Name: pulldown assay coupled with co-expression in bacteria cells as a time-efficient tool for testing challenging protein-protein interactions
Uploaded: 2022-12-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Russian Science Foundation-projekten 19-74-30026 (metodutveckling och validering) och 19-74-10099 (protein-proteininteraktionsanalyser); och av Ryska federationens ministerium för vetenskap och högre utbildning-bidrag 075-15-2019-1661 (analys av representativa protein-proteininteraktioner).

Den schematiska representationen av metodarbetsflödet visas i bild 1.
1. Samomvandling av E. coli
<ol><li>Förbered uttrycksvektorer för målproteiner med hjälp av standardkloningsmetoder. OBS: Vanligtvis är en bra utgångspunkt att använda konventionella pGEX / pMAL-vektorer som bär en ampicillinresistensgen och ColE1-ursprung för uttryck av GST / MBP-märkta proteiner och en kompatibel vektor med p15A- eller RSF-ursprung och...

<ol>
	<li>Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions:+Pulldown+assays.">Protein-protein interactions: Pulldown assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).</li><li>Rose, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+dimerization,+coactivator+recognition+and+MODY3+mutations+in+HNF-1alpha.">Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).</li><li>Bonchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+diversity+and+homodimerization+specificity+of+zinc-finger-associated+domains+in+Drosophila.">Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila.</a> Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).</li><li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors.">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112 (2), 193-205 (2003).</li><li>Badonyi, M., Marsh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+protein+complex+interfaces+have+evolved+to+promote+co-translational+assembly.">Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly.</a> Elife. 11, 79602 (2022).</li><li>Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cotranslational+maturation+of+newly+synthesized+proteins.">Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins.</a> Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).</li><li>Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cotranslational+protein+maturation+in+bacteria.">Mechanisms of cotranslational protein maturation in bacteria.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 689755 (2021).</li><li>Shiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+assembly+of+protein+complexes+in+eukaryotes+revealed+by+ribosome+profiling.">Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling.</a> Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).</li><li>Shieh, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operon+structure+and+co-translational+subunit+association+direct+protein+assembly+in+bacteria.">Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria.</a> Science. 350 (6261), 678-680 (2015).</li><li>Bertolini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+nascent+proteins+translated+by+adjacent+ribosomes+drive+homomer+assembly.">Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly.</a> Science. 371 (6524), 57-64 (2021).</li><li>Bonchuk, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+highly+similar+spatial+organization+of+zinc-finger+associated+domains+with+a+very+low+sequence+similarity.">Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity.</a> Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).</li><li>Justin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+oncogenic+histone+H3K27M+inhibition+of+human+polycomb+repressive+complex+2.">Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2.</a> Nature Communications. 7, 11316 (2016).</li><li>Lariviere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+mediator+head+module.">Structure of the mediator head module.</a> Nature. 492 (7429), 448-451 (2012).</li><li>Taylor, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+T4+baseplate+and+its+function+in+triggering+sheath+contraction.">Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction.</a> Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).</li><li>Samara, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+assembly+and+function+of+the+SAGA+deubiquitinating+module.">Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module.</a> Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).</li><li>Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+assembly+and+activation+of+the+heterotetrameric+SAGA+histone+H2B+deubiquitinase+module.">Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module.</a> Cell. 141 (4), 606-617 (2010).</li><li>Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+ferritin:+modulation+of+subunit+stoichiometry+in+bacterial+expression+systems.">Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems.</a> Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).</li><li>Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+replication+of+plasmid+p15A+and+comparative+studies+on+the+nucleotide+sequences+around+the+origin+of+related+plasmids.">The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids.</a> Cell. 32 (1), 119-129 (1983).</li><li>Nijkamp, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+nucleotide+sequence+of+the+bacteriocinogenic+plasmid+CloDF13.">The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13.</a> Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).</li><li>Som, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+replication+of+Escherichia+coli+plasmid+RSF+1030.">Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030.</a> Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).</li><li>Tsao, K. L., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+production+of+two+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli+by+manipulating+plasmid+copy+number:+high-level+expression+of+heterodimeric+Ras+farnesyltransferase.">Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase.</a> Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).</li><li>Nallamsetty, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubility-enhancing+proteins+MBP+and+NusA+play+a+passive+role+in+the+folding+of+their+fusion+partners.">Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners.</a> Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).</li><li>Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+two-hybrid+assay+to+identify+interacting+proteins.">Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70 (2019).</li><li>Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+two-hybrid+(F2H)+assay+for+direct+analysis+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).</li><li>Fiebitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mammalian+two-hybrid+screening+for+protein-protein+interactions+using+transfected+cell+arrays.">High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays.</a> BMC Genomics. 9, 68 (2008).</li><li>Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+and+Sgfl1+proteins+form+alternative+complexes+with+ENY2+proteins.">CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins.</a> Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).</li><li>Maksimenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+new+insulator+proteins,+Pita+and+ZIPIC,+target+CP190+to+chromatin.">Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin.</a> Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).</li><li>Sabirov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+functional+role+of+the+interaction+between+CP190+and+the+architectural+protein+Pita+in+Drosophila+melanogaster.">Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster.</a> Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16 (2021).</li><li>Dong, S., Provart, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyses+of+protein+interaction+networks+using+computational+tools.">Analyses of protein interaction networks using computational tools.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).</li></ol>

Den beskrivna metoden möjliggör testning av protein-proteininteraktioner som inte kan monteras effektivt in vitro och kräver samuttryck. Metoden är en av de få lämpliga metoderna för att studera heterodimeriserande proteiner, som också kan homodimeriseras eftersom sådana proteiner, när de renas separat, bildar stabila homodimerer som oftast inte kan dissociera och återassociera under experimentet 3,11.
Arbetsflödet...

Konventionell neddragning används ofta för att studera protein-proteininteraktioner1. Renade proteiner interagerar emellertid ofta inte effektivt in vitro2,3, och vissa av dem är olösliga utan sin bindningspartner 4,5. Sådana proteiner kan kräva samtranslationell sammansättning eller närvaron av molekylära chaperoner 5,6,7,8,9. En annan begränsning av konventionell pulldown är testningen av möjlig heteromultimeriseringsaktivitet mellan domäner som kan existera som stabila homooligomerer monterade tillsammans 8,10, eftersom många av dem inte kan dissociera och återassociera in vitro under inkubationstiden. Samuttryck visade sig vara användbart för att övervinna sådana problem 3,11. Samuttryck med kompatibla vektorer i bakterier användes framgångsrikt för att rena stora makromolekylära komplex med flera subenheter, inklusive polykamrepressivt komplex PRC212, RNA-polymeras II mediatorhuvudmodul 13, bakteriofag T4-basplatta14, SAGA-komplex deubiquitinylasmodul 15,16 och ferritin 17. Replikeringsursprung som vanligtvis används för samuttryck är ColE1, p15A18, CloDF1319 och RSF20. I det kommersiellt tillgängliga Duet-uttryckssystemet kombineras dessa ursprung med olika antibiotikaresistensgener och lämpliga multipla kloningsställen för att producera polycistroniska vektorer, vilket möjliggör uttryck av upp till åtta proteiner. Dessa ursprung har olika kopienummer och kan användas i olika kombinationer för att uppnå balanserade uttrycksnivåer av målproteiner21. För att testa protein-proteininteraktioner används olika affinitetstaggar; de vanligaste är 6xHistidin, glutation-S-transferas (GST) och maltosbindande protein (MBP), som var och en har en specifik affinitet till motsvarande harts. GST och MBP förbättrar också lösligheten och stabiliteten hos märkta proteiner22.
Ett antal metoder som involverar proteinuttryck i eukaryota celler har också utvecklats, varav den mest framträdande är jäst tvåhybridanalys (Y2H)23. Y2H-analys är billig, enkel och möjliggör testning av flera interaktioner; Arbetsflödet tar dock mer än 1 vecka att slutföra. Det finns också några mindre frekventa däggdjurscellbaserade analyser, till exempel fluorescerande tvåhybridanalys (F2H)24 och cellmatrisprotein-proteininteraktionsanalys (CAPPIA)25. F2H-analys är relativt snabb, vilket gör det möjligt att observera proteininteraktioner i sin ursprungliga cellulära miljö, men innebär att man använder dyr bildutrustning. Alla dessa metoder har en fördel jämfört med prokaryot uttryck som ger den ursprungliga eukaryota översättnings- och vikningsmiljön; De detekterar emellertid interaktion indirekt, antingen genom transkriptionell aktivering eller genom fluorescerande energiöverföring, som ofta producerar artefakter. Eukaryota celler kan också innehålla andra interaktionspartners av proteiner av intresse, vilket kan störa testningen av binära interaktioner mellan proteiner av högre eukaryoter.
Den aktuella studien beskriver en metod för bakteriellt samuttryck av differentiellt taggade proteiner följt av konventionella pulldown-tekniker. Metoden gör det möjligt att studera interaktioner mellan målproteiner som kräver samuttryck. Det är mer tidseffektivt jämfört med traditionell pulldown, vilket möjliggör batchtestning av flera mål, vilket gör det fördelaktigt i de flesta fall. Samuttryck med kompatibla vektorer är bekvämare än polycistroniskt samuttryck eftersom det inte kräver ett mödosamt kloningssteg.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-ELEMENT probe</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>630-0586</td>
			<td>The high throughput 8-element sonicator probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose resin</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8021</td>
			<td>Resin for purification of MBP-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)&#160;</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69450-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R (Z605212)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A9782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione agarose</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>16100</td>
			<td>Resin for purification of GST-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni-NTA Superflow Agarose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25214</td>
			<td>Resin for purification of 6xHis-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>414753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pACYCDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71147</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCDFDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71340</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail VII</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539138</td>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSFDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71341</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VC505 sonicator</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>CV334</td>
			<td>Ultrasonic liquid processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A6285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pulldown assay coupled with co-expression in bacteria cells as a time-efficient tool for testing challenging protein-protein interactions

Pulldown är en enkel och allmänt använd protein-proteininteraktionsanalys. Det har dock begränsningar när det gäller att studera proteinkomplex som inte monteras effektivt in vitro. Sådana komplex kan kräva samtranslationell montering och närvaron av molekylära chaperoner; Antingen bildar de stabila oligomerer som inte kan dissociera och återassociera in vitro eller är instabila utan en bindande partner. För att övervinna dessa problem är det möjligt att använda en metod baserad på bakteriellt samuttryck av differentiellt märkta proteiner med hjälp av en uppsättning kompatibla vektorer följt av de konventionella pulldown-teknikerna. Arbetsflödet är mer tidseffektivt jämfört med traditionell pulldown eftersom det saknar de tidskrävande stegen för separat rening av interagerande proteiner och deras efterföljande inkubation. En annan fördel är en högre reproducerbarhet på grund av ett betydligt mindre antal steg och en kortare tidsperiod där proteiner som finns i in vitro-miljön utsätts för proteolys och oxidation. Metoden användes framgångsrikt för att studera ett antal protein-proteininteraktioner när andra in vitro-tekniker visade sig vara olämpliga. Metoden kan användas för batchtestning av protein-proteininteraktioner. Representativa resultat visas för studier av interaktioner mellan BTB-domän och inneboende oordnade proteiner, och av heterodimerer av zinkfingerassocierade domäner.

Den beskrivna metoden användes rutinmässigt med många olika mål. Här presenteras några representativa resultat som sannolikt inte kan erhållas med konventionella pulldown-tekniker. Den första är studien av specifik ZAD (Zinc-finger-associated domain) dimerisering11. ZAD bildar stabila och specifika dimerer, med heterodimerer endast möjliga mellan närbesläktade domäner inom paraloga grupper. Dimererna som bildas av dessa domäner är stabila och dissocierar inte i minst några dagar; B...

Watch this Scientific Journal Video about Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions at JoVE.com

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Här beskriver vi en metod för bakteriellt samuttryck av differentiellt taggade proteiner med hjälp av en uppsättning kompatibla vektorer, följt av konventionella pulldown-tekniker för att studera proteinkomplex som inte kan monteras in vitro.

Pulldown-analys i kombination med samuttryck i bakterieceller som ett tidseffektivt verktyg för att testa utmanande protein-proteininteraktioner

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

Denna metod gör det möjligt att studera formationer av proteinkomplex som kräver samuttryck för effektiva testprover, såsom bildandet av heterodimerer. Huvudpotentialen för denna metod är att utnyttja samuttrycket av differentiellt taggade studerade proteiner med kombinationer av kompatibla vektorer för att främja effektiv komplex montering, tillsammans med tidseffektivt arbetsflöde och skalbarhet som möjliggör snabb patchtestning av flera interaktioner. Denna metod kan också användas för snabb screening av optimala proteinuttryck och reningsförhållanden.Visuell demonstration hjälper till att korrekt utföra kritiska steg i protokollet, till exempel konfiguration av samuttryck, cellavbrott och efterföljande nedrullningssteg. För att börja, odla Escherichia coli BL21 (DE3) stam i Luria-Bertani, eller LB, media vid 37 grader Celsius till en optisk densitet, eller OD, av 0,1 till 0,2. Centrifugera en milliliter av bakteriesuspensionen i en minut vid 9 000 G vid fyra grader Celsius och kassera supernatanten.Tillsätt sedan 0,5 ml iskall transformationsbuffert, eller TB, och inkubera i 10 minuter på is. Vid slutet av inkubationen centrifugeras i 30 sekunder vid 8 000 G vid fyra grader Celsius och kassera supernatanten. Tillsätt sedan 100 mikroliter TB-buffert, 100 nanogram av varje vektor och inkubera i 30 minuter på is.Värm vid 42 grader Celsius i 150 sekunder och kyl sedan på is i en minut. Tillsätt sedan en milliliter LB-media utan antibiotika och inkubera vid 37 grader Celsius i 90 minuter. Efter inkubation, centrifugera och återsuspendera pelleten i 100 mikroliter LB-media innan suspensionen pläteras på en LB-agarplatta innehållande 0,5% glukos och motsvarande antibiotika.Inkubera plattan över natten vid 37 grader Celsius. Följande dag, spola cellerna från plattan med två milliliter LB-media i 50 ml LB-media med motsvarande antibiotika. Tillsätt metalljoner eller andra kända kofaktorer innan du lagrar en alikvot med 20 % glycerol vid minus 70 grader Celsius för efterföljande experiment.Odla cellerna med en konstant rotation av 220 rpm vid 37 grader Celsius till en OD av 0,5 till 0,7. Kyl kulturen till rumstemperatur och tillsätt IPTG till en slutlig koncentration av en millimol. Förvara en 20-mikroliters alikvot av cellsuspensionen som kontroll av det oinducerade provet.Inkubera cellerna över natten vid 220 varv / min vid 18 grader Celsius. Nästa dag, dela bakteriesuspensionen i två delar och förvara 20-mikroliter alikvoter för att bekräfta proteinuttryck. Centrifugera den återstående cellsuspensionen vid 4 000 G i 15 minuter.För neddragningsanalys, återsuspendera pelletsen i en milliliter iskall lysbuffert med proteashämmare och reduktionsmedel tillsatta omedelbart före experimentet. Justera buffertkompositionen för de testade proteinerna. Stör cellerna genom ultraljudsbehandling på is och lagra en 20-mikroliter alikvot för elektrofores.Centrifugera vid 16 000 G i 30 minuter och samla 20 mikroliter av det klarade lysatet för elektrofores. Balansera hartset med en milliliter iskall lysbuffert i 10 minuter, centrifugera sedan vid 2 000 G i 30 sekunder och kassera supernatanten. Tillsätt celllysat till hartset och inkubera i 10 minuter vid en konstant rotation av 15 varv per minut.Centrifugera sedan och kassera supernatanten innan 20 mikroliter av den obundna fraktionen samlas upp för analys. Tillsätt sedan en milliliter iskall tvättbuffert och inkubera i en minut. Återigen, centrifugera och kassera supernatanten.Utför sedan två långa tvättar med iskall tvättbuffert. Efter den andra tvätten, eluera de bundna proteinerna med 50 mikroliter av elueringsbufferten i en shaker vid 1 200 varv / min vid fyra grader Celsius i 10 minuter. Analysera de eluerade proteinerna med SDS polyakrylamidgelelektrofores.Studier av zinkfingerassocierad domän, eller ZAD, homodimerisering i maltosbindande protein, eller MBP, och 6xHistidine pulldown-analyser visas här. Samuttrycket av MBP och Thioredoxin 6xHistidin-smält ZAD visar god och reproducerbar homodimeriseringsaktivitet, som visas som ett ytterligare band i SDS-PAGE-resultaten av MBP-neddragningsanalysen. Ett annat exempel på att använda metoden för att studera alternativ komplexbildning visas här.I samuttrycksanalysen interagerade 6xHistidine-taggade ENY2 både med GST-taggade Sgf11 och MBP-CTCF, men ingen GST-Sgf11 fanns i MBP-pulldowns och vice versa. En stegvis jämförelse av nödvändiga tidsintervall i arbetsflödet för den konventionella pulldown-analysen jämfört med pulldown kopplad till samuttryck visas här. Resultaten av att använda båda teknikerna för att studera samma interaktion mellan BTB-domänen för CP190-proteinet och den GST-märkta C-terminaldomänen för Drosophila CTCF-protein visas här.Rätt val av affinitets- och löslighetstest, Thioredoxin, GST eller MBP, är avgörande för ett effektivt utförande av analysen. Ett annat kritiskt steg är snabb och enhetlig cellstörning. Det rekommenderas starkt att använda multi-tip sonicator sonder.Denna metod möjliggör direkt studier av heterodimerbildningen mellan proteindomäner som annars bildar homodimerer som inte skulle disassociera under inkubationen av renade proteiner i konventionell pulldown-analys.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescensanisotropi som ett verktyg för att studera protein-proteininteraktioner

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

Med användning av eten-frigörande förening, 2-kloretylfosfonsyra, som ett verktyg för att studera Eten Response i bakterier

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylerade Cell-penetrerande peptider att studera intracellulära Protein-protein interaktioner

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems

Variationer på negativa fläcken elektronmikroskopi metoder: verktyg för att hantera utmanande system

Negative stain electron microscopy (EM) allows relatively simple and quick observation of macromolecules and macromolecular complexes through the use of ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens fluktuation spektroskopi haltbestämning av Protein-Protein interaktioner på Cell-Cell kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Tillämpning av Biolayer interferometri (BLI) för att studera protein-proteininteraktioner vid transkription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaktioner med och membran permeabilisering av hjärnans Mitokona av amyloid fibriller

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-affinitetsrening i kombination med RNA-sekvensering i grampositiva bakterier

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...