Name: pulldown assay coupled with co-expression in bacteria cells as a time-efficient tool for testing challenging protein-protein interactions
Uploaded: 2022-12-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions at JoVE.com

इस काम को रूसी साइंस फाउंडेशन परियोजनाओं 19-74-30026 (विधि विकास और सत्यापन) और 19-74-10099 (प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन परख) द्वारा समर्थित किया गया था; और रूसी संघ के विज्ञान और उच्च शिक्षा मंत्रालय द्वारा अनुदान 075-15-2019-1661 (प्रतिनिधि प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का विश्लेषण)।

विधि वर्कफ़्लो का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा 1 में दिखाया गया है।
1. ई कोलाई का सह-परिवर्तन
<ol><li>मानक क्लोनिंग विधियों का उपयोग करके लक्ष्य प्रोटीन के लिए अभिव्यक्ति ?...

<ol>
	<li>Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions:+Pulldown+assays.">Protein-protein interactions: Pulldown assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).</li><li>Rose, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+dimerization,+coactivator+recognition+and+MODY3+mutations+in+HNF-1alpha.">Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).</li><li>Bonchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+diversity+and+homodimerization+specificity+of+zinc-finger-associated+domains+in+Drosophila.">Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila.</a> Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).</li><li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors.">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112 (2), 193-205 (2003).</li><li>Badonyi, M., Marsh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+protein+complex+interfaces+have+evolved+to+promote+co-translational+assembly.">Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly.</a> Elife. 11, 79602 (2022).</li><li>Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cotranslational+maturation+of+newly+synthesized+proteins.">Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins.</a> Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).</li><li>Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cotranslational+protein+maturation+in+bacteria.">Mechanisms of cotranslational protein maturation in bacteria.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 689755 (2021).</li><li>Shiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+assembly+of+protein+complexes+in+eukaryotes+revealed+by+ribosome+profiling.">Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling.</a> Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).</li><li>Shieh, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operon+structure+and+co-translational+subunit+association+direct+protein+assembly+in+bacteria.">Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria.</a> Science. 350 (6261), 678-680 (2015).</li><li>Bertolini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+nascent+proteins+translated+by+adjacent+ribosomes+drive+homomer+assembly.">Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly.</a> Science. 371 (6524), 57-64 (2021).</li><li>Bonchuk, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+highly+similar+spatial+organization+of+zinc-finger+associated+domains+with+a+very+low+sequence+similarity.">Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity.</a> Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).</li><li>Justin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+oncogenic+histone+H3K27M+inhibition+of+human+polycomb+repressive+complex+2.">Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2.</a> Nature Communications. 7, 11316 (2016).</li><li>Lariviere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+mediator+head+module.">Structure of the mediator head module.</a> Nature. 492 (7429), 448-451 (2012).</li><li>Taylor, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+T4+baseplate+and+its+function+in+triggering+sheath+contraction.">Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction.</a> Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).</li><li>Samara, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+assembly+and+function+of+the+SAGA+deubiquitinating+module.">Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module.</a> Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).</li><li>Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+assembly+and+activation+of+the+heterotetrameric+SAGA+histone+H2B+deubiquitinase+module.">Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module.</a> Cell. 141 (4), 606-617 (2010).</li><li>Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+ferritin:+modulation+of+subunit+stoichiometry+in+bacterial+expression+systems.">Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems.</a> Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).</li><li>Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+replication+of+plasmid+p15A+and+comparative+studies+on+the+nucleotide+sequences+around+the+origin+of+related+plasmids.">The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids.</a> Cell. 32 (1), 119-129 (1983).</li><li>Nijkamp, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+nucleotide+sequence+of+the+bacteriocinogenic+plasmid+CloDF13.">The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13.</a> Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).</li><li>Som, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+replication+of+Escherichia+coli+plasmid+RSF+1030.">Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030.</a> Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).</li><li>Tsao, K. L., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+production+of+two+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli+by+manipulating+plasmid+copy+number:+high-level+expression+of+heterodimeric+Ras+farnesyltransferase.">Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase.</a> Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).</li><li>Nallamsetty, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubility-enhancing+proteins+MBP+and+NusA+play+a+passive+role+in+the+folding+of+their+fusion+partners.">Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners.</a> Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).</li><li>Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+two-hybrid+assay+to+identify+interacting+proteins.">Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70 (2019).</li><li>Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+two-hybrid+(F2H)+assay+for+direct+analysis+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).</li><li>Fiebitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mammalian+two-hybrid+screening+for+protein-protein+interactions+using+transfected+cell+arrays.">High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays.</a> BMC Genomics. 9, 68 (2008).</li><li>Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+and+Sgfl1+proteins+form+alternative+complexes+with+ENY2+proteins.">CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins.</a> Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).</li><li>Maksimenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+new+insulator+proteins,+Pita+and+ZIPIC,+target+CP190+to+chromatin.">Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin.</a> Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).</li><li>Sabirov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+functional+role+of+the+interaction+between+CP190+and+the+architectural+protein+Pita+in+Drosophila+melanogaster.">Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster.</a> Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16 (2021).</li><li>Dong, S., Provart, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyses+of+protein+interaction+networks+using+computational+tools.">Analyses of protein interaction networks using computational tools.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).</li></ol>

वर्णित विधि प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के परीक्षण की अनुमति देती है जिसे विट्रो में कुशलतापूर्वक इकट्ठा नहीं किया जा सकता है और सह-अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है। यह विधि हेटेरोडिमराइजिंग प्रोटी...

प्रोटीन-प्रोटीनइंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए पारंपरिक पुलडाउन का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। हालांकि, शुद्ध प्रोटीन अक्सर विट्रो 2,3 में प्रभावी ढंग से बातचीत नहीं करते हैं, और उनमें से कुछ अपने बाध्यकारी साथी 4,5 के बिना अघुलनशील होते हैं। ऐसे प्रोटीन को सह-ट्रांसलेशनल असेंबली या आणविक चैपरोन 5,6,7,8,9 की उपस्थिति की आवश्यकता हो सकती है। पारंपरिक पुलडाउन की एक और सीमा उन डोमेन के बीच संभावित हेटरोमल्टीमराइजेशन गतिविधि का परीक्षण है जो स्थिर होमो-ओलिगोमर्स के रूप में 8,10 को सह-अनुवाद के रूप में मौजूद हो सकते हैं, क्योंकि उनमें से कई इनक्यूबेशन समय के दौरान विट्रो में अलग और फिर से जुड़ नहीं सकते हैं। सह-अभिव्यक्ति को ऐसी समस्याओं पर काबू पाने में उपयोगी पाया गया 3,11. बैक्टीरिया में संगत वैक्टर का उपयोग करके सह-अभिव्यक्ति का उपयोग बड़े मल्टी-सबयूनिट मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स को शुद्ध करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया था, जिसमें पॉलीकॉम्ब दमनकारी कॉम्प्लेक्स पीआरसी 212, आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय मध्यस्थ हेड मॉड्यूल13, बैक्टीरियोफेज टी 4 बेसप्लेट14, एसएजीए कॉम्प्लेक्स डियूबिकिटिनाइलेज मॉड्यूल15,16 और फेरिटिन17 शामिल थे। आमतौर पर सह-अभिव्यक्ति के लिए उपयोग की जाने वाली प्रतिकृति उत्पत्ति कोलई 1, पी15 ए 18, क्लोडीएफ13 19 और आरएसएफ20 हैं। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डुएट अभिव्यक्ति प्रणाली में, इन उत्पत्ति को विभिन्न एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन और पॉलीसिस्ट्रोनिक वैक्टर का उत्पादन करने के लिए सुविधाजनक कई क्लोनिंग साइटों के साथ जोड़ा जाता है, जिससे आठ प्रोटीन तक की अभिव्यक्ति की अनुमति मिलती है। इन उत्पत्ति में अलग-अलग प्रतिलिपि संख्याएं हैं और लक्ष्य प्रोटीन21 के संतुलित अभिव्यक्ति स्तरों को प्राप्त करने के लिए अलग-अलग संयोजनों में उपयोग किया जा सकता है। प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का परीक्षण करने के लिए, विभिन्न आत्मीयता टैग का उपयोग किया जाता है; सबसे आम 6xHistidine, ग्लूटाथियोन-एस-ट्रांसफेरेज़ (GST), और माल्टोज-बाइंडिंग प्रोटीन (MBP) हैं, जिनमें से प्रत्येक का संबंधित राल के लिए एक विशिष्ट संबंध है। जीएसटी और एमबीपी टैग किए गए प्रोटीन की घुलनशीलता और स्थिरता को भीबढ़ाते हैं।
यूकेरियोटिक कोशिकाओं में प्रोटीन सह-अभिव्यक्ति से जुड़े कई तरीके भी विकसित किए गए हैं, जिनमें से सबसे प्रमुख खमीर दो-संकर परख (वाई 2 एच) 23 है। वाई 2 एच परख सस्ता, आसान है, और कई इंटरैक्शन के परीक्षण की अनुमति देता है; हालाँकि, इसका वर्कफ़्लो पूरा होने में 1 सप्ताह से अधिक समय लगता है। कुछ कम बार उपयोग किए जाने वाले स्तनधारी सेल-आधारित परख भी हैं, उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट टू-हाइब्रिड परख (एफ 2 एच) 24 और सेल सरणी प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन परख (सीएपीपीआईए)25। एफ 2 एच परख अपेक्षाकृत तेज है, जिससे उनके मूल सेलुलर वातावरण में प्रोटीन इंटरैक्शन का निरीक्षण करने की अनुमति मिलती है, लेकिन इसमें महंगे इमेजिंग उपकरणों का उपयोग करना शामिल है। इन सभी विधियों में प्रोकैरियोटिक अभिव्यक्ति पर एक लाभ है जो देशी यूकेरियोटिक अनुवाद और तह वातावरण प्रदान करता है; हालांकि, वे अप्रत्यक्ष रूप से बातचीत का पता लगाते हैं, या तो ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण या फ्लोरोसेंट ऊर्जा हस्तांतरण द्वारा, जो अक्सर कलाकृतियों का उत्पादन करता है। इसके अलावा, यूकेरियोटिक कोशिकाओं में रुचि के प्रोटीन के अन्य इंटरैक्शन पार्टनर हो सकते हैं, जो उच्च यूकेरियोट्स के प्रोटीन के बीच बाइनरी इंटरैक्शन के परीक्षण में हस्तक्षेप कर सकते हैं।
वर्तमान अध्ययन में पारंपरिक पुलडाउन तकनीकों के बाद अलग-अलग टैग किए गए प्रोटीन की जीवाणु सह-अभिव्यक्ति के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। विधि लक्ष्य प्रोटीन के बीच बातचीत का अध्ययन करने की अनुमति देती है जिसके लिए सह-अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है। यह पारंपरिक पुलडाउन की तुलना में अधिक समय-कुशल है, जिससे कई लक्ष्यों के बैच परीक्षण की अनुमति मिलती है, जो इसे ज्यादातर मामलों में फायदेमंद बनाती है। संगत वैक्टर का उपयोग करके सह-अभिव्यक्ति पॉलीसिस्ट्रोनिक सह-अभिव्यक्ति की तुलना में अधिक सुविधाजनक है क्योंकि इसके लिए श्रमसाध्य क्लोनिंग चरण की आवश्यकता नहीं होती है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-ELEMENT probe</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>630-0586</td>
			<td>The high throughput 8-element sonicator probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose resin</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8021</td>
			<td>Resin for purification of MBP-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)&#160;</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69450-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R (Z605212)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A9782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione agarose</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>16100</td>
			<td>Resin for purification of GST-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni-NTA Superflow Agarose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25214</td>
			<td>Resin for purification of 6xHis-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>414753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pACYCDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71147</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCDFDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71340</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail VII</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539138</td>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSFDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71341</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VC505 sonicator</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>CV334</td>
			<td>Ultrasonic liquid processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A6285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pulldown assay coupled with co-expression in bacteria cells as a time-efficient tool for testing challenging protein-protein interactions

पुलडाउन एक आसान और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन परख है। हालांकि, प्रोटीन कॉम्प्लेक्स का अध्ययन करने में इसकी सीमाएं हैं जो विट्रो में प्रभावी ढंग से इकट्ठा नहीं होती हैं। ऐसे परिसरों को सह-ट्रांसलेशनल असेंबली और आणविक चैपरोन की उपस्थिति की आवश्यकता हो सकती है; या तो वे स्थिर ऑलिगोमर्स बनाते हैं जो विट्रो में अलग और फिर से जुड़ नहीं सकते हैं या बाध्यकारी साथी के बिना अस्थिर हैं। इन समस्याओं को दूर करने के लिए, पारंपरिक पुलडाउन तकनीकों के बाद संगत वैक्टर के एक सेट का उपयोग करके अलग-अलग टैग किए गए प्रोटीन की जीवाणु सह-अभिव्यक्ति के आधार पर एक विधि का उपयोग करना संभव है। वर्कफ़्लो पारंपरिक पुलडाउन की तुलना में अधिक समय-कुशल है क्योंकि इसमें बातचीत करने वाले प्रोटीन और उनके निम्नलिखित इनक्यूबेशन के अलग-अलग शुद्धिकरण के समय लेने वाले चरणों का अभाव है। एक और लाभ यह है कि चरणों की काफी कम संख्या और कम समय के कारण उच्च प्रजनन क्षमता है जिसमें इन विट्रो वातावरण के भीतर मौजूद प्रोटीन प्रोटियोलिसिस और ऑक्सीकरण के संपर्क में आते हैं। इस विधि को कई प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया था जब अन्य इन विट्रो तकनीकों को अनुपयुक्त पाया गया था। विधि का उपयोग बैच परीक्षण प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के लिए किया जा सकता है। प्रतिनिधि परिणाम बीटीबी डोमेन और आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन और जिंक-फिंगर से जुड़े डोमेन के हेटेरोडिमर्स के बीच बातचीत के अध्ययन के लिए दिखाए गए हैं।

वर्णित विधि का उपयोग नियमित रूप से कई अलग-अलग लक्ष्यों के साथ किया गया था। यहां प्रस्तुत कुछ प्रतिनिधि परिणाम हैं जो संभवतः पारंपरिक पुलडाउन तकनीकों का उपयोग करके प्राप्त नहीं किए जा सकते हैं। पहला वि...

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Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

यहां, हम संगत वैक्टर के एक सेट का उपयोग करके अलग-अलग टैग किए गए प्रोटीन की जीवाणु सह-अभिव्यक्ति के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं, इसके बाद प्रोटीन कॉम्प्लेक्स का अध्ययन करने के लिए पारंपरिक पुलडाउन तकनीकें हैं जो विट्रो में इकट्ठा नहीं हो सकती हैं।

चुनौतीपूर्ण प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के परीक्षण के लिए एक समय-कुशल उपकरण के रूप में बैक्टीरिया कोशिकाओं में सह-अभिव्यक्ति के साथ युग्मित पुलडाउन परख

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

यह विधि प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की संरचनाओं का अध्ययन करने की अनुमति देती है जिन्हें कुशल परीक्षण नमूनों के लिए सह-अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है, जैसे कि हेटेरोडीमर का गठन। इस पद्धति की मुख्य अंतिम क्षमता कुशल जटिल असेंबली को बढ़ावा देने के लिए संगत वैक्टर के संयोजन का उपयोग करके अलग-अलग टैग किए गए अध्ययन किए गए प्रोटीन की सह-अभिव्यक्ति का फायदा उठा रही है, साथ ही समय-कुशल वर्कफ़्लो और स्केलेबिलिटी कई इंटरैक्शन के तेजी से पैच-परीक्षण की अनुमति देती है। इस विधि का उपयोग इष्टतम प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण स्थितियों की तेजी से जांच के लिए भी किया जा सकता है।दृश्य प्रदर्शन प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों जैसे सह-अभिव्यक्ति सेटअप, सेल व्यवधान और बाद के पुलडाउन चरणों को सही ढंग से करने में मदद करता है। शुरू करने के लिए, लुरिया-बर्टानी, या एलबी, मीडिया में एस्चेरिचिया कोलाई बीएल 21 (डीई 3) स्ट्रेन को 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.1 से 0.2 के ऑप्टिकल घनत्व, या ओडी तक बढ़ाएं। चार डिग्री सेल्सियस पर 9,000 जी पर एक मिनट के लिए बैक्टीरियल सस्पेंशन के एक मिलीलीटर को सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट को छोड़ दें।फिर, 0.5 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा परिवर्तन बफर, या टीबी जोड़ें, और बर्फ पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के अंत में, चार डिग्री सेल्सियस पर 8,000 जी पर 30 सेकंड के लिए सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट को छोड़ दें। फिर, टीबी बफर के 100 माइक्रोलीटर, प्रत्येक वेक्टर के 100 नैनोग्राम जोड़ें, और बर्फ पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।150 सेकंड के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें, फिर एक मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा करें। इसके बाद, एंटीबायोटिक दवाओं के बिना एलबी मीडिया का एक मिलीलीटर जोड़ें और 90 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, सेंट्रीफ्यूज और 0.5% ग्लूकोज और संबंधित एंटीबायोटिक दवाओं वाले एलबी एगर प्लेट पर निलंबन चढ़ाने से पहले एलबी मीडिया के 100 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से निलंबित किया।प्लेट को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। अगले दिन, प्लेट से दो मिलीलीटर एलबी मीडिया के साथ कोशिकाओं को संबंधित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ 50 मिलीलीटर एलबी मीडिया में फ्लश करें। बाद के प्रयोगों के लिए माइनस 70 डिग्री सेल्सियस पर 20% ग्लिसरॉल के साथ एक एलिकोट को संग्रहीत करने से पहले धातु आयनों या अन्य ज्ञात सह-कारकों को जोड़ें।कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 220 आरपीएम के निरंतर रोटेशन के साथ 0.5 से 0.7 के ओडी तक बढ़ाएं। कमरे के तापमान पर संस्कृति को ठंडा करें और आईपीटीजी को एक मिलीमोल की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें। अप्रेरित नमूने के नियंत्रण के रूप में सेल निलंबन का 20-माइक्रोलीटर एलिकोट स्टोर करें।कोशिकाओं को रात भर 220 आरपीएम पर 18 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। अगले दिन, बैक्टीरियल निलंबन को दो भागों में विभाजित करें और प्रोटीन अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए 20-माइक्रोलीटर एलिकोट स्टोर करें। 15 मिनट के लिए 4,000 जी पर शेष सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।पुलडाउन परख के लिए, प्रोटीज इनहिबिटर के साथ बर्फ-ठंडे लाइसिस बफर के एक मिलीलीटर में छर्रों को फिर से निलंबित करें और प्रयोग से तुरंत पहले जोड़े गए एजेंटों को कम करें। परीक्षण किए गए प्रोटीन के लिए बफर संरचना समायोजित करें। बर्फ पर सोनिकेशन द्वारा कोशिकाओं को बाधित करें और वैद्युतकणसंचलन के लिए 20-माइक्रोलीटर एलिकोट स्टोर करें।30 मिनट के लिए 16,000 जी पर सेंट्रीफ्यूज और वैद्युतकणसंचलन के लिए स्पष्ट लाइसेट के 20 माइक्रोलीटर एकत्र करें। राल को 10 मिनट के लिए एक मिलीलीटर आइस-कोल्ड लाइसिस बफर के साथ बराबर करें, फिर 30 सेकंड के लिए 2,000 जी पर सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें। राल में सेल लाइसेट जोड़ें और 15 आरपीएम के निरंतर रोटेशन पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।फिर, विश्लेषण के लिए अनबाउंड अंश के 20 माइक्रोलीटर एकत्र करने से पहले सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट को छोड़ दें। इसके बाद, एक मिलीलीटर आइस-कोल्ड वॉश बफर जोड़ें और एक मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। फिर, सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट को छोड़ दें।फिर, आइस-कोल्ड वॉश बफर के साथ दो लंबे धोवे करें। दूसरे धोने के बाद, 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 1,200 आरपीएम पर एक शेकर में क्षालन बफर के 50 माइक्रोलीटर के साथ बंधे प्रोटीन को घुमाएं। एसडीएस पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन के साथ इल्यूटेड प्रोटीन का विश्लेषण करें।जिंक फिंगर से जुड़े डोमेन, या जेडएडी, माल्टोज-बाइंडिंग प्रोटीन, या एमबीपी में होमो-डिमराइजेशन और 6xHistidine पुलडाउन परख के अध्ययन यहां दिखाए गए हैं। एमबीपी और थियोरेडॉक्सिन 6xHistidine-फ्यूज्ड जेडएडी की सह-अभिव्यक्ति अच्छी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होमोडीमराइजेशन गतिविधि दिखाती है, जो एमबीपी पुलडाउन परख के एसडीएस-पेज परिणामों में एक अतिरिक्त बैंड के रूप में दिखाई देती है। वैकल्पिक जटिल गठन का अध्ययन करने के लिए विधि का उपयोग करने का एक और उदाहरण यहां दिखाया गया है।सह-अभिव्यक्ति परख में, 6xHistidine-tagged ENY2 ने जीएसटी-टैग किए गए SGF11 और MBP-CTCF दोनों के साथ बातचीत की, लेकिन MBP पुलडाउन में कोई GST-SGF11 मौजूद नहीं था और इसके विपरीत। सह-अभिव्यक्ति के साथ युग्मित पुलडाउन की तुलना में पारंपरिक पुलडाउन परख के वर्कफ़्लो में आवश्यक समय अंतराल की चरण-दर-चरण तुलना यहां दिखाई गई है। सीपी 190 प्रोटीन के बीटीबी डोमेन और ड्रोसोफिला सीटीसीएफ प्रोटीन के जीएसटी-टैग किए गए सी-टर्मिनल डोमेन के बीच एक ही बातचीत का अध्ययन करने के लिए दोनों तकनीकों का उपयोग करने के परिणाम यहां दिखाए गए हैं।आत्मीयता और घुलनशीलता परीक्षण, थियोरेडॉक्सिन, जीएसटी, या एमबीपी का सही विकल्प, परख के कुशल निष्पादन के लिए महत्वपूर्ण है। एक और महत्वपूर्ण कदम तेज और समान सेल व्यवधान है। मल्टी-टिप सोनिकेटर जांच का उपयोग करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है।यह विधि प्रोटीन डोमेन के बीच हेटेरोडिमर गठन के प्रत्यक्ष अध्ययन की अनुमति देती है जो अन्यथा होमोडीमर बनाती है जो पारंपरिक पुलडाउन परख में शुद्ध प्रोटीन के इनक्यूबेशन के दौरान अलग नहीं होगी।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

एक उपकरण प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के रूप में प्रतिदीप्ति एनिसोट्रॉपिक

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

बैक्टीरिया में इथीलीन प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए एथिलीन रिहा कंपाउंड, 2-Chloroethylphosphonic एसिड, का उपयोग एक उपकरण के रूप में

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

पाड़ Liposomes का उपयोग लिपिड-समीपस्थ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पुनर्गठित करने<em&gt; इन विट्रो</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

प्रोटीन संरचना और गतिशीलता के अध्ययन के लिए समय का समाधान electrospray ionization हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylated सेल-मर्मज्ञ पेप्टाइड्स Intracellular प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems

नकारात्मक दाग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तरीकों पर रूपांतरों: चुनौतीपूर्ण प्रणालियों से निपटने के लिए उपकरण

Negative stain electron microscopy (EM) allows relatively simple and quick observation of macromolecules and macromolecular complexes through the use of ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

सेल-सेल संपर्कों में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की एक प्रतिदीप्ति अस्थिरता स्पेक्ट्रोस्कोपी परख

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

ट्रांसक्रिप्शन में प्रोटीन-प्रोटिन इंटरेक्शन के अध्ययन के लिए बायोलेयर इंटरफेरोमेट्री (बीआईएलआई) का अनुप्रयोग

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

एमीलॉयड फाइब्रिल्स द्वारा मस्तिष्क माइटोकोंड्रिया के साथ और झिल्ली permeabilization के साथ बातचीत

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

एमएस 2-आत्मीयता शुद्धि ग्राम-सकारात्मक बैक्टीरिया में आरएनए अनुक्रमण के साथ मिलकर

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...