Name: population and single-cell analysis of antibiotic persistence in escherichia coli
Uploaded: 2023-03-24T13:50:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli at JoVE.com

يتم دعم العمل في مختبر Van Melderen من خلال إجراءات ARC 2018-2023 ، الصندوق الوطني للبحوث العلمية (FNRS CDR J.0182.21F). يتم دعم TO من خلال زمالة ULB. يتم دعم T.S. من قبل زمالة FRIA (FNRS). يتم دعم JC من خلال زمالة ما بعد الدكتوراه "القائم بأعمال البحوث" (FNRS).

<ol>
	<li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitions+and+guidelines+for+research+on+antibiotic+persistence.">Definitions and guidelines for research on antibiotic persistence.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (7), 441-448 (2019).</li><li>Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+between+resistance,+tolerance+and+persistence+to+antibiotic+treatment.">Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).</li><li>Pribis, J. P., Zhai, Y., Hastings, P. J., Rosenberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+mutagenesis,+gambler+cells,+and+stealth+targeting+antibiotic-induced+evolution.">Stress-induced mutagenesis, gambler cells, and stealth targeting antibiotic-induced evolution.</a> mBio. 13 (3), 01074 (2022).</li><li>Molina-Quiroz, R. C., Lazinski, D. W., Camilli, A., Levy, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-sequencing+analysis+unveils+novel+genes+involved+in+the+generation+of+persister+cells+in+uropathogenic+Escherichia+coli.">Transposon-sequencing analysis unveils novel genes involved in the generation of persister cells in uropathogenic Escherichia coli.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6907-6910 (2016).</li><li>Cameron, D. R., Shan, Y., Zalis, E. A., Isabella, V., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+determinant+of+persister+cell+formation+in+bacterial+pathogens.">A genetic determinant of persister cell formation in bacterial pathogens.</a> Journal of Bacteriology. 200 (17), 00303-00318 (2018).</li><li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+involved+in+bacteriostatic+antibiotic-induced+persister+formation.">Identification of genes involved in bacteriostatic antibiotic-induced persister formation.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 413 (2018).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+genes+involved+in+Escherichia+coli+persistence+to+tosufloxacin.">Identification of novel genes involved in Escherichia coli persistence to tosufloxacin.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 581986 (2020).</li><li>Verstraeten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obg+and+membrane+depolarization+are+part+of+a+microbial+bet-hedging+strategy+that+leads+to+antibiotic+tolerance.">Obg and membrane depolarization are part of a microbial bet-hedging strategy that leads to antibiotic tolerance.</a> Molecular Cell. 59 (1), 9-21 (2015).</li><li>Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+persister+fractions+suggests+different+mechanisms+of+formation+among+environmental+isolates+of+E.+coli.">Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli.</a> BMC Microbiology. 13 (1), 25 (2013).</li><li>Huemer, M., Mairpady Shambat, S., Brugger, S. D., Zinkernagel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+and+persistence-Implications+for+human+health+and+treatment+perspectives.">Antibiotic resistance and persistence-Implications for human health and treatment perspectives.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51034 (2020).</li><li>Wilmaerts, D., Windels, E. M., Verstraeten, N., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+mechanisms+leading+to+persister+formation+and+awakening.">General mechanisms leading to persister formation and awakening.</a> Trends in Genetics. 35 (6), 401-411 (2019).</li><li>Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ploidy+is+an+important+determinant+of+fluoroquinolone+persister+survival.">Ploidy is an important determinant of fluoroquinolone persister survival.</a> Current Biology. 31 (10), 2039-2050 (2021).</li><li>Lemma, A. S., Soto-Echevarria, N., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoroquinolone+persistence+in+Escherichia+coli+requires+DNA+repair+despite+differing+between+starving+populations.">Fluoroquinolone persistence in Escherichia coli requires DNA repair despite differing between starving populations.</a> Microorganisms. 10 (2), 286 (2022).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li><li>Morawska, L. P., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+tolerance+in+environmentally+stressed+Bacillus+subtilis:+Physical+barriers+and+induction+of+a+viable+but+nonculturable+state.">Antibiotic tolerance in environmentally stressed Bacillus subtilis: Physical barriers and induction of a viable but nonculturable state.</a> microLife. 3, (2022).</li><li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+persisters+enabled+by+a+&#223;-lactam-induced+filamentation+method+reveals+their+stochastic+single-cell+awakening.">Enrichment of persisters enabled by a &#223;-lactam-induced filamentation method reveals their stochastic single-cell awakening.</a> Communications Biology. 2 (1), 426 (2019).</li><li>Leygeber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+microbial+population+heterogeneity-Expanding+the+toolbox+of+microfluidic+single-cell+cultivations.">Analyzing microbial population heterogeneity-Expanding the toolbox of microfluidic single-cell cultivations.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (23), 4569-4588 (2019).</li><li>Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Escherichia+coli+growth+rate+to+osmotic+shock.">Response of Escherichia coli growth rate to osmotic shock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7807-7812 (2014).</li><li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starvation+induces+shrinkage+of+the+bacterial+cytoplasm.">Starvation induces shrinkage of the bacterial cytoplasm.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (24), 2104686118 (2021).</li><li>Goode, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+Escherichia+coli+cells+have+a+lower+intracellular+pH+than+susceptible+cells+but+maintain+their+pH+in+response+to+antibiotic+treatment.">Persister Escherichia coli cells have a lower intracellular pH than susceptible cells but maintain their pH in response to antibiotic treatment.</a> mBio. 12 (4), 00909-00921 (2021).</li><li>Manuse, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persisters+are+a+stochastically+formed+subpopulation+of+low-energy+cells.">Bacterial persisters are a stochastically formed subpopulation of low-energy cells.</a> PLoS Biology. 19 (4), 3001194 (2021).</li><li>Fisher, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+imaging+of+E.+coli+nucleoid+organization+and+dynamics+in+living+cells.">Four-dimensional imaging of E. coli nucleoid organization and dynamics in living cells.</a> Cell. 153 (4), 882-895 (2013).</li><li>Cabral, D., Wurster, J., Belenky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+persistence+as+a+metabolic+adaptation:+Stress,+metabolism,+the+host,+and+new+directions.">Antibiotic persistence as a metabolic adaptation: Stress, metabolism, the host, and new directions.</a> Pharmaceuticals. 11 (1), 14 (2018).</li><li>Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar+and+broth+dilution+methods+to+determine+the+minimal+inhibitory+concentration+(MIC)+of+antimicrobial+substances.">Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.</a> Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).</li><li>Goormaghtigh, F., Van Melderen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+and+characterization+of+Escherichia+coli+persister+cells+to+ofloxacin+in+exponential+cultures.">Single-cell imaging and characterization of Escherichia coli persister cells to ofloxacin in exponential cultures.</a> Science Advances. 5 (6), (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicrobeJ,+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis.">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nature Microbiology. 1 (7), 16077 (2016).</li><li>Odsbu, I., Skarstad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+compaction+in+the+early+part+of+the+SOS+response+is+dependent+on+RecN+and+RecA.">DNA compaction in the early part of the SOS response is dependent on RecN and RecA.</a> Microbiology. 160 (5), 872-882 (2014).</li><li>Pham, T. D. M., Ziora, Z. M., Blaskovich, M. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quinolone+antibiotics.">Quinolone antibiotics.</a> MedChemComm. 10 (10), 1719-1739 (2019).</li><li>Drlica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quinolones:+Action+and+resistance+updated.">Quinolones: Action and resistance updated.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 9 (11), 981-998 (2009).</li><li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+antibiotics+kill+bacteria:+From+targets+to+networks.">How antibiotics kill bacteria: From targets to networks.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 423-435 (2010).</li><li>Reyes-Lamothe, R., Sherratt, D. J., Leake, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+and+architecture+of+active+DNA+replication+machinery+in+Escherichia+coli.">Stoichiometry and architecture of active DNA replication machinery in Escherichia coli.</a> Science. 328 (5977), 498-501 (2010).</li><li>Lesterlin, C., Ball, G., Schermelleh, L., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA+bundles+mediate+homology+pairing+between+distant+sisters+during+DNA+break+repair.">RecA bundles mediate homology pairing between distant sisters during DNA break repair.</a> Nature. 506 (7487), 249-253 (2014).</li><li>Alexeeva, S., Gadella, T. W. J., Verheul, J., Verhoeven, G. S., Den Blaauwen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+interactions+of+early+and+late+assembling+division+proteins+in+Escherichia+coli+cells+resolved+by+FRET:+Bacterial+division+studied+by+spectral+FRET.">Direct interactions of early and late assembling division proteins in Escherichia coli cells resolved by FRET: Bacterial division studied by spectral FRET.</a> Molecular Microbiology. 77 (2), 384-398 (2010).</li><li>Miesenb&#246;ck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Yaginuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+ATP+concentrations+in+a+single+bacterial+cell+population+revealed+by+quantitative+single-cell+imaging.">Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging.</a> Scientific Reports. 4, 6522 (2014).</li><li>Ermakova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+genetically+encoded+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide.">Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nature Communications. 5, 5222 (2014).</li><li>Kapuscinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAPI:+A+DNA-specific+fluorescent+probe.">DAPI: A DNA-specific fluorescent probe.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).</li></ol>

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

يسمح البروتوكول المقدم في هذه الورقة بتحليل النمط الظاهري للثبات الذي لوحظ استجابة للعلاج بالمضادات الحيوية على مستوى السكان والخلية الواحدة. أجريت التجارب باستخدام سلالة E. coli MG1655 ، التي نمت في وسط محدد كيميائيا (MOPS glycerol 0.4٪). تم إجراء فحوصات قتل الوقت وتجارب الفحص المجهري على ثقافات المرحلة الأسية. استخدمنا OFX ، وهو فلوروكينولون ، بتركيز 5 ميكروغرام · مل − 1 للكشف عن الخلايا الثابتة. يمكن تطبيق الأساليب الموضحة هنا على المضادات الحيوية الأخرى المبيدة للجراثيم ، مثل β-lactams أو aminoglycosides أو المركبات المضادة للميكروبات31. وفقا لذلك ، يمكن استخدام سلالات بكتيرية أخرى أو وسائط أو ظروف نمو. يمكن أن تكون مراقبة عمليات الاندماج الفلورية المختلفة في إعداد مشابه لتلك الموصوفة هنا مفيدة لمتابعة العمليات الخلوية مثل تكرار الحمض النووي 32 ، وإصلاح الحمض النووي25،33 ، وانقسام الخلايا34 قبل العلاج بالمضادات الحيوية وأثناءه وبعده. وبالمثل ، يمكن استغلال مراسلي الفلورسنت للتحقيق في جوانب متميزة من فسيولوجيا الخلية ، مثل مستويات الأس الهيدروجيني35 أو ATP36 أو ROS37 داخل الخلايا. بدلا من الانصهار الفلوري ، يمكن أيضا تطبيق الأصباغ الكيميائية. على سبيل المثال ، يمكن استبدال اندماج hupA-mCherry ب 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ، وهي صبغة فلورية تلطخ الحمض النووي38. ومع ذلك ، يجب تجنب إجراء الفحص المجهري بفاصل زمني إلى جانب هذه الأصباغ الفلورية ، لأن تقنيات التلوين هذه يمكن أن تزعج ديناميكيات دورة الخلية أثناء تجارب الفاصل الزمني. بدلا من ذلك ، يمكن استبدال هذه التجارب بتحليلات الدورة الزمنية لتصوير اللقطات في النقاط الزمنية ذات الصلة.
في حين أن مثل هؤلاء المراسلين الفلورسنت مفيدون ، لا ينبغي إهمال كمية المعلومات التي يمكن استخراجها من خلال تحليل صور تباين الطور. هنا ، راقبنا تطور طول الخلية طوال مراحل النمو وعلاج OFX والتعافي. يمكن أيضا استخراج المعلمات الأخرى القائمة على صور تباين الطور ، مثل عرض الخلية وشدة تباين الطور وانحناءات الخلايا البكتيرية ، بسهولة باستخدام برامج مناسبة ، مثل MicrobeJ27.
باختصار ، يمكن تطبيق الإجراء الموصوف هنا على الحالات والأنواع البكتيرية الأخرى لمراقبة الاستجابات الخلوية للبيئات المتغيرة أو الضغوطات18,19. باستخدام مراسلين فلورسنت آخرين (مراسلون نسخيون ومتعدون ، صبغة كيميائية) بالاقتران مع تحليل السكان ، مثل قياس التدفق الخلوي / FACS ، يمكن معالجة الأسئلة المثيرة للاهتمام في إطار متعدد المقاييس.

يهدف هذا البروتوكول إلى تحليل النمط الظاهري للثبات البكتيري استجابة لعلاج مضاد حيوي محدد على مستوى الخلية الواحدة والسكان. يصف الثبات قدرة المجموعات السكانية الفرعية الصغيرة داخل مجموعة متجانسة جينيا على تحمل جرعات عالية من المضادات الحيوية المبيدة للجراثيم (الفلوروكينولونات ، الأمينوغليكوزيدات ، β لاكتام ، إلخ) ، مع الحد الأدنى من التركيز المثبط (MIC) لما يسمى بالخلايا الثابتة مطابق لتركيز الجزء الأكبر من السكان. تكشف ديناميكيات القتل ثنائية الطور ، عند قياس بقاء البكتيريا بمرور الوقت في وجود مضاد حيوي ، عن وجود خلايا تتحمل الأدوية بشكل عابر ، مع استئصال سريع أولي للخلايا غير الثابتة ، يليه معدل قتل أبطأ بكثير للخلايا الثابتة. عند إزالة المضادات الحيوية ، تؤدي هذه الخلايا إلى ظهور مجموعة متطابقة وراثيا تعرض ديناميكيات قتل مماثلة عند معالجتها بنفس المضاد الحيوي 1,2. على عكس الثبات ، يتم تعريف مقاومة المضادات الحيوية على مستوى السكان وهي عموما نتيجة لطفرات دي نوفو أو النقل الجيني الأفقي للبلازميد3 الذي يمنح المقاومة. في حين أن الطفرات المسؤولة عن المقاومة تقع في الغالب في هدف الدواء أو في المناطق الترويجية لمضخات تدفق الدواء ، أثبتت الجينات التي تغير تردد الثبات الذي حددته مناهج تحليل الطفرات على مستوى الجينوم والمستهدفة أنها عديدة ومتنوعة2،3،4،5،6،7،8 . لذلك ، من المحتمل أن تدخل الخلايا البكتيرية إلى الحالة الثابتة من خلال مسارات متعددة9،10،11 ، وهناك حاجة إلى طرق للتحقيق في ظاهرة الثبات على مستوى الخلية الواحدة لتوصيف فسيولوجيا هذه الخلايا الثابتة.
مهد التطور الأخير لأدوات الموائع الدقيقة المستخدمة مع الفحص المجهري الفلوري الطريق لتوصيف النمط الظاهري للثبات وسلط الضوء على دور العمليات الخلوية الرئيسية ، مثل تكرار الكروموسوم 12 ، وإصلاح الحمض النووي13 ، وانقسام الخلايا14 ، في تكوين الخلايا الثابتة. في هذه الورقة ، نصف نهجا متكاملا يجمع بين فحوصات علم الأحياء الدقيقة الكلاسيكية والتصوير الحي أحادي الخلية لتوصيف الخلايا الثابتة المتولدة في مزارع الإشريكية القولونية المتنامية بشكل كبير والمعالجة بجرعة عالية من أوفلوكساسين. يمكن تطبيق البروتوكول الموصوف هنا لدراسة ظاهرة ثبات المضادات الحيوية في الأنواع البكتيرية الأخرى ، مثل Bacillus subtilis15 ، أو الظروف (على سبيل المثال ، استمرار المضادات الحيوية بعد العلاج β-lactam16) ويمكن تعديله بسهولة للتحقيق في العديد من الظواهر التي تنطوي على عدم تجانس النمط الظاهري 17،18،19 . علاوة على ذلك ، يمكن دمج الإعداد الموصوف في هذه الورقة مع مراسلين فلورسنت آخرين للتحقيق في المعلمات الخلوية المتميزة ذات الأهمية ، مثل المستويات داخل الخلايا من الرقم الهيدروجيني20 أو ATP21 على مستوى الخلية الواحدة ، والتي قد تنتج رؤى جديدة في ظاهرة استمرار المضادات الحيوية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axio Observer</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2.2H2O&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02382.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX Microfluidic System&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CAX2-S0000&#160;</td>
			<td>Microfluidic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX2 FG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ONIX2 1.0.1&#160;</td>
			<td>Microfluidic software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX2 Manifold Basic&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CAX2-MBC20</td>
			<td>Manifold system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2.6H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02539.0100</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4.5H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02790.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td>Carbon source for MOPS glucose 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+)</td>
			<td></td>
			<td>BE10</td>
			<td>wt reference strain, lab strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) hupA-mCherry::FRT-kan-FRT</td>
			<td></td>
			<td>BE16</td>
			<td>HU-mCherry fusion integrated via P1 transduction at the native locus, lab strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4.7H2O&#160;</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>24244.232</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://fiji.sc/&#160;</td>
			<td>Image software; Schindelin et al. if used in publication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>56815</td>
			<td>Carbon source for MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR&#174; multiwell culture plate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M8812-100EA</td>
			<td>24-well clear flat bottom 2ml volume culture plate for automated plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768-1KG</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 digital camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td>Digital Image Acqusition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05099.1000</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05029.1000</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05153.0500</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Broth agar medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22700041</td>
			<td>Growth medium for plating assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Broth medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12780029</td>
			<td>Growth medium for MIC determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H2O&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05832.1000</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td>Dilution solution for bacterial survival assay used at 10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicrobeJ&#160;</td>
			<td>Imagej/Fiji plugin</td>
			<td>https://www.microbej.com/</td>
			<td>Microscopy image analysis plugin. Ducret et al.for in publication; Detection settings: For bacteria : Area (&#956;m2): 0,1-max; Length (&#956;m): 0,5-max; Width (&#956;m): 0,6-max; Range (&#956;m): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Plates CellASIC ONIX</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B04A-03-5PK&#160;</td>
			<td>Plate for microfluidic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2.4H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05927.0100</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, Free Acid ULTROL&#174; Grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>475898-500GM</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>SIgma-Aldrich</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)6Mo7O24.4H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01180.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01145.0500</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ofloxacin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>82419-36-1</td>
			<td>Fluoroquinolone antibiotic used to treat the bacterial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4, 1x</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Dilution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENESYS 10S UV-Visible Spectrophotometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>&#160;840-208200</td>
			<td>UV-Visible Spectrophotometer, Single/Six Cell Holder with PrinterMeasurement of optical density OD600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftMax Pro</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microplate reader software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-[Tris(hydroxym&#233;thyl)-m&#233;thyl]-glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08602.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss&#174; immersion Oil 518F</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Immersion oil to increase resolution of microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen3.2 Pro</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscopic image acquisition and processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4.7H2O&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08883.0500</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

population and single-cell analysis of antibiotic persistence in escherichia coli

يشير استمرار المضادات الحيوية إلى قدرة المجموعات الفرعية البكتيرية الصغيرة على تحمل جرعات عالية من المضادات الحيوية المبيدة للجراثيم بشكل عابر. عند العلاج بالمضادات الحيوية للجراثيم ، يتم قتل الجزء الأكبر من البكتيريا بسرعة. هذه المرحلة الأولى السريعة من القتل يتبعها انخفاض كبير في معدل القتل حيث تظل الخلايا الثابتة قابلة للحياة. تقليديا ، يتم تحديد الثبات على مستوى السكان من خلال مقايسات الوقت / القتل التي يتم إجراؤها بجرعات عالية من المضادات الحيوية ولأوقات التعرض المحددة. في حين أن هذه الطريقة توفر معلومات حول مستوى الخلايا الثابتة وحركية القتل ، إلا أنها تفشل في عكس عدم التجانس الجوهري من خلية إلى خلية الكامنة وراء ظاهرة الثبات. يجمع البروتوكول الموصوف هنا بين مقايسات الوقت / القتل الكلاسيكية وتحليل الخلية الواحدة باستخدام الفحص المجهري الفلوري في الوقت الفعلي. باستخدام مراسلي الفلورسنت المناسبين ، يمكن أن يوفر التصوير المجهري للخلايا الحية معلومات تتعلق بتأثيرات المضادات الحيوية على العمليات الخلوية ، مثل تكرار الكروموسوم وفصله ، واستطالة الخلايا ، وانقسام الخلايا. يسمح الجمع بين تحليل السكان والخلية الواحدة بالتوصيف الجزيئي والخلوي للنمط الظاهري للاستمرار.

Watch this Scientific Journal Video about Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli at JoVE.com

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

يصف ثبات المضادات الحيوية قدرة المجموعات السكانية الفرعية الصغيرة داخل مجموعة سكانية حساسة متساوية المنشأ على تحمل جرعات عالية من المضادات الحيوية المبيدة للجراثيم بشكل عابر. يجمع البروتوكول الحالي بين مناهج لتوصيف النمط الظاهري لاستمرار المضادات الحيوية على المستويين الجزيئي والخلوي بعد تعريض الإشريكية القولونية لجرعات مميتة من أوفلوكساسين.

تحليل السكان والخلية المفردة لاستمرار المضادات الحيوية في الإشريكية القولونية

Antibiotic persistence refers to the capacity of small bacterial subpopulations to transiently tolerate high doses of bactericidal antibiotics. Upon ...

يوفر البروتوكول الموصوف هنا طريقة تكاملية تجمع بين فحوصات علم الأحياء الدقيقة الكلاسيكية والتصوير الحي أحادي الخلية لتوصيف الخلايا الثابتة للإشريكية القولونية بعد العلاج بارتفاع مستوى الأوفلوكساسين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي تحليل ظاهرة الثبات على مستوى السكان والخلية الواحدة. يسمح الجمع بين تحليل السكان والخلية الواحدة بالتوصيف الجزيئي والخلوي للنمط الظاهري للاستمرار.للبدء ، قم بخط السلالة البكتيرية المثيرة للاهتمام من مخزون الجلسرين المجمد على صفيحة أجار LB ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية طوال الليل لمدة 15 إلى 19 ساعة للحصول على مستعمرات واحدة. قم بتلقيح مستعمرة معزولة في أنبوب زجاجي يحتوي على خمسة ملليلتر من وسط نمو MOPS المكمل ب 0.4٪ جلوكوز ، وإذا لزم الأمر ، أضف مضادا حيويا انتقائيا إلى الوسط. ضع الأنبوب في حاضنة اهتزاز عند 37 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة طوال الليل.في اليوم التالي ، أجهزة الطرد المركزي ملليلتر واحد من الثقافة في 2،300 غرام لمدة ثلاث دقائق لحبيبات الخلايا ، وإعادة تعليق الحبيبات برفق بنفس الحجم من PBS. قم بقياس OD عند 600 نانومتر ، واحسب الحجم المطلوب ل OD600 الأولي من 0.01 في الحجم النهائي من 2 ملليلتر. بعد ذلك ، أضف ملليلتر من MOPS glycerol 0.4٪ في بئر ذات قاع شفاف ، صفيحة 24 بئرا ، وقم بتلقيحها بحجم الاستزراع المحسوب بين عشية وضحاها.ضع اللوحة المكونة من 24 بئرا في قارئ صفيحة مجهرية آلي لمراقبة OD600 لمدة 24 ساعة. اضبط قارئ الصفيحة الدقيقة لقياس OD600 كل 15 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية وبدوران مداري مرتفع يبلغ 140 دورة في الدقيقة. قم بإذابة 100 ملليلتر من أجار LB ، وقم بتخزين القارورة عند 55 درجة مئوية لتجنب التصلب.قم بإعداد ست قوارير زجاجية صغيرة ، وماصة خمسة ملليلتر من وسط أجار LB السائل في كل قارورة باستخدام ماصة معقمة. خذ 10 ميكرولتر من خمسة ملليغرام لكل ملليلتر من محلول مخزون أوفلوكساسين ، وخفف في 90 ميكرولتر من الماء عالي النقاء. أضف كميات متزايدة من أوفلوكساسين المخفف إلى كل من القوارير الزجاجية الستة التي تحتوي على وسط أجار LB للحصول على تركيز نهائي من صفر إلى 0.1 ميكروغرام لكل ملليلتر من أوفلوكساسين.امزج المحلول عن طريق تدوير القوارير عدة مرات ، واسكب وسائط أجار LB المضافة بالمضادات الحيوية في صفيحة استزراع من ستة آبار. دع الآجار يبرد حتى يصلب ، وجفف اللوحة قبل الاستخدام. تمييع ثقافة بكتيرية بين عشية وضحاها إلى كثافة الخلية النهائية من واحد في 10 إلى CFU السابع لكل ملليلتر مع برنامج تلفزيوني.ضع ميكرولتر من المستنبتة المخففة على كل بئر من الطبق المجفف المكون من ستة آبار. اترك البقع تجف قبل وضع الطبق في حاضنة عند 37 درجة مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، تحقق من تركيز أوفلوكساسين الذي يمنع نمو مستعمرات البكتيريا.صب ما يقرب من 25 ملليلتر من أجار LB المحضر في طبق بتري. ثم أضف خمس إلى ثماني حبات زجاجية معقمة لكل طبق صلب ومجفف. عكس وتسمية اللوحات.بعد ذلك ، قم بإعداد أنابيب زجاجية مخففة تسلسلية عشرة أضعاف تحتوي على 900 ميكرولتر من محلول كبريتات المغنيسيوم 0.01 مولار. في أنبوب زجاجي ، قم بتخفيف ثقافة ليلية في وسط جديد ومعدل درجة الحرارة إلى OD600 نهائي يبلغ حوالي 0.001 ، واترك الثقافة تنمو بين عشية وضحاها في حاضنة. في اليوم التالي ، عندما يصل OD600 إلى 0.3 ، قم بنقل 100 ميكرولتر من الثقافة للتخفيف وفقا لبيانات الفحص الموضعي.أداء تخفيف المسلسل عشرة أضعاف من الثقافة البكتيرية. ثم لوحة 100 ميكرولتر من الثقافة المخففة على لوحات أجار LB المعدة. أضف التركيز المطلوب من أوفلوكساسين إلى الثقافة البكتيرية ، واستمر في الحضانة عند 37 درجة مئوية أثناء الهز.في النقاط الزمنية ذات الصلة ، اسحب 100 ميكرولتر من الثقافة ، وقم بتخفيف الثقافة وفقا لبيانات الفحص الموضعي. لوحة 100 ميكرولتر من الثقافة المخففة على لوحات أجار LB. في اليوم التالي ، احسب مستعمرات الصفائح المحتضنة بين عشية وضحاها عند أعلى تخفيفين يمكن اكتشاف المستعمرات الخاصة بهما.احسب نسبة البقاء على قيد الحياة عن طريق تطبيع CFU لكل مليلتر في كل نقطة زمنية عند CFU لكل مليلتر عند T0 ، وارسم القيمة الطبيعية لقاعدة اللوغاريتم 10 كدالة للوقت. قم بإزالة محلول الحفظ من كل بئر من صفيحة الموائع الدقيقة ، واستبدله بوسط استزراع جديد. قم بإغلاق لوحة الموائع الدقيقة بنظام المشعب بالنقر فوق الزر Seal أو من خلال برنامج الموائع الدقيقة.بعد ذلك ، على واجهة برنامج الموائع الدقيقة ، قم بإجراء تسلسل فتيلة أول بالنقر فوق تشغيل تسلسل فتيلة السائل. احتضان اللوحة في خزانة يتم التحكم فيها حراريا من المجهر عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل قبل بدء التصوير المجهري. ثم ابدأ تسلسل تشغيل Liquid Priming الثاني قبل بدء التجربة.قم بإغلاق لوحة الموائع الدقيقة بالنقر فوق Unseal Plate على واجهة برنامج الموائع الدقيقة. استبدل الوسط في الآبار ب 200 ميكرولتر من الوسط الطازج ، والمضادات الحيوية التي تحتوي على وسط طازج ، وعينة استزراع مخففة 0.01 OD في الوسط الطازج. بعد إغلاق لوحة الموائع الدقيقة كما هو موضح من قبل ، ضع اللوحة على هدف المجهر داخل خزانة المجهر.في برنامج الموائع الدقيقة ، انقر فوق تشغيل تسلسل تحميل الخلية للسماح بتحميل الخلايا في لوحة الموائع الدقيقة. اضبط التركيز البؤري الأمثل باستخدام وضع الضوء المرسل ، وحدد عدة مناطق ذات أهمية حيث يمكن ملاحظة عدد خلايا مناسب يصل إلى 300 خلية لكل حقل. في برنامج الموائع الدقيقة ، قم بتحرير تشغيل تسلسل مخصص لبرمجة حقن الوسط الطازج عند 6.9 كيلو باسكال لمدة ست ساعات إلى البئرين الأول والثاني ، يليه الوسط الذي يحتوي على مضاد حيوي عند 6.9 كيلو باسكال أو ست ساعات إلى بئر ثلاثة ، وأخيرا الوسط الطازج عند 6.9 كيلو باسكال لمدة 24 ساعة إلى البئرين الرابع والخامس.قم بإجراء التصوير المجهري في وضع الفاصل الزمني بإطار واحد كل 15 دقيقة باستخدام الضوء المرسل ومصدر ضوء الإثارة لمراسل الفلورسنت ، وابدأ برنامج الموائع الدقيقة. افتح برنامج ImageJ أو Fiji على الكمبيوتر، واسحب صور الفحص المجهري بفاصل زمني للمكدس الفائق إلى شريط تحميل فيجي. استخدم الصورة، متبوعة باللون، ثم Make Composite لدمج القنوات المختلفة للمكدس الفائق.استخدم الصورة، اللون، ثم ترتيب القنوات إذا كانت القنوات لا تتوافق مع اللون المرغوب. افتح المكون الإضافي MicrobeJ ، واكتشف الخلايا البكتيرية باستخدام واجهة التحرير اليدوي. احذف الخلايا المكتشفة تلقائيا ، وحدد يدويا الخلايا الثابتة ذات الاهتمام إطارا تلو الآخر.بعد الاكتشاف ، استخدم رمز النتيجة في واجهة التحرير اليدوي MicrobeJ لإنشاء جدول ResultJ. استخدم جدول ResultJ للحصول على رؤى حول المعلمات المختلفة ذات الأهمية لتحليل الخلية الواحدة، واحفظ ملف ResultJ. تم تحديد MIC من ofloxacin لكلا السلالتين ليكون 0.06 ميكروغرام لكل ملليلتر ، مما يشير إلى أن اندماج hupA-mCherry لم يؤثر على حساسية أوفلوكساسين مقارنة بالسلالة البرية المتجانسة المنشأ.أظهر الفحص الموضعي استنساخا معزولا عند التخفيفات المناسبة بمرور الوقت ، على سبيل المثال ، 10 إلى التخفيف الخامس السالب في الوقت صفر. في مقايسة القتل الزمني ، لوحظ منحنى ثنائي الطور نموذجي حيث يعكس المنحدر الأول القتل السريع للسكان غير الثابتين. أظهرت المرحلة الثانية معدل قتل أبطأ ، وكشفت عن وجود خلايا ثابتة تتحمل الأدوية.والجدير بالذكر أن منحنى قتل الوقت يظهر أن بروتين اندماج hupA-mCherry لم يؤثر على حركية قتل الوقت. في تجربة الموائع الدقيقة ، تشير مرحلة النمو الأولى إلى أن الخلايا كانت قابلة للحياة وتنقسم قبل علاج أوفلوكساسين. بعد مرحلة النمو الأولى هذه ، تم حظر انقسام الخلايا بمجرد وصول المضاد الحيوي إلى الخلايا.بعد علاج أوفلوكساسين ، عند التروية بوسط جديد ، لم تتمكن الغالبية العظمى من الخلايا من استئناف النمو. في المقابل، يمكن لمجموعة فرعية صغيرة أن تستطيل وتولد خلايا خيطية، والتي تعرف بأنها الخلايا الثابتة. ولدت خيوط الانقسام المستمر خلايا ابنة متعددة ، بدأ معظمها في النمو والانقسام بشكل مشابه للخلايا غير المعالجة.ارتبطت الزيادة في طول الخلية بزيادة في إجمالي كثافة مضان mCherry ، مما يعكس إعادة تشغيل النسخ المتماثل وزيادة وفرة النيوكليويدات. عند استخدام سلالة تحتوي على مراسل داخل الخلايا لدراسة الثبات ، فمن الإمبراطوري أن وجود المراسل لا يتداخل مع النمو ، MIC ، والقتل مقارنة بسلالة من النوع البري. يمكن تطبيق الإجراء الموصوف هنا على الحالات وأنواع البكتيريا الأخرى لمراقبة الاستجابات الخلوية للبيئات أو الضغوط المتغيرة.باستخدام مراسلين فلورسنت آخرين في إعداد مماثل ، يمكن التحقيق في رؤى جديدة في فسيولوجيا الخلايا الثابتة.

Research

JoVE Journal

Biology

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

على الفحص لقياس نشاط القولونية محرض يسين Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

ارتفاع المناولة فحص النشاط Endoglucanase الفطرية في القولونية</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

رسم خرائط الشبكات الوظيفية البكتيرية والممرات في<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المصفوفات الوراثية الاصطناعية

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

تحديد بروتين في مجمعات<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

بروتوكول السريع لإعداد Electrocompetent<em&gt; كولاي</em&gt; و<em&gt; ضمة الكوليرا</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

الكشف عن لايف<em&gt; كولاي</em&gt; O157: H7 من قبل خلايا PMA-QPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

تنقية الكروماتوغرافي من غير البروتينية المؤتلف الإيلاستين مثل والإنشطار مع الببتيدات والبروتينات من<em&gt; كولاي</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

فوائد متعددة الأوجه من البروتين المشارك في التعبير<em&gt; الإشريكية القولونية</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

طريقة لتصنيف النصوص في الخلايا الفردية الإشريكيّة القولونية للأسفار جزيء واحد في الموقع تجارب التهجين

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...