Name: pulldown assay coupled with co-expression in bacteria cells as a time-efficient tool for testing challenging protein-protein interactions
Uploaded: 2022-12-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions at JoVE.com

Работа выполнена при поддержке проектов РНФ 19-74-30026 (разработка и валидация метода) и 19-74-10099 (анализ белково-белкового взаимодействия); грант Министерства науки и высшего образования Российской Федерации 075-15-2019-1661 (анализ репрезентативных белок-белковых взаимодействий).

Схематическое изображение рабочего процесса метода показано на рисунке 1.
1. Котрансформация кишечной палочки
<ol><li>Подготовьте векторы экспрессии для белков-мишеней, используя стандартные методы клонирования. ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, хо?...

<ol>
	<li>Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions:+Pulldown+assays.">Protein-protein interactions: Pulldown assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).</li><li>Rose, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+dimerization,+coactivator+recognition+and+MODY3+mutations+in+HNF-1alpha.">Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).</li><li>Bonchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+diversity+and+homodimerization+specificity+of+zinc-finger-associated+domains+in+Drosophila.">Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila.</a> Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).</li><li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors.">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112 (2), 193-205 (2003).</li><li>Badonyi, M., Marsh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+protein+complex+interfaces+have+evolved+to+promote+co-translational+assembly.">Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly.</a> Elife. 11, 79602 (2022).</li><li>Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cotranslational+maturation+of+newly+synthesized+proteins.">Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins.</a> Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).</li><li>Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cotranslational+protein+maturation+in+bacteria.">Mechanisms of cotranslational protein maturation in bacteria.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 689755 (2021).</li><li>Shiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+assembly+of+protein+complexes+in+eukaryotes+revealed+by+ribosome+profiling.">Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling.</a> Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).</li><li>Shieh, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operon+structure+and+co-translational+subunit+association+direct+protein+assembly+in+bacteria.">Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria.</a> Science. 350 (6261), 678-680 (2015).</li><li>Bertolini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+nascent+proteins+translated+by+adjacent+ribosomes+drive+homomer+assembly.">Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly.</a> Science. 371 (6524), 57-64 (2021).</li><li>Bonchuk, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+highly+similar+spatial+organization+of+zinc-finger+associated+domains+with+a+very+low+sequence+similarity.">Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity.</a> Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).</li><li>Justin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+oncogenic+histone+H3K27M+inhibition+of+human+polycomb+repressive+complex+2.">Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2.</a> Nature Communications. 7, 11316 (2016).</li><li>Lariviere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+mediator+head+module.">Structure of the mediator head module.</a> Nature. 492 (7429), 448-451 (2012).</li><li>Taylor, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+T4+baseplate+and+its+function+in+triggering+sheath+contraction.">Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction.</a> Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).</li><li>Samara, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+assembly+and+function+of+the+SAGA+deubiquitinating+module.">Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module.</a> Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).</li><li>Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+assembly+and+activation+of+the+heterotetrameric+SAGA+histone+H2B+deubiquitinase+module.">Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module.</a> Cell. 141 (4), 606-617 (2010).</li><li>Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+ferritin:+modulation+of+subunit+stoichiometry+in+bacterial+expression+systems.">Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems.</a> Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).</li><li>Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+replication+of+plasmid+p15A+and+comparative+studies+on+the+nucleotide+sequences+around+the+origin+of+related+plasmids.">The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids.</a> Cell. 32 (1), 119-129 (1983).</li><li>Nijkamp, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+nucleotide+sequence+of+the+bacteriocinogenic+plasmid+CloDF13.">The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13.</a> Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).</li><li>Som, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+replication+of+Escherichia+coli+plasmid+RSF+1030.">Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030.</a> Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).</li><li>Tsao, K. L., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+production+of+two+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli+by+manipulating+plasmid+copy+number:+high-level+expression+of+heterodimeric+Ras+farnesyltransferase.">Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase.</a> Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).</li><li>Nallamsetty, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubility-enhancing+proteins+MBP+and+NusA+play+a+passive+role+in+the+folding+of+their+fusion+partners.">Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners.</a> Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).</li><li>Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+two-hybrid+assay+to+identify+interacting+proteins.">Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70 (2019).</li><li>Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+two-hybrid+(F2H)+assay+for+direct+analysis+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).</li><li>Fiebitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mammalian+two-hybrid+screening+for+protein-protein+interactions+using+transfected+cell+arrays.">High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays.</a> BMC Genomics. 9, 68 (2008).</li><li>Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+and+Sgfl1+proteins+form+alternative+complexes+with+ENY2+proteins.">CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins.</a> Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).</li><li>Maksimenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+new+insulator+proteins,+Pita+and+ZIPIC,+target+CP190+to+chromatin.">Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin.</a> Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).</li><li>Sabirov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+functional+role+of+the+interaction+between+CP190+and+the+architectural+protein+Pita+in+Drosophila+melanogaster.">Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster.</a> Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16 (2021).</li><li>Dong, S., Provart, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyses+of+protein+interaction+networks+using+computational+tools.">Analyses of protein interaction networks using computational tools.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).</li></ol>

Описанный метод позволяет тестировать белок-белковые взаимодействия, которые не могут быть эффективно собраны in vitro и требуют коэкспрессии. Метод является одним из немногих подходящих подходов для изучения гетеродимеризирующих белков, которые также способны к гомодимеризации, т...

Обычный вытягивание широко используется для изучения белково-белковых взаимодействий1. Однако очищенные белки часто не взаимодействуют эффективно in vitro2,3, а некоторые из них нерастворимы без своего партнера по связыванию 4,5. Такие белки могут потребовать котрансляционной сборки или присутствия молекулярных шаперонов 5,6,7,8,9. Другим ограничением обычного вытягивания является тестирование возможной гетеромультимеризационной активности между доменами, которые могут существовать в виде стабильных гомоолигомеров, собранных котрансляционно 8,10, поскольку многие из них не могут диссоциировать и повторно ассоциировать in vitro во время инкубации. Было обнаружено, что совместное выражение полезно для преодоления таких проблем 3,11. Коэкспрессия с использованием совместимых векторов в бактериях была успешно использована для очистки больших мультисубъединичных макромолекулярных комплексов, включая поликомбный репрессивный комплекс PRC212, РНК-полимеразу II медиаторный головной модуль13, базовую пластинубактериофага Т4 14, комплекс SAGA деубиквитинилазный модуль 15,16 и ферритин17. Источниками репликации, обычно используемыми для совместной экспрессии, являются ColE1, p15A18, CloDF1319 и RSF20. В коммерчески доступной системе экспрессии Duet эти источники сочетаются с различными генами устойчивости к антибиотикам и удобными несколькими сайтами клонирования для получения полицистронных векторов, позволяющих экспрессировать до восьми белков. Эти источники имеют разное количество копий и могут использоваться в различных комбинациях для достижения сбалансированных уровней экспрессии целевых белков21. Для проверки белок-белковых взаимодействий используются различные аффинные метки; наиболее распространенными являются 6xгистидин, глутатион-S-трансфераза (GST) и мальтозосвязывающий белок (MBP), каждый из которых имеет специфическое сродство к соответствующей смоле. GST и MBP также повышают растворимость и стабильность меченых белков22.
Также был разработан ряд методов, включающих коэкспрессию белка в эукариотических клетках, наиболее известным из которых является двухгибридный анализ дрожжей (Y2H)23. Анализ Y2H дешев, прост и позволяет тестировать несколько взаимодействий; Однако его рабочий процесс занимает более 1 недели. Существует также несколько менее часто используемых анализов на основе клеток млекопитающих, например, флуоресцентный двухгибридный анализ (F2H)24 и анализ белково-белкового взаимодействия клеточного массива (CAPPIA)25. Анализ F2H является относительно быстрым, что позволяет наблюдать белковые взаимодействия в их родной клеточной среде, но требует использования дорогостоящего оборудования для визуализации. Все эти методы имеют преимущество перед прокариотической экспрессией, обеспечивая нативную эукариотическую среду трансляции и складывания; Однако они обнаруживают взаимодействие косвенно, либо путем активации транскрипции, либо путем флуоресцентного переноса энергии, что часто приводит к артефактам. Кроме того, эукариотические клетки могут содержать других партнеров по взаимодействию интересующих белков, что может мешать тестированию бинарных взаимодействий между белками высших эукариот.
В настоящем исследовании описывается метод бактериальной коэкспрессии дифференциально меченных белков с последующим использованием традиционных методов вытягивания. Метод позволяет изучать взаимодействия между белками-мишенями, требующими коэкспрессии. Он более эффективен по времени по сравнению с традиционным вытягиванием, позволяя проводить пакетное тестирование нескольких целей, что делает его выгодным в большинстве случаев. Коэкспрессия с использованием совместимых векторов более удобна, чем полицистронная коэкспрессия, поскольку не требует трудоемкого этапа клонирования.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-ELEMENT probe</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>630-0586</td>
			<td>The high throughput 8-element sonicator probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose resin</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8021</td>
			<td>Resin for purification of MBP-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)&#160;</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69450-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R (Z605212)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A9782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione agarose</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>16100</td>
			<td>Resin for purification of GST-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni-NTA Superflow Agarose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25214</td>
			<td>Resin for purification of 6xHis-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>414753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pACYCDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71147</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCDFDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71340</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail VII</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539138</td>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSFDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71341</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VC505 sonicator</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>CV334</td>
			<td>Ultrasonic liquid processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A6285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pulldown assay coupled with co-expression in bacteria cells as a time-efficient tool for testing challenging protein-protein interactions

Pulldown - это простой и широко используемый анализ белково-белкового взаимодействия. Однако у него есть ограничения в изучении белковых комплексов, которые не собираются эффективно in vitro. Такие комплексы могут потребовать котрансляционной сборки и присутствия молекулярных шаперонов; Либо они образуют стабильные олигомеры, которые не могут диссоциировать и повторно ассоциировать in vitro , либо нестабильны без связывающего партнера. Чтобы преодолеть эти проблемы, можно использовать метод, основанный на бактериальной коэкспрессии дифференциально меченных белков с использованием набора совместимых векторов, за которыми следуют обычные методы вытягивания. Рабочий процесс более эффективен по времени по сравнению с традиционным вытягиванием, поскольку в нем отсутствуют трудоемкие этапы отдельной очистки взаимодействующих белков и их последующей инкубации. Другим преимуществом является более высокая воспроизводимость из-за значительно меньшего количества стадий и более короткого периода времени, в течение которого белки, существующие в среде in vitro , подвергаются протеолизу и окислению. Метод был успешно применен для изучения ряда белок-белковых взаимодействий, когда другие методы in vitro оказались непригодными. Метод может быть использован для пакетного тестирования белок-белковых взаимодействий. Показаны репрезентативные результаты исследований взаимодействий между доменом BTB и внутренне неупорядоченными белками, а также гетеродимеров доменов, связанных с цинковым пальцем.

Описанный метод обычно использовался со многими различными целями. Здесь представлены некоторые репрезентативные результаты, которые, вероятно, не могут быть получены с использованием обычных методов вытягивания. Во-первых, это изучение димеризации специфического ZAD (домена, связанн?...

Watch this Scientific Journal Video about Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions at JoVE.com

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Здесь мы описываем метод бактериальной коэкспрессии дифференциально меченных белков с использованием набора совместимых векторов, за которым следуют традиционные методы вытягивания для изучения белковых комплексов, которые не могут собираться in vitro.

Анализ вытягивания в сочетании с коэкспрессией в клетках бактерий как эффективный по времени инструмент для тестирования сложных белково-белковых взаимодействий

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

Этот метод позволяет исследовать образования белковых комплексов, требующих коэкспрессии для эффективных тестовых образцов, таких как образование гетеродимеров. Основным конечным потенциалом этого метода является использование совместной экспрессии дифференциально меченных изученных белков с использованием комбинаций совместимых векторов для обеспечения эффективной сложной сборки, наряду с эффективным рабочим процессом и масштабируемостью, позволяющими быстро тестировать множественные взаимодействия. Этот метод также может быть использован для быстрого скрининга оптимальной экспрессии белка и условий очистки.Визуальная демонстрация помогает правильно выполнять критические шаги протокола, такие как настройка коэкспрессии, разрушение клеток и последующие шаги вытягивания. Для начала выращивайте штамм Escherichia coli BL21 (DE3) в среде Лурия-Бертани или LB при температуре 37 градусов Цельсия до оптической плотности или OD от 0,1 до 0,2. Центрифугируйте один миллилитр бактериальной суспензии в течение одной минуты при температуре 9 000 г при четырех градусах Цельсия и выбросьте надосадочную жидкость.Затем добавьте 0,5 миллилитра ледяного буфера трансформации, или TB, и выдержите 10 минут на льду. В конце инкубации центрифугу в течение 30 секунд при 8 000 G при четырех градусах Цельсия и выбросьте надосадочную жидкость. Затем добавьте 100 микролитров буфера TB, по 100 нанограммов каждого вектора, и выдержите 30 минут на льду.Нагрейте до 42 градусов по Цельсию в течение 150 секунд, затем охладите на льду в течение одной минуты. Затем добавьте один миллилитр среды LB без антибиотиков и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 90 минут. После инкубации центрифугируют и ресуспендируют гранулы в 100 микролитрах среды LB перед нанесением суспензии на агаровую пластину LB, содержащую 0,5% глюкозы и соответствующие антибиотики.Инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию. На следующий день промойте клетки из пластины двумя миллилитрами среды LB в 50 миллилитров среды LB с соответствующими антибиотиками. Добавьте ионы металлов или другие известные кофакторы перед хранением аликвоты с 20% глицерином при температуре минус 70 градусов по Цельсию для последующих экспериментов.Выращивайте клетки с постоянным вращением 220 об / мин при 37 градусах Цельсия до OD от 0,5 до 0,7. Охладите культуру до комнатной температуры и добавьте IPTG до конечной концентрации в один миллимоль. Храните 20-микролитровую аликвоту клеточной суспензии в качестве контроля неиндуцированного образца.Инкубируйте клетки в течение ночи при 220 оборотах в минуту при 18 градусах Цельсия. На следующий день разделите бактериальную суспензию на две части и храните аликвоты объемом 20 микролитров для подтверждения экспрессии белка. Центрифугируют оставшуюся клеточную суспензию в дозе 4 000 г в течение 15 мин.Для анализа вытягивания ресуспендируют гранулы в одном миллилитре ледяного буфера лизиса с ингибиторами протеазы и восстановителями, добавленными непосредственно перед экспериментом. Отрегулируйте состав буфера для тестируемых белков. Разрушайте клетки путем обработки ультразвуком на льду и храните аликвоту объемом 20 микролитров для электрофореза.Центрифугу по 16 000 г в течение 30 минут и собирают 20 микролитров осветленного лизата для электрофореза. Уравновесьте смолу одним миллилитром ледяного буфера для лизиса в течение 10 минут, затем центрифугу при 2 000 г в течение 30 секунд и выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте клеточные лизаты в смолу и выдерживайте в течение 10 минут при постоянном вращении 15 об / мин.Затем центрифугу и выбросьте надосадочную жидкость перед сбором 20 микролитров несвязанной фракции для анализа. Затем добавьте один миллилитр ледяного буфера для стирки и выдерживайте в течение одной минуты. Снова центрифугу и выбросьте надосадочную жидкость.Затем выполните две длительные стирки ледяным буфером для стирки. После второй промывки разбавьте связанные белки 50 микролитрами буфера для элюирования в шейкере при 1 200 об/мин при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Анализируйте элюированные белки с помощью электрофореза в полиакриламидном геле SDS.Здесь показаны исследования домена, связанного с цинковым пальцем, или ZAD, гомодимеризации в мальтозосвязывающем белке, или MBP, и анализов 6x-гистидинового вытягивания. Совместная экспрессия MBP и тиоредоксина 6x-гистидин-слитых ZAD демонстрирует хорошую и воспроизводимую гомодимеризационную активность, появляясь в качестве дополнительной полосы в результатах SDS-PAGE анализа вытягивания MBP. Еще один пример использования метода для изучения альтернативного комплексообразования показан здесь.В анализе совместной экспрессии ENY2, помеченный 6xгистидином, взаимодействовал как с GST-меченным Sgf11, так и с MBP-CTCF, но GST-Sgf11 не присутствовал в выпадениях MBP и наоборот. Здесь показано пошаговое сравнение требуемых временных интервалов в рабочем процессе обычного анализа вытягивания по сравнению с вытягиванием, связанным с коэкспрессией. Здесь показаны результаты использования обоих методов для изучения одного и того же взаимодействия между доменом BTB белка CP190 и помеченным GST C-концевым доменом белка Drosophila CTCF.Правильный выбор теста на аффинность и растворимость, тиоредоксина, GST или MBP, имеет решающее значение для эффективного выполнения анализа. Еще одним важным шагом является быстрое и равномерное разрушение клеток. Настоятельно рекомендуется использовать ультразвуковые зонды с несколькими наконечниками.Этот метод позволяет непосредственно изучать образование гетеродимера между белковыми доменами, которые в противном случае образуют гомодимеры, которые не диссоциировали бы во время инкубации очищенных белков в обычном анализе вытягивания.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Анизотропию, как флуоресценция инструмента для изучения белок-белковых взаимодействий

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

Используя Этилен-рилизинг-соединение, 2-Chloroethylphosphonic кислота, в качестве инструмента для изучения Этилен ответа бактерий

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Биотинилированным клеток-проникая пептиды для изучения внутриклеточный белок белковых взаимодействий

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems

Вариации на отрицательной пятно методы электронной микроскопии: инструменты для решения сложных систем

Negative stain electron microscopy (EM) allows relatively simple and quick observation of macromolecules and macromolecular complexes through the use of ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Флуоресценции колебания спектроскопии Assay белок белковых взаимодействий в ячейке контакты

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Применение биослойной интерферометрии (BLI) для изучения белково-белковых взаимодействий в транскрипции

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Взаимодействие с и Мембрана Пермябилизация митохондрий мозга амилоида Фибрилс

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-аффинная очистка в сочетании с секвенированием РНК у грамположительных бактерий

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...