Name: pulldown assay coupled with co-expression in bacteria cells as a time-efficient tool for testing challenging protein-protein interactions
Uploaded: 2022-12-23T14:00:00
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이 연구는 러시아 과학 재단 프로젝트 19-74-30026 (방법 개발 및 검증) 및 19-74-10099 (단백질-단백질 상호 작용 분석)의 지원을 받았습니다. 러시아 연방 과학 고등 교육부 보조금 075-15-2019-1661 (대표적인 단백질-단백질 상호 작용 분석).

Method Workflow의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다.
1. 대장균의 공동 형질전환
<ol><li>표준 클로닝 방법을 사용하여 표적 단백질에 대한 발현 벡터를 준비합니다. 참고: 일반적으로 좋은 출발점은 GST/MBP 태그 단백질의 발현을 위해 암피실린 내성 유전자 및 ColE1 기원을 갖는 기존의 pGEX/pMAL 벡터와 p15A 또는 RSF 기원 및 카나마이신 내성?...

<ol>
	<li>Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions:+Pulldown+assays.">Protein-protein interactions: Pulldown assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).</li><li>Rose, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+dimerization,+coactivator+recognition+and+MODY3+mutations+in+HNF-1alpha.">Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).</li><li>Bonchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+diversity+and+homodimerization+specificity+of+zinc-finger-associated+domains+in+Drosophila.">Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila.</a> Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).</li><li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors.">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112 (2), 193-205 (2003).</li><li>Badonyi, M., Marsh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+protein+complex+interfaces+have+evolved+to+promote+co-translational+assembly.">Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly.</a> Elife. 11, 79602 (2022).</li><li>Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cotranslational+maturation+of+newly+synthesized+proteins.">Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins.</a> Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).</li><li>Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cotranslational+protein+maturation+in+bacteria.">Mechanisms of cotranslational protein maturation in bacteria.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 689755 (2021).</li><li>Shiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+assembly+of+protein+complexes+in+eukaryotes+revealed+by+ribosome+profiling.">Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling.</a> Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).</li><li>Shieh, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operon+structure+and+co-translational+subunit+association+direct+protein+assembly+in+bacteria.">Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria.</a> Science. 350 (6261), 678-680 (2015).</li><li>Bertolini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+nascent+proteins+translated+by+adjacent+ribosomes+drive+homomer+assembly.">Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly.</a> Science. 371 (6524), 57-64 (2021).</li><li>Bonchuk, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+highly+similar+spatial+organization+of+zinc-finger+associated+domains+with+a+very+low+sequence+similarity.">Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity.</a> Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).</li><li>Justin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+oncogenic+histone+H3K27M+inhibition+of+human+polycomb+repressive+complex+2.">Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2.</a> Nature Communications. 7, 11316 (2016).</li><li>Lariviere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+mediator+head+module.">Structure of the mediator head module.</a> Nature. 492 (7429), 448-451 (2012).</li><li>Taylor, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+T4+baseplate+and+its+function+in+triggering+sheath+contraction.">Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction.</a> Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).</li><li>Samara, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+assembly+and+function+of+the+SAGA+deubiquitinating+module.">Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module.</a> Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).</li><li>Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+assembly+and+activation+of+the+heterotetrameric+SAGA+histone+H2B+deubiquitinase+module.">Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module.</a> Cell. 141 (4), 606-617 (2010).</li><li>Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+ferritin:+modulation+of+subunit+stoichiometry+in+bacterial+expression+systems.">Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems.</a> Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).</li><li>Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+replication+of+plasmid+p15A+and+comparative+studies+on+the+nucleotide+sequences+around+the+origin+of+related+plasmids.">The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids.</a> Cell. 32 (1), 119-129 (1983).</li><li>Nijkamp, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+nucleotide+sequence+of+the+bacteriocinogenic+plasmid+CloDF13.">The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13.</a> Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).</li><li>Som, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+replication+of+Escherichia+coli+plasmid+RSF+1030.">Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030.</a> Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).</li><li>Tsao, K. L., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+production+of+two+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli+by+manipulating+plasmid+copy+number:+high-level+expression+of+heterodimeric+Ras+farnesyltransferase.">Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase.</a> Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).</li><li>Nallamsetty, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubility-enhancing+proteins+MBP+and+NusA+play+a+passive+role+in+the+folding+of+their+fusion+partners.">Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners.</a> Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).</li><li>Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+two-hybrid+assay+to+identify+interacting+proteins.">Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70 (2019).</li><li>Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+two-hybrid+(F2H)+assay+for+direct+analysis+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).</li><li>Fiebitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mammalian+two-hybrid+screening+for+protein-protein+interactions+using+transfected+cell+arrays.">High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays.</a> BMC Genomics. 9, 68 (2008).</li><li>Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+and+Sgfl1+proteins+form+alternative+complexes+with+ENY2+proteins.">CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins.</a> Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).</li><li>Maksimenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+new+insulator+proteins,+Pita+and+ZIPIC,+target+CP190+to+chromatin.">Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin.</a> Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).</li><li>Sabirov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+functional+role+of+the+interaction+between+CP190+and+the+architectural+protein+Pita+in+Drosophila+melanogaster.">Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster.</a> Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16 (2021).</li><li>Dong, S., Provart, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyses+of+protein+interaction+networks+using+computational+tools.">Analyses of protein interaction networks using computational tools.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).</li></ol>

설명된 방법을 사용하면 시험관 내에서 효율적으로 조립할 수 없고 공동 발현이 필요한 단백질-단백질 상호 작용을 테스트할 수 있습니다. 이 방법은 헤테로다이머화 단백질을 연구하는 데 적합한 몇 안 되는 접근법 중 하나이며, 이러한 단백질은 별도로 정제될 때 실험 동안 가장 자주 해리 및 재결합할 수 없는 안정적인 동종이량체를 형성하기 때문에 동종이량체화도 가능합니다<sup class=...

기존의 풀다운은 단백질-단백질 상호작용을 연구하는 데 널리 사용된다1. 그러나, 정제된 단백질은 종종 시험관 내에서 효과적으로 상호작용하지 않으며2,3, 이들 중 일부는 그들의 결합 파트너 없이는 불용성이다 4,5. 이러한 단백질은 공동 번역 조립 또는 분자 샤페론 5,6,7,8,9의 존재를 필요로 할 수 있습니다. 종래의 풀다운의 또 다른 한계는 많은 도메인이 배양 시간 동안 시험관 내에서 해리 및 재결합할 수 없기 때문에, 이들 중 다수가 동시번역적으로 조립된 안정한 호모올리고머로서 존재할 수 있는 도메인 간의 가능한 헤테로멀티머화 활성을 시험하는 것이다 8,10. 동시발현은 이러한 문제를 극복하는데 유용한 것으로 밝혀졌다 3,11. 박테리아에서 호환 가능한 벡터를 사용한 공동 발현은 폴리콤 억제 복합체 PRC212, RNA 중합효소 II 중재자 헤드 모듈13, 박테리오파지 T4 베이스플레이트 14, SAGA 복합체 데비퀴티닐라제 모듈 15,16 및 페리틴 17을 포함하는 대형 다중 서브유닛 거대분자 복합체를 정제하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 공동-발현에 통상적으로 사용되는 복제 기원은 ColE1, p15A18, CloDF1319 및 RSF20이다. 상업적으로 이용 가능한 Duet 발현 시스템에서, 이들 기원은 상이한 항생제 내성 유전자 및 편리한 다중 클로닝 부위와 결합되어 폴리시스트로닉 벡터를 생성하여, 최대 8개의 단백질의 발현을 허용한다. 이들 기원은 상이한 복제 수를 가지며, 표적 단백질의 균형 잡힌 발현 수준을 달성하기 위해 다양한 조합으로 사용될 수 있다21. 단백질-단백질 상호작용을 테스트하기 위해 다양한 친화성 태그가 사용됩니다. 가장 흔한 것은 6x히스티딘, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 및 맥아당 결합 단백질(MBP)이며, 각각은 해당 수지에 특이적인 친화력을 가지고 있습니다. GST와 MBP는 또한 태그가 부착된 단백질의 용해도와 안정성을 향상시킨다22.
진핵 세포에서 단백질 공동 발현과 관련된 여러 방법도 개발되었으며, 그 중 가장 두드러진 것은 효모 2-하이브리드 분석(Y2H)23입니다. Y2H 분석은 저렴하고 쉬우며 여러 상호 작용을 테스트할 수 있습니다. 그러나 워크플로를 완료하는 데 1주일 이상 걸립니다. 또한 형광 2-하이브리드 분석(F2H)24 및 세포 어레이 단백질-단백질 상호작용 분석(CAPPIA)25과 같이 덜 자주 사용되는 포유류 세포 기반 분석법도 있습니다. F2H 분석은 비교적 빠르기 때문에 본래의 세포 환경에서 단백질 상호작용을 관찰할 수 있지만 고가의 이미징 장비를 사용해야 합니다. 이들 모든 방법은 천연 진핵생물 번역 및 접힘 환경을 제공하는 원핵생물 발현에 비해 이점을 갖는다; 그러나 그들은 전사 활성화 또는 형광 에너지 전달에 의해 간접적으로 상호 작용을 감지하며, 이는 종종 인공물을 생성합니다. 또한, 진핵 세포는 관심 단백질의 다른 상호작용 파트너를 포함할 수 있으며, 이는 고등 진핵생물의 단백질 간의 이진 상호작용 테스트를 방해할 수 있습니다.
본 연구는 기존의 풀다운 기술에 이어 차등적으로 태그된 단백질의 박테리아 공동 발현 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 공동 발현이 필요한 표적 단백질 간의 상호 작용을 연구 할 수 있습니다. 기존 풀다운에 비해 시간 효율성이 높아 여러 대상의 배치 테스트가 가능하므로 대부분의 경우 유리합니다. 호환 가능한 벡터를 사용한 공동-발현은 힘든 클로닝 단계를 필요로 하지 않기 때문에 폴리시스트로닉 공동-발현보다 더 편리하다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-ELEMENT probe</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>630-0586</td>
			<td>The high throughput 8-element sonicator probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose resin</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8021</td>
			<td>Resin for purification of MBP-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)&#160;</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69450-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R (Z605212)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A9782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione agarose</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>16100</td>
			<td>Resin for purification of GST-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni-NTA Superflow Agarose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25214</td>
			<td>Resin for purification of 6xHis-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>414753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pACYCDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71147</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCDFDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71340</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail VII</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539138</td>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSFDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71341</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VC505 sonicator</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>CV334</td>
			<td>Ultrasonic liquid processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A6285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pulldown assay coupled with co-expression in bacteria cells as a time-efficient tool for testing challenging protein-protein interactions

풀다운은 쉽고 널리 사용되는 단백질-단백질 상호작용 분석법입니다. 그러나 시험관 내에서 효과적으로 조립되지 않는 단백질 복합체를 연구하는 데는 한계가 있습니다. 이러한 복합체는 공동 번역 조립 및 분자 샤페론의 존재를 필요로 할 수 있습니다. 이들은 시험관 내에서 해리 및 재결합할 수 없는 안정한 올리고머를 형성하거나 결합 파트너 없이는 불안정합니다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 종래의 풀다운 기술에 이어 일련의 호환 벡터를 사용하여 차등적으로 태깅된 단백질의 박테리아 동시 발현에 기초한 방법을 사용할 수 있다. 워크플로우는 상호 작용하는 단백질의 개별 정제 및 후속 배양에 대한 시간 소모적인 단계가 없기 때문에 기존 풀다운에 비해 시간 효율성이 더 높습니다. 또 다른 장점은 훨씬 더 적은 수의 단계와 시험관 내 환경 내에 존재하는 단백질이 단백질 분해 및 산화에 노출되는 더 짧은 기간으로 인해 더 높은 재현성입니다. 이 방법은 다른 시험관 내 기술이 부적합한 것으로 판명되었을 때 여러 단백질-단백질 상호 작용을 연구하는 데 성공적으로 적용되었습니다. 이 방법은 단백질-단백질 상호작용을 일괄 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 대표적인 결과는 BTB 도메인과 본질적으로 무질서한 단백질 사이의 상호작용 및 징크-핑거 관련 도메인의 이종이량체에 대한 연구에 대해 표시됩니다.

설명된 방법은 많은 다른 대상과 함께 일상적으로 사용되었습니다. 여기에 제시된 것은 기존의 풀다운 기술로는 얻을 수 없는 몇 가지 대표적인 결과입니다. 첫 번째는 특정 ZAD(Zinc-finger-associated domain) 이량체화에 대한 연구이다11. ZAD는 안정적이고 특이적인 이량체를 형성하며, 이종이량체는 paralogous 그룹 내에서 밀접하게 관련된 도메인 사이에서만 가능합니다. 이 도메인에 의?...

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Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

여기에서는 일련의 호환 가능한 벡터를 사용하여 차등적으로 태그된 단백질의 박테리아 공동 발현 방법을 설명한 다음 시험관 내에서 조립할 수 없는 단백질 복합체를 연구하기 위한 기존의 풀다운 기술을 설명합니다.

까다로운 단백질-단백질 상호작용을 테스트하기 위한 시간 효율적인 도구로서 박테리아 세포의 공동 발현과 결합된 풀다운 분석

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

이 방법을 사용하면 헤테로다이머 형성과 같은 효율적인 테스트 샘플을 위해 공동 발현이 필요한 단백질 복합체의 형성을 연구할 수 있습니다. 이 방법의 주요 잠재력은 호환 가능한 벡터의 조합을 사용하여 차등적으로 태그가 지정된 연구 단백질의 공동 발현을 활용하여 효율적인 복잡한 조립을 촉진하고 시간 효율적인 워크플로 및 확장성을 통해 여러 상호 작용의 신속한 패치 테스트를 가능하게 하는 것입니다. 이 방법은 최적의 단백질 발현 및 정제 조건의 신속한 스크리닝에도 사용할 수 있습니다.시각적 데모는 co-expression 설정, 세포 중단 및 후속 풀다운 단계와 같은 프로토콜의 중요한 단계를 올바르게 수행하는 데 도움이 됩니다. 시작하려면 섭씨 37도의 Luria-Bertani 또는 LB 배지에서 대장균 BL21(DE3) 균주를 0.1에서 0.2의 광학 밀도(OD)로 성장시킵니다. 박테리아 현탁액 1 밀리리터를 섭씨 4도에서 9, 000 G에서 1 분 동안 원심 분리하고 상청액을 버린다.그런 다음 0.5 밀리리터의 얼음 차가운 변환 완충액 (TB)을 넣고 얼음에서 10 분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 섭씨 4도에서 8, 000 G에서 30 초 동안 원심 분리하고 상청액을 버린다. 그런 다음 TB 버퍼 100마이크로리터, 각 벡터 100나노그램을 추가하고 얼음에서 30분 동안 배양합니다.섭씨 42도에서 150초 동안 가열한 다음 얼음에서 1분 동안 식힙니다. 다음으로, 항생제가없는 LB 배지 1 밀리리터를 넣고 섭씨 37도에서 90 분 동안 배양합니다. 배양 후, 0.5% 포도당 및 해당 항생제를 함유하는 LB 한천 플레이트에 현탁액을 도금하기 전에 100마이크로리터의 LB 배지에 펠릿을 원심분리하고 재현탁합니다.접시를 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 다음날, 2 밀리리터의 LB 배지로 플레이트에서 세포를 해당 항생제와 함께 50 밀리리터의 LB 배지로 플러시합니다. 후속 실험을 위해 섭씨 영하 70도에서 20% 글리세롤이 포함된 분취량을 저장하기 전에 금속 이온 또는 기타 알려진 보조 인자를 추가합니다.섭씨 37도에서 220RPM의 일정한 회전으로 세포를 0.5에서 0.7의 OD로 성장시킵니다. 배양액을 실온으로 냉각하고 IPTG를 1 밀리몰의 최종 농도로 첨가한다. 유도되지 않은 샘플의 대조군으로서 세포 현탁액의 20 마이크로리터 분취액을 저장한다.섭씨 18도에서 220RPM으로 하룻밤 동안 세포를 배양합니다. 다음날, 박테리아 현탁액을 두 부분으로 나누고 단백질 발현을 확인하기 위해 20 마이크로 리터 분취량을 저장합니다. 나머지 세포 현탁액을 4, 000 G에서 15 분 동안 원심 분리한다.풀다운 분석을 위해, 실험 직전에 프로테아제 억제제 및 환원제가 첨가된 1밀리리터의 얼음-차가운 용해 완충액에 펠릿을 재현탁시킨다. 테스트된 단백질에 대한 완충액 조성을 조정합니다. 얼음 위에서 초음파 처리하여 세포를 파괴하고 전기 영동을 위해 20 마이크로 리터 분취량을 저장합니다.16, 000 G에서 30 분 동안 원심 분리하고 전기 영동을 위해 정화 된 용해물 20 마이크로 리터를 수집한다. 수지를 1 밀리리터의 얼음 차가운 용해 완충액으로 10 분 동안 평형시킨 다음 2, 000 G에서 30 초 동안 원심 분리하고 상청액을 버린다. 세포 용해물을 수지에 첨가하고 15RPM의 일정한 회전으로 10분 동안 배양합니다.이어서, 분석을 위해 결합되지 않은 분획 20 마이크로리터를 수집하기 전에 원심분리하고 상청액을 버린다. 다음으로, 1 밀리리터의 얼음처럼 차가운 세척 완충액을 넣고 1 분 동안 배양합니다. 다시, 원심분리하고 상층액을 버린다.그런 다음 얼음처럼 차가운 세척 버퍼로 두 번 길게 세척합니다. 2차 세척 후, 결합된 단백질을 50 마이크로리터의 용출 완충액으로 1, 200 RPM의 진탕기에서 섭씨 4도에서 10분 동안 용출시킨다. 용출된 단백질을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석합니다.징크 핑거 관련 도메인(ZAD), 맥아당 결합 단백질의 호모 이량체화(MBP) 및 6xHistidine 풀다운 분석에 대한 연구가 여기에 나와 있습니다. MBP와 티오레독신 6x히스티딘 융합 ZAD의 공동 발현은 MBP 풀다운 분석의 SDS-PAGE 결과에서 추가 밴드로 나타나는 우수하고 재현 가능한 동종이량체화 활성을 보여줍니다. 대안적인 복합체 형성을 연구하기 위해 이 방법을 사용하는 또 다른 예가 여기에 나와 있습니다.동시 발현 분석에서, 6x히스티딘 태깅된 ENY2는 GST-태깅된 Sgf11 및 MBP-CTCF 둘 다와 상호작용했지만, MBP 풀다운에는 GST-Sgf11이 존재하지 않았고 그 반대의 경우도 마찬가지였다. 동시 발현과 결합된 풀다운과 비교하여 기존 풀다운 분석의 워크플로우에서 필요한 시간 간격의 단계별 비교가 여기에 나와 있습니다. CP190 단백질의 BTB 도메인과 초파리 CTCF 단백질의 GST 태그 C-말단 도메인 사이의 동일한 상호작용을 연구하기 위해 두 기술을 모두 활용한 결과가 여기에 나와 있습니다.친화도 및 용해도 테스트, 티오레독신, GST 또는 MBP의 올바른 선택은 분석의 효율적인 실행에 매우 중요합니다. 또 다른 중요한 단계는 빠르고 균일한 세포 파괴입니다. 다중 팁 초음파 처리기 프로브를 사용하는 것이 좋습니다.이 방법을 사용하면 기존의 풀다운 분석에서 정제된 단백질의 배양 중에 분리되지 않는 동종이량체를 형성하는 단백질 도메인 간의 이종이량체 형성을 직접 연구할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 도구로 형광 이방성

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

연구

생화학

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

도구로 에틸렌 방출 화합물, 2- 클로로 에틸 산을 활용하여 박테리아의 에틸렌 응답을 공부하기

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylated 세포 관통 펩 티 드 세포내 단백질-단백질 상호 작용을 공부 하

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems

유사에 부정적인 얼룩 전자 현미경 검사 법 방법: 시스템에 도전 하는 태 클을 위한 도구

Negative stain electron microscopy (EM) allows relatively simple and quick observation of macromolecules and macromolecular complexes through the use of ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

전사에서 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 생체층 간섭측정기(BLI) 적용

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

아밀로이드 피브릴스뇌 미토콘드리아의 상호 작용 및 막 관과화

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

그람 양성 박테리아에서 RNA 염기서열분석과 결합된 MS2-선호도 정화

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...