Name: pulldown assay coupled with co-expression in bacteria cells as a time-efficient tool for testing challenging protein-protein interactions
Uploaded: 2022-12-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions at JoVE.com

Bu çalışma, Rus Bilim Vakfı'nın 19-74-30026 (yöntem geliştirme ve doğrulama) ve 19-74-10099 (protein-protein etkileşim tahlilleri) projeleri tarafından desteklenmiştir; ve Rusya Federasyonu Bilim ve Yüksek Öğretim Bakanlığı tarafından 075-15-2019-1661 (temsili protein-protein etkileşimlerinin analizi) hibesi.

Yöntem iş akışının şematik gösterimi Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. E. coli'nin birlikte dönüşümü
<ol><li>Standart klonlama yöntemlerini kullanarak hedef proteinler için ekspresyon vektörleri hazırlayın. NOT: Tipik olarak, iyi bir başlangıç noktası, GST / MBP etiketli proteinlerin ekspresyonu için bir ampisilin direnç geni ve ColE1 orijinli geleneksel pGEX / pMAL vektörleri ve 6xHis etiketli proteinleri eks...

<ol>
	<li>Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions:+Pulldown+assays.">Protein-protein interactions: Pulldown assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).</li><li>Rose, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+dimerization,+coactivator+recognition+and+MODY3+mutations+in+HNF-1alpha.">Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).</li><li>Bonchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+diversity+and+homodimerization+specificity+of+zinc-finger-associated+domains+in+Drosophila.">Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila.</a> Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).</li><li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors.">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112 (2), 193-205 (2003).</li><li>Badonyi, M., Marsh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+protein+complex+interfaces+have+evolved+to+promote+co-translational+assembly.">Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly.</a> Elife. 11, 79602 (2022).</li><li>Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cotranslational+maturation+of+newly+synthesized+proteins.">Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins.</a> Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).</li><li>Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cotranslational+protein+maturation+in+bacteria.">Mechanisms of cotranslational protein maturation in bacteria.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 689755 (2021).</li><li>Shiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+assembly+of+protein+complexes+in+eukaryotes+revealed+by+ribosome+profiling.">Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling.</a> Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).</li><li>Shieh, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operon+structure+and+co-translational+subunit+association+direct+protein+assembly+in+bacteria.">Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria.</a> Science. 350 (6261), 678-680 (2015).</li><li>Bertolini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+nascent+proteins+translated+by+adjacent+ribosomes+drive+homomer+assembly.">Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly.</a> Science. 371 (6524), 57-64 (2021).</li><li>Bonchuk, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+highly+similar+spatial+organization+of+zinc-finger+associated+domains+with+a+very+low+sequence+similarity.">Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity.</a> Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).</li><li>Justin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+oncogenic+histone+H3K27M+inhibition+of+human+polycomb+repressive+complex+2.">Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2.</a> Nature Communications. 7, 11316 (2016).</li><li>Lariviere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+mediator+head+module.">Structure of the mediator head module.</a> Nature. 492 (7429), 448-451 (2012).</li><li>Taylor, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+T4+baseplate+and+its+function+in+triggering+sheath+contraction.">Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction.</a> Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).</li><li>Samara, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+assembly+and+function+of+the+SAGA+deubiquitinating+module.">Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module.</a> Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).</li><li>Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+assembly+and+activation+of+the+heterotetrameric+SAGA+histone+H2B+deubiquitinase+module.">Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module.</a> Cell. 141 (4), 606-617 (2010).</li><li>Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+ferritin:+modulation+of+subunit+stoichiometry+in+bacterial+expression+systems.">Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems.</a> Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).</li><li>Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+replication+of+plasmid+p15A+and+comparative+studies+on+the+nucleotide+sequences+around+the+origin+of+related+plasmids.">The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids.</a> Cell. 32 (1), 119-129 (1983).</li><li>Nijkamp, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+nucleotide+sequence+of+the+bacteriocinogenic+plasmid+CloDF13.">The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13.</a> Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).</li><li>Som, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+replication+of+Escherichia+coli+plasmid+RSF+1030.">Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030.</a> Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).</li><li>Tsao, K. L., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+production+of+two+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli+by+manipulating+plasmid+copy+number:+high-level+expression+of+heterodimeric+Ras+farnesyltransferase.">Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase.</a> Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).</li><li>Nallamsetty, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubility-enhancing+proteins+MBP+and+NusA+play+a+passive+role+in+the+folding+of+their+fusion+partners.">Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners.</a> Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).</li><li>Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+two-hybrid+assay+to+identify+interacting+proteins.">Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70 (2019).</li><li>Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+two-hybrid+(F2H)+assay+for+direct+analysis+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).</li><li>Fiebitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mammalian+two-hybrid+screening+for+protein-protein+interactions+using+transfected+cell+arrays.">High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays.</a> BMC Genomics. 9, 68 (2008).</li><li>Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+and+Sgfl1+proteins+form+alternative+complexes+with+ENY2+proteins.">CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins.</a> Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).</li><li>Maksimenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+new+insulator+proteins,+Pita+and+ZIPIC,+target+CP190+to+chromatin.">Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin.</a> Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).</li><li>Sabirov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+functional+role+of+the+interaction+between+CP190+and+the+architectural+protein+Pita+in+Drosophila+melanogaster.">Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster.</a> Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16 (2021).</li><li>Dong, S., Provart, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyses+of+protein+interaction+networks+using+computational+tools.">Analyses of protein interaction networks using computational tools.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).</li></ol>

Tarif edilen yöntem, in vitro olarak verimli bir şekilde monte edilemeyen ve birlikte ekspresyon gerektiren protein-protein etkileşimlerinin test edilmesine izin verir. Bu yöntem, homodimerizasyon yeteneğine sahip heterodimerize edici proteinleri incelemek için birkaç uygun yaklaşımdan biridir, çünkü ayrı ayrı saflaştırıldığında, bu tür proteinler deney sırasında çoğu zaman ayrışamayan ve yeniden birleşemeyen kararlı homodimerler oluşturur 3,11<sup...

Geleneksel pulldown, protein-protein etkileşimlerini incelemek için yaygın olarak kullanılır1. Bununla birlikte, saflaştırılmış proteinler genellikle in vitro2,3 etkili bir şekilde etkileşime girmez ve bazılarıbağlanma ortakları 4,5 olmadan çözünmez. Bu tür proteinler ko-translasyonel montaj veya moleküler şaperonların varlığı gerektirebilir 5,6,7,8,9. Konvansiyonel pulldown'un bir başka sınırlaması, 8,10 ile birlikte translasyonelolarak bir araya getirilmiş kararlı homo-oligomerler olarak var olabilen alanlar arasındaki olası heteromultimerizasyon aktivitesinin test edilmesidir, çünkü birçoğu kuluçka süresi boyunca in vitro olarak ayrışamaz ve yeniden ilişkilendirilemez. Bu tür sorunların üstesinden gelmede birlikte ifade etmenin yararlı olduğu bulunmuştur 3,11. Bakterilerde uyumlu vektörler kullanılarak birlikte ekspresyon, polikomb baskılayıcı kompleks PRC2 12, RNA polimeraz II mediatör kafa modülü 13, bakteriyofaj T4 taban plakası14, SAGA kompleksi deubikitinilaz modülü 15,16 ve ferritin 17'yi içeren büyük çok alt birimli makromoleküler kompleksleri saflaştırmak için başarıyla kullanılmıştır. Birlikte ifade için yaygın olarak kullanılan çoğaltma kaynakları ColE1, p15A18, CloDF1319 ve RSF20'dir. Ticari olarak temin edilebilen Duet ekspresyon sisteminde, bu kökenler farklı antibiyotik direnç genleri ve polisitronik vektörler üretmek için uygun çoklu klonlama bölgeleri ile birleştirilir ve sekiz proteine kadar ekspresyona izin verir. Bu kökenler farklı kopya numaralarına sahiptir ve hedef proteinlerin dengeli ekspresyon seviyelerini elde etmek için çeşitli kombinasyonlarda kullanılabilir21. Protein-protein etkileşimlerini test etmek için çeşitli afinite etiketleri kullanılır; en yaygın olanları 6xHistidin, glutatyon-S-transferaz (GST) ve maltoz bağlayıcı proteindir (MBP), bunların her biri karşılık gelen reçineye spesifik bir afiniteye sahiptir. GST ve MBP ayrıca etiketli proteinlerin çözünürlüğünü ve kararlılığını arttırır22.
Ökaryotik hücrelerde protein ko-ekspresyonunu içeren bir dizi yöntem de geliştirilmiştir, bunlardan en önemlisi maya iki hibrid tahlilidir (Y2H)23. Y2H testi ucuz, kolaydır ve çoklu etkileşimlerin test edilmesine izin verir; ancak, iş akışının tamamlanması 1 haftadan fazla sürer. Ayrıca, daha az sıklıkla kullanılan birkaç memeli hücre bazlı tahlil vardır, örneğin, floresan iki hibrid tahlil (F2H)24 ve hücre dizisi protein-protein etkileşim testi (CAPPIA)25. F2H testi nispeten hızlıdır ve doğal hücresel ortamlarında protein etkileşimlerini gözlemlemeye izin verir, ancak pahalı görüntüleme ekipmanlarının kullanılmasını içerir. Tüm bu yöntemler, doğal ökaryotik çeviri ve katlama ortamı sağlayan prokaryotik ifadeye göre avantajlıdır; Bununla birlikte, etkileşimi dolaylı olarak, transkripsiyonel aktivasyon veya genellikle eserler üreten floresan enerji transferi yoluyla tespit ederler. Ayrıca, ökaryotik hücreler, daha yüksek ökaryotların proteinleri arasındaki ikili etkileşimlerin test edilmesine müdahale edebilen, ilgilenilen proteinlerin diğer etkileşim ortaklarını içerebilir.
Bu çalışma, diferansiyel olarak etiketlenmiş proteinlerin bakteriyel birlikte ekspresyonu için bir yöntemi ve ardından geleneksel pulldown tekniklerini açıklamaktadır. Yöntem, birlikte ekspresyon gerektiren hedef proteinler arasındaki etkileşimlerin incelenmesine izin verir. Geleneksel pulldown'a kıyasla daha zaman verimlidir ve birden fazla hedefin toplu olarak test edilmesine izin verir, bu da çoğu durumda avantajlı olmasını sağlar. Uyumlu vektörler kullanılarak birlikte ifade, zahmetli bir klonlama adımı gerektirmediğinden polisitronik birlikte ifadeden daha uygundur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-ELEMENT probe</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>630-0586</td>
			<td>The high throughput 8-element sonicator probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose resin</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8021</td>
			<td>Resin for purification of MBP-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)&#160;</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69450-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R (Z605212)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A9782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione agarose</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>16100</td>
			<td>Resin for purification of GST-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni-NTA Superflow Agarose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25214</td>
			<td>Resin for purification of 6xHis-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>414753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pACYCDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71147</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCDFDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71340</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail VII</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539138</td>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSFDuet-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71341</td>
			<td>Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VC505 sonicator</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>CV334</td>
			<td>Ultrasonic liquid processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A6285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pulldown assay coupled with co-expression in bacteria cells as a time-efficient tool for testing challenging protein-protein interactions

Pulldown, kolay ve yaygın olarak kullanılan bir protein-protein etkileşim testidir. Bununla birlikte, in vitro olarak etkili bir şekilde bir araya gelmeyen protein komplekslerini incelemede sınırlamaları vardır. Bu tür kompleksler, ko-translasyonel montaj ve moleküler şaperonların varlığını gerektirebilir; ya in vitro olarak ayrışamayan ve yeniden birleşemeyen kararlı oligomerler oluştururlar ya da bağlayıcı bir partner olmadan kararsızdırlar. Bu sorunların üstesinden gelmek için, geleneksel pulldown tekniklerinin izlediği bir dizi uyumlu vektör kullanarak farklı şekilde etiketlenmiş proteinlerin bakteriyel birlikte ekspresyonuna dayanan bir yöntem kullanmak mümkündür. İş akışı, geleneksel pulldown'a kıyasla daha zaman verimlidir, çünkü etkileşime giren proteinlerin ayrı ayrı saflaştırılması ve sonraki inkübasyonlarının zaman alıcı adımlarından yoksundur. Diğer bir avantaj, önemli ölçüde daha az sayıda adım ve in vitro ortamda bulunan proteinlerin proteoliz ve oksidasyona maruz kaldığı daha kısa bir süre nedeniyle daha yüksek bir tekrarlanabilirliktir. Yöntem, diğer in vitro tekniklerin uygun olmadığı tespit edildiğinde bir dizi protein-protein etkileşimini incelemek için başarıyla uygulandı. Yöntem, protein-protein etkileşimlerini toplu olarak test etmek için kullanılabilir. BTB alanı ile içsel olarak düzensiz proteinler arasındaki etkileşimlerin ve çinko-parmak ile ilişkili alanların heterodimerlerinin çalışmaları için temsili sonuçlar gösterilmiştir.

Açıklanan yöntem birçok farklı hedefle rutin olarak kullanılmıştır. Burada, geleneksel pulldown teknikleri kullanılarak elde edilemeyen bazı temsili sonuçlar sunulmaktadır. Birincisi, spesifik ZAD (Çinko-parmak ile ilişkili alan) dimerizasyonunun incelenmesidir11. ZAD'ler stabil ve spesifik dimerler oluşturur, heterodimerler sadece paralog gruplar içindeki yakından ilişkili alanlar arasında mümkündür. Bu alanlar tarafından oluşturulan dimerler kararlıdır ve en az birkaç...

Watch this Scientific Journal Video about Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions at JoVE.com

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Burada, bir dizi uyumlu vektör kullanarak diferansiyel olarak etiketlenmiş proteinlerin bakteriyel birlikte ekspresyonu için bir yöntem açıklıyoruz, ardından in vitro olarak bir araya gelemeyen protein komplekslerini incelemek için geleneksel pulldown teknikleri izleniyor.

Pulldown Testi, Zorlu Protein-Protein Etkileşimlerini Test Etmek İçin Zaman Verimli Bir Araç Olarak Bakteri Hücrelerinde Ko-Ekspresyon ile Birleştiğinde

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

Bu yöntem, heterodimer oluşumu gibi verimli test örnekleri için birlikte ekspresyon gerektiren protein komplekslerinin oluşumlarını incelemeye izin verir. Bu yöntemin ana uç potansiyeli, verimli karmaşık montajı teşvik etmek için uyumlu vektörlerin kombinasyonlarını kullanarak farklı şekilde etiketlenmiş çalışılmış proteinlerin birlikte ekspresyonundan, zaman açısından verimli iş akışından ve çoklu etkileşimlerin hızlı yama testine izin veren ölçeklenebilirlikten yararlanmaktır. Bu yöntem aynı zamanda optimal protein ekspresyonu ve saflaştırma koşullarının hızlı bir şekilde taranması için de kullanılabilir.Görsel gösterim, protokolün birlikte ifade kurulumu, hücre bozulması ve sonraki açılır adımlar gibi kritik adımlarının doğru bir şekilde gerçekleştirilmesine yardımcı olur. Başlamak için, Luria-Bertani'de Escherichia coli BL21 (DE3) suşunu veya LB'yi, 37 santigrat derecelik ortamda, 0.1 ila 0.2'lik bir optik yoğunluğa veya OD'ye kadar büyütün. Bakteriyel süspansiyonun bir mililitresini dört santigrat derecede 9.000 G'de bir dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatanı atın.Daha sonra, 0,5 mililitre buz gibi soğuk dönüşüm tamponu veya TB ekleyin ve buz üzerinde 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, dört santigrat derecede 8.000 G'de 30 saniye boyunca santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Daha sonra, 100 mikrolitre TB tamponu, her vektörün 100 nanogramını ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe edin.150 saniye boyunca 42 santigrat derecede ısıtın, ardından bir dakika boyunca buz üzerinde soğutun. Daha sonra, antibiyotiksiz bir mililitre LB ortamı ekleyin ve 90 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, süspansiyonu% 0.5 glikoz ve karşılık gelen antibiyotikler içeren bir LB agar plakasına kaplamadan önce peleti 100 mikrolitre LB ortamında santrifüj edin ve yeniden askıya alın.Plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri plakadan iki mililitre LB ortamı ile karşılık gelen antibiyotiklerle 50 mililitre LB ortamına yıkayın. Sonraki deneyler için eksi 70 santigrat derecede eksi% 20 gliserol içeren bir aliquot depolamadan önce metal iyonları veya diğer bilinen ko-faktörleri ekleyin.Hücreleri 37 santigrat derecede 220 RPM'lik sabit bir dönüşle 0,5 ila 0,7 OD'ye büyütün. Kültürü oda sıcaklığına soğutun ve IPTG'yi bir milimolün son konsantrasyonuna ekleyin. İndüklenmemiş numunenin kontrolü olarak 20 mikrolitrelik bir hücre süspansiyonu aliquot'u saklayın.Hücreleri gece boyunca 18 santigrat derecede 220 RPM'de inkübe edin. Ertesi gün, bakteriyel süspansiyonu iki parçaya bölün ve protein ekspresyonunu doğrulamak için 20 mikrolitrelik alikotları saklayın. Kalan hücre süspansiyonunu 15 dakika boyunca 4.000 G'de santrifüj edin.Pulldown testi için, peletleri bir mililitre buz gibi soğuk lizis tamponunda, proteaz inhibitörleri ve deneyden hemen önce eklenen indirgeyici ajanlarla yeniden askıya alın. Test edilen proteinler için tampon bileşimini ayarlayın. Buz üzerinde sonikasyon ile hücreleri bozun ve elektroforez için 20 mikrolitrelik bir aliquot saklayın.30 dakika boyunca 16.000 G'de santrifüj yapın ve elektroforez için 20 mikrolitre arıtılmış lizat toplayın. Reçineyi 10 dakika boyunca bir mililitre buz gibi soğuk lizis tamponu ile dengeleyin, ardından 30 saniye boyunca 2.000 G'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Reçineye hücre lizatları ekleyin ve 15 RPM'lik sabit bir dönüşte 10 dakika boyunca inkübe edin.Daha sonra, analiz için bağlanmamış fraksiyonun 20 mikrolitresini toplamadan önce süpernatantı santrifüj edin ve atın. Daha sonra, bir mililitre buz gibi soğuk yıkama tamponu ekleyin ve bir dakika boyunca inkübe edin. Yine, süpernatanı santrifüj yapın ve atın.Ardından, buz gibi soğuk yıkama tamponu ile iki uzun yıkama gerçekleştirin. İkinci yıkamadan sonra, bağlı proteinleri 50 mikrolitre elüsyon tamponu ile 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 1.200 RPM'de bir çalkalayıcıda süzün. Salınan proteinleri SDS poliakrilamid jel elektroforezi ile analiz edin.Çinko parmakla ilişkili alan veya ZAD, maltoz bağlayıcı protein veya MBP'de homo-dimerizasyon ve 6xHistidin pulldown tahlilleri ile ilgili çalışmalar burada gösterilmiştir. MBP ve Thioredoxin 6xHistidin-kaynaşmış ZAD'lerin birlikte ekspresyonu, MBP pulldown testinin SDS-PAGE sonuçlarında ek bir bant olarak görünen, iyi ve tekrarlanabilir homodimerizasyon aktivitesi gösterir. Alternatif kompleks oluşumu incelemek için yöntemi kullanmanın bir başka örneği burada gösterilmiştir.Ortak ifade testinde, 6xHistidine etiketli ENY2 hem GST etiketli Sgf11 hem de MBP-CTCF ile etkileşime girdi, ancak MBP pulldown'larında GST-Sgf11 yoktu ve bunun tersi de geçerliydi. Burada, geleneksel pulldown testinin iş akışında gerekli zaman aralıklarının, birlikte ifadeye bağlı pulldown ile karşılaştırıldığında adım adım karşılaştırılması gösterilmektedir. CP190 proteininin BTB alanı ile Drosophila CTCF proteininin GST etiketli C-terminal alanı arasındaki aynı etkileşimi incelemek için her iki tekniğin de kullanılmasının sonuçları burada gösterilmiştir.Doğru afinite ve çözünürlük testi, Thioredoxin, GST veya MBP seçimi, tahlilin verimli bir şekilde yürütülmesi için kritik öneme sahiptir. Bir diğer kritik adım hızlı ve düzgün hücre bozulmasıdır. Çok uçlu sonikatör probların kullanılması şiddetle tavsiye edilir.Bu yöntem, geleneksel pulldown testinde saflaştırılmış proteinlerin inkübasyonu sırasında ayrılmayan homodimerler oluşturan protein alanları arasındaki heterodimer oluşumunun doğrudan incelenmesine izin verir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

Aracı Olarak Etilen serbest Bileşik, 2-chloroethylphosphonic acid, kullanan Bakterilerin Etilen Yanıtı Eğitim için

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

İntraselüler Protein-protein etkileşimleri çalışmaya Biotinylated hücre Penetran peptidler

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems

Negatif varyasyonlarında leke elektron mikroskobu yöntemleri: sistemleri zorlu mücadele için Araçlar

Negative stain electron microscopy (EM) allows relatively simple and quick observation of macromolecules and macromolecular complexes through the use of ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Transkripsiyon protein-protein etkileşimlerini Incelemek için Biolayer Interferometri (BLı) uygulaması

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Amiloid Fibrils ile Beyin Mitokondrisi ile Etkileşimler ve Membran Permeabilizasyonu

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-Benzeşim Saflaştırma gram-pozitif bakterilerde RNA Dizilimi ile birleştiğinde

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...