Name: pulldown assay coupled with co-expression in bacteria cells as a time-efficient tool for testing challenging protein-protein interactions
Uploaded: 2022-12-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Russian Science Foundation-prosjektene 19-74-30026 (metodeutvikling og validering) og 19-74-10099 (protein-proteininteraksjonsanalyser); og av departementet for vitenskap og høyere utdanning i Russland-stipend 075-15-2019-1661 (analyse av representative protein-protein-interaksjoner).

Den skjematiske fremstillingen av arbeidsflyten for metoden er vist i figur 1.
1. Samtransformasjon av E. coli
<ol><li>Klargjøre ekspresjonsvektorer for målproteiner ved bruk av standard kloningsmetoder. MERK: Vanligvis er et godt utgangspunkt å bruke konvensjonelle pGEX / pMAL-vektorer som bærer et ampicillinresistensgen og ColE1-opprinnelse for ekspresjon av GST / MBP-merkede proteiner og en kompatibel vektor med p15A- eller RS...

<ol>
	<li>Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions:+Pulldown+assays.">Protein-protein interactions: Pulldown assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).</li><li>Rose, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+dimerization,+coactivator+recognition+and+MODY3+mutations+in+HNF-1alpha.">Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).</li><li>Bonchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+diversity+and+homodimerization+specificity+of+zinc-finger-associated+domains+in+Drosophila.">Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila.</a> Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).</li><li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors.">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112 (2), 193-205 (2003).</li><li>Badonyi, M., Marsh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+protein+complex+interfaces+have+evolved+to+promote+co-translational+assembly.">Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly.</a> Elife. 11, 79602 (2022).</li><li>Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cotranslational+maturation+of+newly+synthesized+proteins.">Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins.</a> Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).</li><li>Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cotranslational+protein+maturation+in+bacteria.">Mechanisms of cotranslational protein maturation in bacteria.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 689755 (2021).</li><li>Shiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+assembly+of+protein+complexes+in+eukaryotes+revealed+by+ribosome+profiling.">Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling.</a> Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).</li><li>Shieh, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operon+structure+and+co-translational+subunit+association+direct+protein+assembly+in+bacteria.">Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria.</a> Science. 350 (6261), 678-680 (2015).</li><li>Bertolini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+nascent+proteins+translated+by+adjacent+ribosomes+drive+homomer+assembly.">Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly.</a> Science. 371 (6524), 57-64 (2021).</li><li>Bonchuk, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+highly+similar+spatial+organization+of+zinc-finger+associated+domains+with+a+very+low+sequence+similarity.">Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity.</a> Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).</li><li>Justin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+oncogenic+histone+H3K27M+inhibition+of+human+polycomb+repressive+complex+2.">Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2.</a> Nature Communications. 7, 11316 (2016).</li><li>Lariviere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+mediator+head+module.">Structure of the mediator head module.</a> Nature. 492 (7429), 448-451 (2012).</li><li>Taylor, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+T4+baseplate+and+its+function+in+triggering+sheath+contraction.">Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction.</a> Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).</li><li>Samara, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+assembly+and+function+of+the+SAGA+deubiquitinating+module.">Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module.</a> Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).</li><li>Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+assembly+and+activation+of+the+heterotetrameric+SAGA+histone+H2B+deubiquitinase+module.">Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module.</a> Cell. 141 (4), 606-617 (2010).</li><li>Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+ferritin:+modulation+of+subunit+stoichiometry+in+bacterial+expression+systems.">Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems.</a> Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).</li><li>Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+replication+of+plasmid+p15A+and+comparative+studies+on+the+nucleotide+sequences+around+the+origin+of+related+plasmids.">The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids.</a> Cell. 32 (1), 119-129 (1983).</li><li>Nijkamp, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+nucleotide+sequence+of+the+bacteriocinogenic+plasmid+CloDF13.">The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13.</a> Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).</li><li>Som, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+replication+of+Escherichia+coli+plasmid+RSF+1030.">Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030.</a> Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).</li><li>Tsao, K. L., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+production+of+two+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli+by+manipulating+plasmid+copy+number:+high-level+expression+of+heterodimeric+Ras+farnesyltransferase.">Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase.</a> Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).</li><li>Nallamsetty, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubility-enhancing+proteins+MBP+and+NusA+play+a+passive+role+in+the+folding+of+their+fusion+partners.">Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners.</a> Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).</li><li>Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+two-hybrid+assay+to+identify+interacting+proteins.">Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70 (2019).</li><li>Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+two-hybrid+(F2H)+assay+for+direct+analysis+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).</li><li>Fiebitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mammalian+two-hybrid+screening+for+protein-protein+interactions+using+transfected+cell+arrays.">High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays.</a> BMC Genomics. 9, 68 (2008).</li><li>Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+and+Sgfl1+proteins+form+alternative+complexes+with+ENY2+proteins.">CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins.</a> Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).</li><li>Maksimenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+new+insulator+proteins,+Pita+and+ZIPIC,+target+CP190+to+chromatin.">Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin.</a> Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).</li><li>Sabirov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+functional+role+of+the+interaction+between+CP190+and+the+architectural+protein+Pita+in+Drosophila+melanogaster.">Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster.</a> Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16 (2021).</li><li>Dong, S., Provart, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyses+of+protein+interaction+networks+using+computational+tools.">Analyses of protein interaction networks using computational tools.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).</li></ol>

Den beskrevne metoden tillater testing av protein-protein-interaksjoner som ikke effektivt kan settes sammen in vitro og krever samuttrykk. Metoden er en av de få egnede tilnærmingene for å studere heterodimeriserende proteiner, som også er i stand til homodimerisering, siden slike proteiner danner stabile homodimerer når de renses separat som oftest ikke kan dissosiere og knytte seg sammen igjen under forsøket 3,11.
Arb...

Konvensjonell nedtrekk er mye brukt til å studere protein-protein-interaksjoner1. Imidlertid interagerer rensede proteiner ofte ikke effektivt in vitro2,3, og noen av dem er uløselige uten bindingspartner 4,5. Slike proteiner kan kreve co-translasjonell montering eller tilstedeværelse av molekylære chaperones 5,6,7,8,9. En annen begrensning av konvensjonell nedtrekk er testing av mulig heteromultimeriseringsaktivitet mellom domener som kan eksistere som stabile homo-oligomerer samlet co-translasjonelt 8,10, da mange av dem ikke kan dissosiere og re-assosiere in vitro i inkubasjonstiden. Meduttrykk ble funnet å være nyttig for å overvinne slike problemer 3,11. Samuttrykk ved bruk av kompatible vektorer i bakterier ble vellykket brukt til å rense store multi-subenhet makromolekylære komplekser, inkludert polycomb repressive komplekse PRC212, RNA polymerase II mediatorhodemodul13, bakteriofag T4 baseplate 14, SAGA-kompleks deubiquitinylasemodul 15,16 og ferritin 17. Replikasjonsopprinnelser som vanligvis brukes for co-uttrykk er ColE1, p15A18, CloDF1319 og RSF20. I det kommersielt tilgjengelige Duet-ekspresjonssystemet kombineres disse opprinnelsene med forskjellige antibiotikaresistensgener og praktiske flere kloningssteder for å produsere polycistronic vektorer, noe som tillater ekspresjon av opptil åtte proteiner. Disse opprinnelsene har forskjellige kopinumre og kan brukes i varierende kombinasjoner for å oppnå balanserte ekspresjonsnivåer av målproteiner21. For å teste protein-protein-interaksjoner brukes forskjellige affinitetsmerker; de vanligste er 6xHistidin, glutation-S-transferase (GST) og maltosebindende protein (MBP), som hver har en spesifikk affinitet til den tilsvarende harpiksen. GST og MBP forbedrer også løseligheten og stabiliteten til merkede proteiner22.
En rekke metoder som involverer proteinekspresjon i eukaryote celler har også blitt utviklet, hvorav den mest fremtredende er gjær-to-hybridanalyse (Y2H)23. Y2H-analysen er billig, enkel og tillater testing av flere interaksjoner; Imidlertid tar arbeidsflyten mer enn 1 uke å fullføre. Det er også noen få mindre brukte pattedyrcellebaserte analyser, for eksempel fluorescerende to-hybridanalyse (F2H)24 og cellematriseprotein-proteininteraksjonsanalyse (CAPPIA)25. F2H-analysen er relativt rask, noe som gjør det mulig å observere proteininteraksjoner i sitt opprinnelige cellulære miljø, men innebærer bruk av dyrt bildeutstyr. Alle disse metodene har en fordel i forhold til prokaryot uttrykk som gir det opprinnelige eukaryote oversettelses- og foldemiljøet; Imidlertid oppdager de interaksjon indirekte, enten ved transkripsjonsaktivering eller ved fluorescerende energioverføring, som ofte produserer artefakter. Eukaryote celler kan også inneholde andre interaksjonspartnere av proteiner av interesse, noe som kan forstyrre testingen av binære interaksjoner mellom proteiner av høyere eukaryoter.
Denne studien beskriver en metode for bakteriell samekspresjon av differensielt merkede proteiner etterfulgt av konvensjonelle nedtrekksteknikker. Metoden tillater å studere interaksjoner mellom målproteiner som krever samuttrykk. Det er mer tidseffektivt sammenlignet med tradisjonell nedtrekk, noe som tillater batchtesting av flere mål, noe som gjør det fordelaktig i de fleste tilfeller. Samuttrykk ved hjelp av kompatible vektorer er mer praktisk enn polycistronic co-uttrykk siden det ikke krever et møysommelig kloningstrinn.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-ELEMENT probe</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>630-0586</td>
			<td>The high throughput 8-element sonicator probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose resin</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8021</td>
			<td>Resin for purification of MBP-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)&#160;</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69450-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R (Z605212)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A9782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione agarose</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>16100</td>
			<td>Resin for purification of GST-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni-NTA Superflow Agarose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25214</td>
			<td>Resin for purification of 6xHis-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>414753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pACYCDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71147</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCDFDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71340</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail VII</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539138</td>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSFDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71341</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VC505 sonicator</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>CV334</td>
			<td>Ultrasonic liquid processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A6285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pulldown assay coupled with co-expression in bacteria cells as a time-efficient tool for testing challenging protein-protein interactions

Nedtrekk er en enkel og mye brukt protein-protein-interaksjonsanalyse. Det har imidlertid begrensninger i å studere proteinkomplekser som ikke monteres effektivt in vitro. Slike komplekser kan kreve co-translasjonell montering og tilstedeværelsen av molekylære chaperoner; Enten danner de stabile oligomerer som ikke kan dissosiere og assosieres in vitro , eller de er ustabile uten en bindende partner. For å overvinne disse problemene er det mulig å bruke en metode basert på bakteriell samuttrykk av differensielt merkede proteiner ved hjelp av et sett med kompatible vektorer etterfulgt av konvensjonelle nedtrekksteknikker. Arbeidsflyten er mer tidseffektiv sammenlignet med tradisjonell nedtrekk fordi den mangler de tidkrevende trinnene med separat rensing av samvirkende proteiner og deres påfølgende inkubasjon. En annen fordel er en høyere reproduserbarhet på grunn av et betydelig mindre antall trinn og en kortere periode hvor proteiner som finnes i in vitro-miljøet blir utsatt for proteolyse og oksidasjon. Metoden ble vellykket brukt for å studere en rekke protein-protein-interaksjoner når andre in vitro-teknikker ble funnet å være uegnet. Metoden kan brukes til batchtesting av protein-protein-interaksjoner. Representative resultater er vist for studier av interaksjoner mellom BTB-domene og iboende forstyrrede proteiner, og av heterodimerer av sink-finger-assosierte domener.

Den beskrevne metoden ble brukt rutinemessig med mange forskjellige mål. Her presenteres noen representative resultater som sannsynligvis ikke kan oppnås ved hjelp av konvensjonelle nedtrekksteknikker. Den første er studiet av spesifikk ZAD (Zinc-finger-associated domain) dimerisering11. ZAD danner stabile og spesifikke dimerer, med heterodimerer som bare er mulig mellom nært beslektede domener innenfor paraloge grupper. Dimerene dannet av disse domenene er stabile og dissocierer ikke i minst ...

Watch this Scientific Journal Video about Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions at JoVE.com

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Her beskriver vi en metode for bakteriell samekspresjon av differensielt merkede proteiner ved hjelp av et sett med kompatible vektorer, etterfulgt av konvensjonelle nedtrekksteknikker for å studere proteinkomplekser som ikke kan samles in vitro.

Nedtrekksanalyse kombinert med co-uttrykk i bakterieceller som et tidseffektivt verktøy for å teste utfordrende protein-protein-interaksjoner

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

Denne metoden gjør det mulig å studere formasjoner av proteinkomplekser som krever samuttrykk for effektive testprøver, for eksempel dannelsen av heterodimerer. Hovedpotensialet til denne metoden er å utnytte samuttrykket av differensielt merkede studerte proteiner ved hjelp av kombinasjoner av kompatible vektorer for å fremme effektiv kompleks montering, sammen med tidseffektiv arbeidsflyt og skalerbarhet som muliggjør rask patch-testing av flere interaksjoner. Denne metoden kan også brukes til rask screening av optimale proteinuttrykk og rensebetingelser.Visuell demonstrasjon hjelper deg med å utføre kritiske trinn i protokollen på riktig måte, for eksempel oppsett av fellesuttrykk, celleavbrudd og påfølgende rullegardintrinn. For å begynne, vokse Escherichia coli BL21 (DE3) stamme i Luria-Bertani, eller LB, media ved 37 grader Celsius til en optisk tetthet, eller OD, på 0,1 til 0,2. Sentrifuge en milliliter av bakteriell suspensjon i ett minutt ved 9.000 G ved fire grader Celsius og kast supernatanten.Deretter tilsettes 0,5 milliliter iskald transformasjonsbuffer, eller TB, og ruges i 10 minutter på is. På slutten av inkubasjonen, sentrifuge i 30 sekunder ved 8.000 G ved fire grader Celsius og kassere supernatanten. Deretter legger du til 100 mikroliter TB-buffer, 100 nanogram av hver vektor, og inkuberer i 30 minutter på is.Varm opp ved 42 grader Celsius i 150 sekunder, og slapp deretter av på is i ett minutt. Deretter legger du til en milliliter LB-medier uten antibiotika og inkuberer ved 37 grader Celsius i 90 minutter. Etter inkubering, sentrifuge og resuspendere pelleten i 100 mikroliter LB-medier før plating av suspensjonen på en LB-agarplate inneholdende 0,5% glukose og tilsvarende antibiotika.Inkuber platen over natten ved 37 grader Celsius. Neste dag, skyll cellene fra platen med to milliliter LB-medier i 50 ml LB-medier med tilsvarende antibiotika. Tilsett metallioner eller andre kjente kofaktorer før du lagrer en alikot med 20% glyserol ved minus 70 grader Celsius for påfølgende eksperimenter.Voks cellene med en konstant rotasjon på 220 RPM ved 37 grader Celsius til en OD på 0,5 til 0,7. Avkjøl kulturen til romtemperatur og tilsett IPTG til en endelig konsentrasjon på en millimol. Oppbevar en 20-mikroliters alikot av cellesuspensjon som en kontroll av den ikke-induserte prøven.Inkuber cellene over natten ved 220 RPM ved 18 grader Celsius. Neste dag, del bakteriell suspensjon i to deler og lagre 20 mikroliter aliquots for å bekrefte proteinuttrykk. Sentrifuge den gjenværende cellesuspensjonen ved 4.000 G i 15 minutter.For nedtrekksanalyse, resuspender pellets i en milliliter iskald lysbuffer med proteasehemmere og reduksjonsmidler tilsatt umiddelbart før forsøket. Juster buffersammensetningen for de testede proteinene. Forstyrr cellene ved sonikering på is og lagre en 20-mikroliter aliquot for elektroforese.Sentrifuge ved 16.000 g i 30 minutter og samle 20 mikroliter av det klargjorte lysatet for elektroforese. Balanser harpiksen med en milliliter iskald lysisbuffer i 10 minutter, sentrifuge deretter ved 2.000 G i 30 sekunder og kast supernatanten. Tilsett cellelysater til harpiksen og inkuber i 10 minutter ved en konstant rotasjon på 15 RPM.Deretter sentrifugerer og kaster du supernatanten før du samler 20 mikroliter av den ubundne fraksjonen for analyse. Deretter tilsettes en milliliter iskald vaskebuffer og ruges i ett minutt. Igjen, sentrifuge og kast supernatanten.Utfør deretter to lange vasker med iskald vaskebuffer. Etter den andre vasken, eluer de bundne proteinene med 50 mikroliter av elueringsbufferen i en shaker ved 1.200 RPM ved fire grader Celsius i 10 minutter. Analyser de eluerte proteinene med SDS polyakrylamidgelelektroforese.Studier av sinkfingerassosiert domene, eller ZAD, homo-dimerisering i maltosebindende protein, eller MBP, og 6xHistidin nedtrekksanalyser er vist her. Samuttrykket av MBP og tioredoksin 6xHistidin-smeltede ZADer viser god og reproduserbar homodimeriseringsaktivitet, som vises som et ekstra bånd i SDS-PAGE-resultatene av MBP-nedtrekksanalysen. Et annet eksempel på bruk av metoden for å studere alternativ kompleksdannelse er vist her.I co-expression-analysen interagerte 6xHistidin-merket ENY2 både med GST-merket Sgf11 og MBP-CTCF, men ingen GST-Sgf11 var tilstede i MBP-nedtrekkene og omvendt. En trinnvis sammenligning av nødvendige tidsintervaller i arbeidsflyten til den konvensjonelle rullegardinanalysen sammenlignet med rullegardinmenyen koblet til samuttrykk vises her. Resultatene av å bruke begge teknikkene for å studere den samme interaksjonen mellom BTB-domenet til CP190-proteinet og det GST-merkede C-terminale domenet til Drosophila CTCF-proteinet er vist her.Riktig valg av affinitets- og løselighetstest, tioredoksin, GST eller MBP, er avgjørende for effektiv utførelse av analysen. Et annet kritisk skritt er rask og jevn celleforstyrrelse. Det anbefales sterkt å bruke multi-tip sonatorprober.Denne metoden tillater direkte studier av heterodimerdannelsen mellom proteindomener som ellers danner homodimerer som ikke ville skille seg fra under inkubasjonen av rensede proteiner i konvensjonell nedtrekksanalyse.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescens anisotropi som et verktøy for å studere protein-protein interaksjoner

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

Utnytte Etylen-frigjørende forbindelse, 2-Chloroethylphosphonic Acid, som et verktøy for å studere Etylen Response i Bakterier

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylated celle-gjennomtrengende peptider å studere intracellulær Protein-protein interaksjoner

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems

Variasjoner på Negative flekken elektronmikroskop metoder: verktøy for å takle utfordrende systemer

Negative stain electron microscopy (EM) allows relatively simple and quick observation of macromolecules and macromolecular complexes through the use of ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens svingninger spektroskopi analysen av Protein-Protein interaksjoner i celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Anvendelse av Biolayer laboratoriefasiliteter (BLI) for å studere protein-protein interaksjoner i transkripsjon

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaksjoner med og membran Permeabilization av Brain mitokondrier av amyloid fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-affinitetsrensing kombinert med RNA-sekvensering i Gram-positive bakterier

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...