבהן היא בדיקת שמרים דו-היברידית (Y2H)23. בדיקת Y2H זולה, קלה ומאפשרת בדיקה של אינטראקציות מרובות; עם זאת, זרימת העבודה שלו נמשכת יותר משבוע אחד. יש גם כמה בדיקות מבוססות תאי יונקים פחות נפוצות, לדוגמה, בדיקה פלואורסצנטית דו-היברידית (F2H)24 ובדיקת אינטראקציה חלבון-חלבון במערך התא (CAPPIA)25. בדיקת F2H מהירה יחסית, ומאפשרת לצפות באינטראקציות חלבונים בסביבה התאית הטבעית שלהם, אך כרוכה בשימוש בציוד הדמיה יקר. לכל השיטות הללו יש יתרון על פני ביטוי פרוקריוטי המספק את סביבת התרגום והקיפול האיקריוטית הילידית; עם זאת, הם מזהים אינטראקציה בעקיפין, או על ידי הפעלת שעתוק או על ידי העברת אנרגיה פלואורסצנטית, אשר לעתים קרובות מייצרת חפצים. כמו כן, תאים אאוקריוטים עשויים להכיל שותפים אחרים לאינטראקציה של חלבונים בעלי עניין, אשר יכולים להפריע לבדיקת אינטראקציות בינאריות בין חלבונים של איקריוטים גבוהים יותר.
המחקר הנוכחי מתאר שיטה לביטוי משותף חיידקי של חלבונים מתויגים באופן דיפרנציאלי ואחריו טכניקות משיכה קונבנציונליות. השיטה מאפשרת לחקור אינטראקציות בין חלבוני מטרה הדורשות ביטוי משותף. הוא חסכוני יותר בזמן בהשוואה למשיכה מסורתית, ומאפשר בדיקת אצווה של מטרות מרובות, מה שהופך אותו ליתרון ברוב המקרים. ביטוי משותף באמצעות וקטורים תואמים נוח יותר מאשר ביטוי משותף פוליציסטרוני מכיוון שהוא אינו דורש שלב שיבוט מייגע.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-ELEMENT probe</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>630-0586</td>
			<td>The high throughput 8-element sonicator probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose resin</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8021</td>
			<td>Resin for purification of MBP-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)&#160;</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69450-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R (Z605212)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A9782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione agarose</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>16100</td>
			<td>Resin for purification of GST-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni-NTA Superflow Agarose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25214</td>
			<td>Resin for purification of 6xHis-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>414753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pACYCDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71147</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCDFDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71340</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail VII</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539138</td>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSFDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71341</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VC505 sonicator</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>CV334</td>
			<td>Ultrasonic liquid processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A6285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pulldown assay coupled with co-expression in bacteria cells as a time-efficient tool for testing challenging protein-protein interactions

Pulldown הוא מבחן אינטראקציה חלבון-חלבון קל ובשימוש נרחב. עם זאת, יש לו מגבלות בחקר מתחמי חלבון שאינם מתאספים ביעילות במבחנה. קומפלקסים כאלה עשויים לדרוש הרכבה משותפת ונוכחות של מלווים מולקולריים; או שהם יוצרים אוליגומרים יציבים שאינם יכולים להתנתק ולהתחבר מחדש במבחנה , או שהם לא יציבים ללא שותף מחייב. כדי להתגבר על בעיות אלה, ניתן להשתמש בשיטה המבוססת על ביטוי משותף חיידקי של חלבונים מתויגים באופן דיפרנציאלי באמצעות קבוצה של וקטורים תואמים ואחריו טכניקות משיכה קונבנציונליות. זרימת העבודה חסכונית יותר בזמן בהשוואה למשיכה מסורתית מכיוון שהיא חסרה את השלבים הגוזלים זמן של טיהור נפרד של חלבונים המקיימים אינטראקציה והדגירה הבאה שלהם. יתרון נוסף הוא יכולת רבייה גבוהה יותר בשל מספר שלבים קטן משמעותית ופרק זמן קצר יותר שבו חלבונים הקיימים בסביבת מבחנה נחשפים לפראונוליזה ולחמצון. השיטה יושמה בהצלחה לחקר מספר אינטראקציות חלבון-חלבון כאשר טכניקות אחרות במבחנה נמצאו בלתי מתאימות. השיטה יכולה לשמש לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון אצווה. תוצאות מייצגות מוצגות עבור מחקרים על אינטראקציות בין תחום BTB וחלבונים בעלי הפרעה פנימית, ועל הטרודימרים של תחומים הקשורים לאצבעות אבץ.

השיטה המתוארת שימשה באופן שגרתי עם מטרות רבות ושונות. להלן כמה תוצאות מייצגות שככל הנראה לא ניתן להשיג באמצעות טכניקות משיכה קונבנציונליות. הראשון הוא המחקר של דימריזציה ספציפית של ZAD (תחום הקשור לאבץ באצבע)11. ZADs יוצרים דימרים יציבים וספציפיים, כאשר הטרודימרים אפשריים רק בין ?...

Watch this Scientific Journal Video about Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions at JoVE.com

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

כאן, אנו מתארים שיטה לביטוי משותף חיידקי של חלבונים מתויגים באופן דיפרנציאלי באמצעות קבוצה של וקטורים תואמים, ואחריה טכניקות משיכה קונבנציונליות לחקר קומפלקסים חלבוניים שאינם יכולים להרכיב במבחנה.

בדיקת משיכה בשילוב עם ביטוי משותף בתאי חיידקים ככלי חסכוני בזמן לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון מאתגרות

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

שיטה זו מאפשרת ללמוד תצורות של קומפלקסים חלבונים הדורשים ביטוי משותף עבור דגימות בדיקה יעילות, כגון היווצרות של הטרודימרים. הפוטנציאל הסופי העיקרי של שיטה זו הוא ניצול הביטוי המשותף של חלבונים שנחקרו באופן דיפרנציאלי באמצעות שילובים של וקטורים תואמים כדי לקדם הרכבה מורכבת יעילה, יחד עם זרימת עבודה חסכונית בזמן ומדרגיות המאפשרת בדיקת טלאים מהירה של אינטראקציות מרובות. שיטה זו יכולה לשמש גם לסינון מהיר של ביטוי חלבון אופטימלי ותנאי טיהור.הדגמה חזותית מסייעת לבצע כראוי שלבים קריטיים של הפרוטוקול, כגון הגדרת ביטוי משותף, הפרעה לתא ושלבי משיכה עוקבים. כדי להתחיל, לגדל Escherichia coli BL21(DE3) זן ב Luria-Bertani, או LB, מדיה ב 37 מעלות צלזיוס לצפיפות אופטית, או OD, של 0.1 עד 0.2. צנטריפוגה מיליליטר אחד של תרחיף החיידקים למשך דקה אחת ב 9, 000 G בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant.לאחר מכן, הוסיפו 0.5 מיליליטר של מאגר טרנספורמציה קר כקרח, או שחפת, ודגרו במשך 10 דקות על קרח. בסוף הדגירה, צנטריפוגה במשך 30 שניות ב 8, 000 G בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant. לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטר של חיץ שחפת, 100 ננוגרם מכל וקטור, ודגרו במשך 30 דקות על קרח.מחממים בחום של 42 מעלות צלזיוס למשך 150 שניות, ואז מצננים על קרח למשך דקה. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של LB מדיה ללא אנטיביוטיקה לדגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה ומשהה מחדש את הגלולה ב -100 מיקרוליטר של מדיה LB לפני ציפוי התרחיף על צלחת אגר LB המכילה 0.5% גלוקוז ואנטיביוטיקה מתאימה.דוגרים על הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את התאים מהצלחת עם שני מיליליטר של מדיה LB לתוך 50 מיליליטר של מדיה LB עם אנטיביוטיקה מתאימה. הוסף יוני מתכת או גורמים משלימים ידועים אחרים לפני אחסון aliquot עם 20% גליצרול במינוס 70 מעלות צלזיוס עבור ניסויים הבאים.גדל את התאים עם סיבוב קבוע של 220 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס OD של 0.5 עד 0.7. מצננים את התרבית לטמפרטורת החדר ומוסיפים IPTG לריכוז סופי של מילימול. אחסן aliquot 20 מיקרוליטר של תרחיף התא כבקרה של הדגימה uninduced.דוגרים על התאים למשך הלילה ב-220 סל"ד ב-18 מעלות צלזיוס. למחרת, חלקו את התרחיף החיידקי לשני חלקים ואחסנו אליציטוטים של 20 מיקרוליטר כדי לאשר את ביטוי החלבון. צנטריפוגה את השעיית התא הנותרת ב 4, 000 G במשך 15 דקות.לבדיקת משיכה, יש להשהות מחדש את הכדוריות במיליליטר אחד של חיץ ליזה קר כקרח עם מעכבי פרוטאז וחומרים מחזרים שנוספו מיד לפני הניסוי. התאם את הרכב החיץ עבור החלבונים שנבדקו. לשבש את התאים על ידי סוניקציה על קרח ולאחסן aliquot 20 מיקרוליטר עבור אלקטרופורזה.צנטריפוגה ב 16, 000 G במשך 30 דקות ולאסוף 20 מיקרוליטר של lysate מובהר עבור אלקטרופורזה. אזנו את השרף עם מיליליטר אחד של חיץ ליזה קר כקרח למשך 10 דקות, ואז צנטריפוגה ב -2, 000 גרם למשך 30 שניות והשליכו את הסופרנטנט. מוסיפים לליזטים של תאים לשרף ודגרים במשך 10 דקות בסיבוב קבוע של 15 סל"ד.לאחר מכן, צנטריפוגה ולהשליך את supernatant לפני איסוף 20 מיקרוליטר של החלק unbound לניתוח. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של חיץ כביסה קר כקרח ודגרו במשך דקה אחת. שוב, צנטריפוגה ולהשליך את הסופרנטנט.לאחר מכן, בצעו שתי שטיפות ארוכות עם חיץ כביסה קר כקרח. לאחר השטיפה השנייה, לנטרל את החלבונים הקשורים עם 50 מיקרוליטר של חיץ elution בשייקר ב 1, 200 סל"ד בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לנתח את חלבונים מדולל עם אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד SDS.מחקרים על תחום הקשור לאצבעות אבץ, או ZAD, הומו-דימריזציה בחלבון קושר מלטוז, או MBP, ומבחני משיכה 6xHistidine מוצגים כאן. הביטוי המשותף של MBP ו- Thioredoxin 6xHistidine-fused ZADs מראה פעילות הומודימריזציה טובה וניתנת לשחזור, ומופיע כפס נוסף בתוצאות SDS-PAGE של מבחן משיכת MBP. דוגמה נוספת לשימוש בשיטה לחקר היווצרות מורכבת חלופית מוצגת כאן.במבחן הביטוי המשותף, ENY2 המתויג 6xHistidine קיים אינטראקציה הן עם Sgf11 המתויג GST והן עם MBP-CTCF, אך לא היה GST-Sgf11 נוכח במשיכות MBP ולהיפך. השוואה שלב אחר שלב של מרווחי הזמן הנדרשים בזרימת העבודה של מבחן המשיכה הקונבנציונלי בהשוואה למשיכה למטה המצומדת לביטוי משותף מוצגת כאן. התוצאות של שימוש בשתי הטכניקות כדי לחקור את אותה אינטראקציה בין תחום BTB של חלבון CP190 לבין תחום C-terminal המתויג GST של חלבון Drosophila CTCF מוצגות כאן.הבחירה הנכונה של בדיקת זיקה ומסיסות, Thioredoxin, GST או MBP, היא קריטית לביצוע יעיל של הבדיקה. צעד קריטי נוסף הוא שיבוש מהיר ואחיד של התאים. מומלץ מאוד להשתמש בבדיקות סוניקטור מרובות חוד.שיטה זו מאפשרת מחקר ישיר של היווצרות הטרודימרים בין תחומי חלבונים שאחרת יוצרים הומודימרים שלא היו מתנתקים במהלך הדגירה של חלבונים מטוהרים במבחן משיכה קונבנציונלי.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Anisotropy קרינה ככלי לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

ניצול במגרש משחררים אתילן, 2-Chloroethylphosphonic חומצה, ככלי לחקר תגובה אתילן בחיידקים

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

חודר Biotinylated תא פפטידים ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems

וריאציות על שלילי כתם מיקרוסקופ אלקטרונים שיטות: כלים בהתמודדות עם אתגר מערכות

Negative stain electron microscopy (EM) allows relatively simple and quick observation of macromolecules and macromolecular complexes through the use of ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

יישום של ביואולייר אינטרפרומטריה (בלי) ללימוד אינטראקציות חלבונים-חלבונים בתמלול

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

אינטראקציות עם חדירות ממברנה של המיטותית המוח על ידי עמילואיד Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

טיהור MS2-זיקה בשילוב עם רצף RNA בחיידקים גראם חיוביים

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...