Name: pulldown assay coupled with co-expression in bacteria cells as a time-efficient tool for testing challenging protein-protein interactions
Uploaded: 2022-12-23T14:00:00
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この研究は、ロシア科学財団のプロジェクト19-74-30026(メソッド開発と検証)および19-74-10099(タンパク質間相互作用アッセイ)によってサポートされました。ロシア連邦科学高等教育省による助成金075-15-2019-1661(代表的なタンパク質間相互作用の分析)。

メソッドワークフローの概略図を 図1に示します。
1. 大腸菌の共形質転換
<ol><li>標準的なクローニング法を用いて標的タンパク質の発現ベクターを調製します。 注:通常、GST/MBPタグ付きタンパク質の発現にはアンピシリン耐性遺伝子とColE1起源を持つ従来のpGEX/pMALベクターを使用し、6xHisタグタンパク質を発現させるにはp15Aま...

<ol>
	<li>Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions:+Pulldown+assays.">Protein-protein interactions: Pulldown assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).</li><li>Rose, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+dimerization,+coactivator+recognition+and+MODY3+mutations+in+HNF-1alpha.">Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).</li><li>Bonchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+diversity+and+homodimerization+specificity+of+zinc-finger-associated+domains+in+Drosophila.">Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila.</a> Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).</li><li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors.">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112 (2), 193-205 (2003).</li><li>Badonyi, M., Marsh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+protein+complex+interfaces+have+evolved+to+promote+co-translational+assembly.">Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly.</a> Elife. 11, 79602 (2022).</li><li>Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cotranslational+maturation+of+newly+synthesized+proteins.">Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins.</a> Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).</li><li>Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cotranslational+protein+maturation+in+bacteria.">Mechanisms of cotranslational protein maturation in bacteria.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 689755 (2021).</li><li>Shiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+assembly+of+protein+complexes+in+eukaryotes+revealed+by+ribosome+profiling.">Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling.</a> Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).</li><li>Shieh, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operon+structure+and+co-translational+subunit+association+direct+protein+assembly+in+bacteria.">Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria.</a> Science. 350 (6261), 678-680 (2015).</li><li>Bertolini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+nascent+proteins+translated+by+adjacent+ribosomes+drive+homomer+assembly.">Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly.</a> Science. 371 (6524), 57-64 (2021).</li><li>Bonchuk, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+highly+similar+spatial+organization+of+zinc-finger+associated+domains+with+a+very+low+sequence+similarity.">Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity.</a> Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).</li><li>Justin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+oncogenic+histone+H3K27M+inhibition+of+human+polycomb+repressive+complex+2.">Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2.</a> Nature Communications. 7, 11316 (2016).</li><li>Lariviere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+mediator+head+module.">Structure of the mediator head module.</a> Nature. 492 (7429), 448-451 (2012).</li><li>Taylor, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+T4+baseplate+and+its+function+in+triggering+sheath+contraction.">Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction.</a> Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).</li><li>Samara, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+assembly+and+function+of+the+SAGA+deubiquitinating+module.">Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module.</a> Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).</li><li>Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+assembly+and+activation+of+the+heterotetrameric+SAGA+histone+H2B+deubiquitinase+module.">Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module.</a> Cell. 141 (4), 606-617 (2010).</li><li>Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+ferritin:+modulation+of+subunit+stoichiometry+in+bacterial+expression+systems.">Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems.</a> Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).</li><li>Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+replication+of+plasmid+p15A+and+comparative+studies+on+the+nucleotide+sequences+around+the+origin+of+related+plasmids.">The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids.</a> Cell. 32 (1), 119-129 (1983).</li><li>Nijkamp, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+nucleotide+sequence+of+the+bacteriocinogenic+plasmid+CloDF13.">The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13.</a> Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).</li><li>Som, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+replication+of+Escherichia+coli+plasmid+RSF+1030.">Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030.</a> Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).</li><li>Tsao, K. L., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+production+of+two+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli+by+manipulating+plasmid+copy+number:+high-level+expression+of+heterodimeric+Ras+farnesyltransferase.">Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase.</a> Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).</li><li>Nallamsetty, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubility-enhancing+proteins+MBP+and+NusA+play+a+passive+role+in+the+folding+of+their+fusion+partners.">Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners.</a> Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).</li><li>Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+two-hybrid+assay+to+identify+interacting+proteins.">Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70 (2019).</li><li>Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+two-hybrid+(F2H)+assay+for+direct+analysis+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).</li><li>Fiebitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mammalian+two-hybrid+screening+for+protein-protein+interactions+using+transfected+cell+arrays.">High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays.</a> BMC Genomics. 9, 68 (2008).</li><li>Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+and+Sgfl1+proteins+form+alternative+complexes+with+ENY2+proteins.">CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins.</a> Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).</li><li>Maksimenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+new+insulator+proteins,+Pita+and+ZIPIC,+target+CP190+to+chromatin.">Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin.</a> Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).</li><li>Sabirov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+functional+role+of+the+interaction+between+CP190+and+the+architectural+protein+Pita+in+Drosophila+melanogaster.">Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster.</a> Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16 (2021).</li><li>Dong, S., Provart, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyses+of+protein+interaction+networks+using+computational+tools.">Analyses of protein interaction networks using computational tools.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).</li></ol>

記載された方法は、インビトロで効率的に組み立てることができず、共発現を必要とするタンパク質間相互作用の試験を可能にする。この方法は、ヘテロ二量体化タンパク質を研究するための数少ない適切なアプローチの1つであり、別々に精製すると、そのようなタンパク質は、実験中に解離および再会合することが最も多い安定したホモ二量体を形成するため、ホモ二量体化も可能...

従来のプルダウンは、タンパク質間相互作用の研究に広く使用されています1。しかしながら、精製されたタンパク質は、インビトロで効果的に相互作用しないことが多く2,3、それらのいくつかは、それらの結合パートナーなしでは不溶性である4,5。そのようなタンパク質は、共翻訳アセンブリまたは分子シャペロンの存在を必要とするかもしれない5,6,7,8,9。従来のプルダウンの別の制限は、共翻訳的に組み立てられた安定なホモオリゴマーとして存在し得るドメイン間のヘテロ多量体化活性の試験です8,10、それらの多くはインビトロで解離および再会合することができないため、インキュベーション時間中に。共発現は、このような問題を克服するのに有用であることがわかった3、11。細菌における適合ベクターを用いた共発現は、ポリコーム抑制複合体PRC2 12、RNAポリメラーゼIIメディエーターヘッドモジュール13、バクテリオファージT4ベースプレート14、SAGA複合体デユビキチニラーゼモジュール15、16、およびフェリチン17を含む大きなマルチサブユニット高分子複合体の精製に成功しました。共発現に一般的に使用される複製起点は、ColE1、p15A18、CloDF1319、およびRSF20です。市販のDuet発現システムでは、これらの起源を異なる抗生物質耐性遺伝子および便利な複数のクローニング部位と組み合わせてポリシストロニックベクターを作製し、最大8つのタンパク質の発現を可能にします。これらの起源は異なるコピー数を有し、標的タンパク質のバランスの取れた発現レベルを達成するために様々な組み合わせで使用することができる21。タンパク質間相互作用をテストするために、さまざまな親和性タグが使用されます。最も一般的なのは、6xヒスチジン、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、およびマルトース結合タンパク質(MBP)であり、それぞれが対応する樹脂に特異的な親和性を持っています。GSTおよびMBPはまた、タグ付きタンパク質の溶解性および安定性を高める22。
真核細胞におけるタンパク質共発現を含む多くの方法も開発されており、その中で最も顕著なのは酵母ツーハイブリッドアッセイ(Y2H)23です。Y2Hアッセイは安価で簡単で、複数の相互作用のテストが可能です。ただし、ワークフローが完了するまでに1週間以上かかります。また、蛍光ツーハイブリッドアッセイ(F2H)24 や細胞アレイタンパク質間相互作用アッセイ(CAPPIA)25など、あまり使用頻度の低い哺乳類細胞ベースのアッセイもいくつかあります。F2Hアッセイは比較的高速であり、天然の細胞環境でタンパク質相互作用を観察することができますが、高価なイメージング機器を使用する必要があります。これらの方法はすべて、ネイティブの真核生物の翻訳および折り畳み環境を提供する原核生物発現よりも優れています。しかし、それらは、転写活性化または蛍光エネルギー伝達のいずれかによって間接的に相互作用を検出し、しばしばアーティファクトを生成します。また、真核細胞は、目的のタンパク質の他の相互作用パートナーを含む可能性があり、これは、高等真核生物のタンパク質間の二元相互作用の試験を妨げる可能性がある。
本研究では、従来のプルダウン技術に従った、差次的にタグ付けされたタンパク質の細菌共発現の方法について説明しています。この方法では、共発現を必要とする標的タンパク質間の相互作用を研究することができます。従来のプルダウンに比べて時間効率が高く、複数のターゲットのバッチテストが可能で、ほとんどの場合に有利です。適合ベクターを用いた共発現は、面倒なクローニング工程を必要としないため、ポリシストロニック共発現よりも簡便である。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-ELEMENT probe</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>630-0586</td>
			<td>The high throughput 8-element sonicator probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose resin</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8021</td>
			<td>Resin for purification of MBP-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)&#160;</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69450-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R (Z605212)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A9782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione agarose</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>16100</td>
			<td>Resin for purification of GST-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni-NTA Superflow Agarose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25214</td>
			<td>Resin for purification of 6xHis-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>414753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pACYCDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71147</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCDFDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71340</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail VII</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539138</td>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSFDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71341</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VC505 sonicator</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>CV334</td>
			<td>Ultrasonic liquid processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A6285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pulldown assay coupled with co-expression in bacteria cells as a time-efficient tool for testing challenging protein-protein interactions

プルダウンは、簡単で広く使用されているタンパク質間相互作用アッセイです。しかし、 in vitroで効果的に集合しないタンパク質複合体の研究には限界があります。そのような複合体は、共翻訳アセンブリおよび分子シャペロンの存在を必要とし得る。それらは、 in vitro で解離および再会合することができない安定なオリゴマーを形成するか、結合パートナーなしでは不安定である。これらの問題を克服するために、従来のプルダウン技術に続く一連の適合ベクターを用いた差次的タグタンパク質の細菌共発現に基づく方法を用いることができる。このワークフローは、相互作用するタンパク質の個別の精製とその後のインキュベーションという時間のかかるステップがないため、従来のプルダウンと比較して時間効率が高くなります。別の利点は、ステップ数が大幅に少なく、 in vitro 環境内に存在するタンパク質がタンパク質分解および酸化にさらされる期間が短いため、再現性が高いことです。この方法は、他の in vitro 技術が不適切であることが判明した場合に、多くのタンパク質間相互作用を研究するために首尾よく適用されました。この方法は、タンパク質間相互作用のバッチ試験に使用できます。BTBドメインと天然変性タンパク質との相互作用、および亜鉛フィンガー関連ドメインのヘテロ二量体の研究について、代表的な結果が示されています。

記載された方法は、多くの異なるターゲットで日常的に使用されていた。ここでは、従来のプルダウン技術では得られない可能性のある代表的な結果をいくつか紹介します。1つ目は、特異的ZAD(亜鉛フィンガー関連ドメイン)二量体化の研究です11。ZADは安定で特異的な二量体を形成し、ヘテロ二量体はパラロググループ内の密接に関連するドメイン間でのみ可能です。これ?...

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Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

ここでは、適合ベクターのセットを使用して、タグ差のあるタンパク質を細菌で共発現させる方法について説明し、その後、 in vitroで組み立てられないタンパク質複合体を研究するための従来のプルダウン技術について説明します。

細菌細胞での共発現と組み合わせたプルダウンアッセイは、困難なタンパク質間相互作用をテストするための時間効率の良いツールとして

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

この方法は、ヘテロ二量体の形成など、効率的な試験サンプルのために共発現を必要とするタンパク質複合体の形成を研究することを可能にする。この方法の主な可能性は、互換性のあるベクターの組み合わせを使用して、異なるタグが付けられた研究対象タンパク質の共発現を利用して、効率的な複雑なアセンブリを促進するとともに、時間効率の高いワークフローとスケーラビリティにより、複数の相互作用の迅速なパッチテストを可能にすることです。この方法は、最適なタンパク質発現および精製条件の迅速なスクリーニングにも使用できます。視覚的なデモンストレーションは、共発現のセットアップ、細胞破壊、その後のプルダウンステップなど、プロトコルの重要なステップを正しく実行するのに役立ちます。まず、ルリア・ベルターニ(LB)培地中の大腸菌BL21(DE3)株を摂氏37度で光学密度(OD)0.1〜0.2に増殖させます。1ミリリットルの細菌懸濁液を摂氏4度で9, 000 Gで1分間遠心分離し、上清を捨てます。次に、0.5ミリリットルの氷冷形質転換バッファー(TB)を加え、氷上で10分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、摂氏4度で8, 000 Gで30秒間遠心分離し、上清を捨てます。次に、100マイクロリットルのTBバッファー、100ナノグラムの各ベクターを加え、氷上で30分間インキュベートします。摂氏42度で150秒間加熱してから、氷上で1分間冷やします。次に、抗生物質を含まない1ミリリットルのLB培地を加え、摂氏37度で90分間インキュベートします。インキュベーション後、ペレットを遠心分離し、100マイクロリットルのLB培地に再懸濁してから、0.5%グルコースと対応する抗生物質を含むLB寒天プレートに懸濁液をプレーティングします。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、2ミリリットルのLB培地でプレートから細胞を、対応する抗生物質を含む50ミリリットルのLB培地に洗い流します。その後の実験のために摂氏マイナス70度で20%グリセロールを含むアリコートを保存する前に、金属イオンまたは他の既知の補因子を追加します。摂氏37度で220 RPMの一定の回転で細胞を0.5〜0.7の外径まで成長させます。培養液を室温まで冷却し、IPTGを最終濃度1ミリモルまで添加します。誘導されていないサンプルのコントロールとして細胞懸濁液の20マイクロリットルアリコートを保存します。細胞を摂氏18度で220 RPMで一晩インキュベートします。翌日、細菌懸濁液を2つの部分に分け、20マイクロリットルのアリコートを保存してタンパク質発現を確認します。残りの細胞懸濁液を4, 000 Gで15分間遠心分離します。プルダウンアッセイでは、実験の直前にプロテアーゼ阻害剤と還元剤を添加した1ミリリットルの氷冷溶解バッファーにペレットを再懸濁します。試験したタンパク質のバッファー組成を調整します。氷上で超音波処理によって細胞を破壊し、電気泳動のために20マイクロリットルのアリコートを保存する。16, 000 Gで30分間遠心分離し、電気泳動のために20マイクロリットルの清澄化ライセートを収集します。樹脂を1ミリリットルの氷冷溶解バッファーで10分間平衡化し、次に2, 000 Gで30秒間遠心分離し、上清を廃棄します。細胞ライセートを樹脂に加え、15 RPMの一定回転で10分間インキュベートします。次いで、遠心分離し、分析のために20マイクロリットルの未結合画分を収集する前に上清を廃棄する。次に、1ミリリットルの氷冷洗浄バッファーを加え、1分間インキュベートします。再度、遠心分離し、上清を廃棄する。次に、氷冷洗浄バッファーで2回の長時間洗浄を行います。2回目の洗浄後、結合したタンパク質を50マイクロリットルの溶出バッファーで1,200 RPMの振とう機で摂氏4度で10分間溶出します。溶出したタンパク質をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析します。ジンクフィンガー関連ドメイン(ZAD)、マルトース結合タンパク質(MBP)におけるホモ二量体化、および6xヒスチジンプルダウンアッセイの研究を以下に示します。MBPとチオレドキシン6xヒスチジン融合ZADの共発現は、良好で再現性のあるホモ二量体化活性を示し、MBPプルダウンアッセイのSDS-PAGE結果に追加のバンドとして現れます。代替複合体形成を研究するためにこの方法を使用する別の例がここに示されている。共発現アッセイでは、6xヒスチジンタグ付きENY2はGSTタグ付きSgf11およびMBP-CTCFの両方と相互作用しましたが、MBPプルダウンにはGST-Sgf11は存在せず、その逆も同様でした。ここでは、従来のプルダウンアッセイのワークフローにおける必要な時間間隔を、共発現に結合したプルダウンと比較した段階的な比較を示します。CP190タンパク質のBTBドメインとショウジョウバエCTCFタンパク質のGSTタグ付きC末端ドメインとの間の同じ相互作用を研究するために両方の技術を利用した結果をここに示す。アフィニティーおよび溶解性試験(チオレドキシン、GST、またはMBP)の正しい選択は、アッセイの効率的な実行にとって重要です。もう一つの重要なステップは、迅速かつ均一な細胞破壊です。マルチチップ超音波処理器プローブを使用することを強くお勧めします。この方法は、従来のプルダウンアッセイにおける精製タンパク質のインキュベーション中に解離しないホモ二量体を形成するタンパク質ドメイン間のヘテロ二量体形成の直接研究を可能にする。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのツールとしての蛍光異方性

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

細菌でエチレン応答を研究するためのツールとして、エチレン放出化合物、2-クロロエチルホスホン酸を利用します

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します<em&gt;インビトロ</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

細胞内タンパク質間相互作用を研究するビオチン化セル透過ペプチド

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems

否定的な変奏曲染色電子顕微鏡検査方法: システムに挑戦に取り組むためのツール

Negative stain electron microscopy (EM) allows relatively simple and quick observation of macromolecules and macromolecular complexes through the use of ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

細胞間の接触でタンパク質間相互作用の分析計蛍光の変動

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

転写におけるタンパク質とタンパク質の相互作用を研究するための生体層干渉計(BLI)の応用

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

アミロイドフィブリルスによる脳ミトコンドリアの相互作用と膜透過性

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

グラム陽性菌におけるRNAシーケンシングと結合したMS2-アフィニティ精製

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...