Name: population and single-cell analysis of antibiotic persistence in escherichia coli
Uploaded: 2023-03-24T13:50:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli at JoVE.com

Van Melderen实验室的工作得到了ARC行动2018-2023的支持，即国家科学研究基金会（FNRS CDR J.0182.21F）。T.O.由ULB奖学金支持。TS由FRIA奖学金（FNRS）支持。J.C.得到了博士后奖学金“临时研究”（FNRS）的支持。

<ol>
	<li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitions+and+guidelines+for+research+on+antibiotic+persistence.">Definitions and guidelines for research on antibiotic persistence.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (7), 441-448 (2019).</li><li>Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+between+resistance,+tolerance+and+persistence+to+antibiotic+treatment.">Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).</li><li>Pribis, J. P., Zhai, Y., Hastings, P. J., Rosenberg, S. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoroquinolone+persistence+in+Escherichia+coli+requires+DNA+repair+despite+differing+between+starving+populations.">Fluoroquinolone persistence in Escherichia coli requires DNA repair despite differing between starving populations.</a> Microorganisms. 10 (2), 286 (2022).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li><li>Morawska, L. P., Kuipers, O. 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作者声明没有竞争利益。

本文中提出的方案允许分析在群体和单细胞水平上观察到的对抗生素治疗响应的持久性表型。实验使用大肠杆菌MG1655菌株进行，该菌株在化学定义的培养基（MOPS甘油0.4%）中生长。对指数期培养物进行定时杀灭测定和显微镜实验。我们使用浓度为5μg·mL−1的氟喹诺酮类药物OFX来揭示持久性细胞。这里描述的方法可以应用于其他杀菌抗生素，例如β-内酰胺类、氨基糖苷类或抗菌化合物31。因此，可以使用其他细菌菌株、培养基或生长条件。在与此处描述的类似的设置中监测不同的荧光融合可用于在抗生素治疗之前、期间和之后跟踪细胞过程，例如 DNA 复制 32、DNA 修复25、33 和细胞分裂34。同样，可以利用荧光报告基因来研究细胞生理学的不同方面，例如细胞内pH35，ATP 36或ROS37水平。除了荧光融合之外，还可以应用化学染料。例如，hupA-mCherry融合可以用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）代替，DAPI是一种染色DNA38的荧光染料。然而，应避免使用这种荧光染料进行延时显微镜检查，因为这些染色技术会在延时实验期间扰乱细胞周期的动力学。或者，这种实验可以用相关时间点的快照成像的时程分析代替。
虽然这种荧光报告基因很有帮助，但通过分析相衬图像可以提取的信息量也不容忽视。在这里，我们监测了整个生长、OFX 处理和恢复阶段的细胞长度演变。基于相衬图像的其他参数，例如细胞宽度，相衬强度和细菌细胞的曲率，也可以通过使用适当的软件（例如MicrobeJ27）轻松提取。
总之，这里描述的程序可以应用于其他条件和细菌物种，以监测细胞对不断变化的环境或压力源的反应18，19。通过将其他荧光报告基因（转录和翻译报告基因、化学染料）与群体分析（如流式细胞术/FACS）结合使用，可以在多尺度框架中解决有趣的问题。

该协议旨在分析在单细胞和群体水平上响应特定抗生素治疗的细菌持久性表型。持久性描述了同基因群体中小亚群承受高剂量杀菌抗生素（氟喹诺酮类、氨基糖苷类、β-内酰胺类等）的能力，所谓的持久性细胞的最小抑制浓度（MIC）与大部分人群的抑制浓度相同。双相杀伤动力学，当测量细菌在抗生素存在下随时间推移的存活时，揭示了短暂耐药细胞的存在，最初快速根除非持久性细胞，随后对持久性细胞的杀伤速度要慢得多。去除抗生素后，这些细胞会产生基因相同的群体，当用相同的抗生素处理时，这些群体表现出相似的杀伤动力学1，2。与持久性相反，抗生素耐药性是在群体水平上定义的，通常是新生突变或赋予耐药质粒的水平基因转移的结果3。虽然导致耐药性的突变主要位于药物靶标或药物外排泵的促进者区域，但改变全基因组和靶向突变分析方法鉴定的持久性频率的基因已被证明是多种多样的2，3，4，5，6，7，8.因此，细菌细胞很可能通过多种途径9，10，11进入持久性状态，并且需要在单细胞水平上研究持久性现象的方法来表征这些持久性细胞的生理学。
最近与荧光显微镜结合使用的微流体工具的发展为持久性表型的表征铺平了道路，并强调了关键细胞过程（例如染色体复制12，DNA修复13和细胞分裂14）在持久性细胞形成中的作用。在本文中，我们描述了一种将经典微生物学测定与单细胞实时成像相结合的综合方法，以表征用高剂量氧氟沙星处理的指数生长的大肠杆菌培养物中产生的持久性细胞。此处描述的方案可用于研究其他细菌物种中的抗生素持久性现象，例如枯草芽孢杆菌15或条件（例如，β-内酰胺处理后的抗生素持久性16），并且可以很容易地修改以研究涉及表型异质性的许多现象17，18，19.此外，本文中描述的设置可以与其他荧光报告基因结合使用，以研究感兴趣的不同细胞参数，例如单细胞水平的pH20或ATP21的细胞内水平，这可能会对抗生素持久性现象产生新的见解。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axio Observer</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2.2H2O&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02382.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX Microfluidic System&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CAX2-S0000&#160;</td>
			<td>Microfluidic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX2 FG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ONIX2 1.0.1&#160;</td>
			<td>Microfluidic software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX2 Manifold Basic&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CAX2-MBC20</td>
			<td>Manifold system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2.6H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02539.0100</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4.5H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02790.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td>Carbon source for MOPS glucose 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+)</td>
			<td></td>
			<td>BE10</td>
			<td>wt reference strain, lab strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) hupA-mCherry::FRT-kan-FRT</td>
			<td></td>
			<td>BE16</td>
			<td>HU-mCherry fusion integrated via P1 transduction at the native locus, lab strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4.7H2O&#160;</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>24244.232</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://fiji.sc/&#160;</td>
			<td>Image software; Schindelin et al. if used in publication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>56815</td>
			<td>Carbon source for MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR&#174; multiwell culture plate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M8812-100EA</td>
			<td>24-well clear flat bottom 2ml volume culture plate for automated plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768-1KG</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 digital camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td>Digital Image Acqusition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05099.1000</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05029.1000</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05153.0500</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Broth agar medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22700041</td>
			<td>Growth medium for plating assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Broth medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12780029</td>
			<td>Growth medium for MIC determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H2O&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05832.1000</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td>Dilution solution for bacterial survival assay used at 10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicrobeJ&#160;</td>
			<td>Imagej/Fiji plugin</td>
			<td>https://www.microbej.com/</td>
			<td>Microscopy image analysis plugin. Ducret et al.for in publication; Detection settings: For bacteria : Area (&#956;m2): 0,1-max; Length (&#956;m): 0,5-max; Width (&#956;m): 0,6-max; Range (&#956;m): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Plates CellASIC ONIX</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B04A-03-5PK&#160;</td>
			<td>Plate for microfluidic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2.4H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05927.0100</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, Free Acid ULTROL&#174; Grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>475898-500GM</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>SIgma-Aldrich</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)6Mo7O24.4H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01180.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01145.0500</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ofloxacin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>82419-36-1</td>
			<td>Fluoroquinolone antibiotic used to treat the bacterial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4, 1x</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Dilution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENESYS 10S UV-Visible Spectrophotometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>&#160;840-208200</td>
			<td>UV-Visible Spectrophotometer, Single/Six Cell Holder with PrinterMeasurement of optical density OD600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftMax Pro</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microplate reader software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-[Tris(hydroxym&#233;thyl)-m&#233;thyl]-glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08602.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss&#174; immersion Oil 518F</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Immersion oil to increase resolution of microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen3.2 Pro</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscopic image acquisition and processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4.7H2O&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08883.0500</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

population and single-cell analysis of antibiotic persistence in escherichia coli

抗生素持久性是指小细菌亚群暂时耐受高剂量杀菌抗生素的能力。在杀菌抗生素治疗后，大部分细菌种群被迅速杀死。杀伤的第一个快速阶段之后是杀伤率的大幅降低，因为持久性细胞仍然存活。通常，持久性是通过使用高剂量抗生素和规定的暴露时间进行的时间/杀伤测定在群体水平上确定的。虽然这种方法提供了有关持久性细胞水平和杀伤动力学的信息，但它未能反映持久性现象背后的内在细胞间异质性。这里描述的方案将经典的时间/杀伤测定与使用实时荧光显微镜的单细胞分析相结合。通过使用适当的荧光报告基因，活细胞的显微镜成像可以提供有关抗生素对细胞过程的影响的信息，例如染色体复制和分离，细胞伸长和细胞分裂。结合群体和单细胞分析可以对持久性表型进行分子和细胞表征。

如上所述，用于持久细胞单细胞表型分析的菌株在MOPS甘油0.4%培养基中表征。随着时间的推移，对OD600nm 的监测显示 wt 和 hupA-mCherry菌株之间没有差异（图1）。这表明HU-mCherry融合蛋白的表达在这些条件下不影响生长。最初接种在OD600nm 为0.01的两种菌株的细菌细胞在接种后±8小时达到指数期。
OFX的MIC通过标准化方法（此处为连续琼脂稀释）测定24。MIC被定义为未检测到可见生长的最小浓度。两种菌株的OFX的MIC均为0.06 μg·mL−1，表明与同基因wt菌株相比，hupA-mCherry融合对OFX的敏感性没有影响（图2）。
我们进一步确定了致命的OFX治疗（83倍MIC）对本研究中使用的两种菌株的活力的影响。随着OFX暴露的活细胞数量随着时间的推移而减少，因此需要适当调整细菌培养物的稀释度，以达到每板30至300个菌落。为了确定随时间推移的适当稀释度，进行了点测定，其中使用多通道移液器将 10 μL 的 0 至 10−7 次连续 10 倍稀释液置于方形培养皿上。适当的稀释度是分离克隆可见的稀释液（例如，在t0 = 10−5，t1h = 10−4/10−3，t4h = 10−2/10-1时）（图3）。
虽然斑点测定是深入了解 OFX 介导的杀伤动力学的简单方法，但它无法准确确定杀伤动力学。当通过定时杀伤测定监测用OFX处理的指数生长细胞的活力时，观察到典型的双相曲线（图4）。曲线的第一个斜率反映了非持久性种群的快速杀戮（红色虚线）。在这里测试的条件下，高达99.9%的细胞在OFX存在下3小时后无法形成集落。第一阶段的杀伤之后是第二阶段，显示出较慢的杀伤率（蓝色虚线），这揭示了耐药持久性细胞的存在。在测试的条件下，持久性阶段在添加 OFX 后约 3 小时开始，突出了将细胞暴露于 OFX 超过 3 小时以研究持久性表型的必要性。重要的是，时间杀灭曲线表明 hupA-mCherry 融合蛋白对定时动力学没有影响。因此，编码翻译荧光融合的菌株可用于使用荧光显微镜监测持久性细胞。
我们进一步研究了单细胞水平的持久性现象。为此，将hupA-mCherry菌株引入微流体板中，该微流体板允许改变培养基条件（此处为生长，处理和恢复），同时对给定的ROI进行延时显微镜检查。在微流体实验的第一步中，将引入微流体装置的细胞注入生长培养基（MOPS甘油0.4%），并以~2小时的生成时间分开（图5和图6）。生长的第一阶段表明细胞在OFX处理之前是有活力的并且正在积极分裂。 
在第一阶段的生长之后，将细胞灌注补充有5μg·mL−1 OFX的生长培养基6 h。一旦抗生素到达细胞，细胞分裂就会被阻断（图5 和 图6）。OFX处理6小时后，将细胞灌注新鲜培养基。虽然绝大多数细胞无法恢复生长（图5 和 图6），但一小部分细菌亚群能够伸长并产生丝状细胞25。这些细胞在OFX处理后能够分裂并产生活的子细胞，可以定义为持久性细胞。
由于此设置允许在治疗之前，期间和之后可视化持久性细胞，因此它不仅提供了有关恢复阶段持久性表型的信息，而且还提供了有关治疗前持久性细胞的生理状态的信息（图6）。在测试的条件下，持久性细胞在OFX处理之前与非持久性细胞的分裂相似，表明观察到的持久性细胞并非来自休眠亚群（图6）25。
在恢复阶段对持久细胞的细胞长度分析表明，每根细丝都有特定的伸长率。每个持久在第一次分裂之前达到的细胞长度因一个持久体而异。同样，第一次除法事件的时间也非常不均匀（图6）。分裂的持久性细丝产生多个子细胞，这些子细胞开始生长和分裂，在大多数情况下，类似于未处理的细胞（图7）。然后，细丝的连续分裂导致细胞长度逐渐减少，最终产生与OFX处理前具有相似细胞长度的子细胞（图6 和 图7B）。绝大多数细胞在OFX去除后无法诱导丝状。这个大的细胞群对应于死细胞（图5 和 图6）。
类核相关蛋白HU的荧光融合允许可视化核苷酸22的动力学。细胞内HU-mCherry的总荧光强度分析可用作DNA含量22，25的代理。在生长期（OFX处理之前），总mCherry荧光强度变化，反映了细胞周期中染色体复制和分离的动力学（图8）。添加 OFX 后，mCherry 荧光在细胞中部增加，表明类核压实，这已被证明是由双链 DNA 断裂的形成诱导的28（图 5）。双链DNA断裂是OFX作用机制的结果，OFX破坏II型拓扑异构酶DNA-gyrase和拓扑异构酶IV29，30。在大肠杆菌中，DNA旋转酶是OFX29，30的主要靶标。通过在双链传代机制的关键步骤结合其靶标，OFX抑制裂解DNA链的降级，最终导致双链DNA断裂的释放30。如上所述，OFX处理的持久细胞在恢复期间开始成丝25（图6）。细胞长度的增加与总mCherry荧光强度的增加相关，这反映了复制重启和细丝25中类核丰度的增加（图7a和图8）。对于死细胞，总mCherry荧光强度在处理和恢复阶段保持稳定，表明这些细胞在OFX去除后无法复制其染色体（图8）。还显示了在氧氟沙星治疗之前，期间和之后的大肠杆菌HU-mCherry细胞的微流体视频（视频1）。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64550/64550fig1v3.jpg"> 图1：wt和hupA-mCherry E. coli菌株的生长监测。 wt（黑色）和hupA-mCherry（红色）的光密度监测（OD600 nm）。阴影和虚线表示生物一式三份的标准偏差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64550/64550fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64550/64550fig2v2.jpg"> 图 2：测定 OFX 对 wt 和 hupA-mCherry 大肠杆菌 菌株的 MIC。 在LB培养基中生长 wt （♦）和 hupA-mCherry （●），并在含OFX的LB琼脂的连续稀释液上点样2 μL（每个面板中的浓度，单位为μg·mL−1）。生长抑制在至少0.06μg·mL−1下可见。该图是生物一式三份的代表性实验。比例尺 = 1 厘米。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64550/64550fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64550/64550fig3v2.jpg"> 图 3：暴露于 OFX 时 wt 和 hupA-mCherry 大肠杆菌菌株的点测定。 如方案（第3节）所述，将（A）wt和（B）hupA-mCherry菌株在MOPS甘油0.4%中生长，并用5μg·mL−1 OFX处理指数生长的细胞（OD600 nm = 0.3）。T0 对应于添加 OFX 之前的时间点。T1，T2，T3，T4，T5和T6对应于OFX添加后1-6小时。该图是生物一式三份的代表性实验。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64550/64550fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64550/64550fig4v2.jpg"> 图 4：暴露于 OFX 时 wt 和 hupA-mCherry 大肠杆菌菌株的定时测定。 如方案（第4节）所述，在MOPS甘油0.4%中生长wt（♦）和hupA-mCherry（●）菌株，用5μg·mL−1 OFX处理指数生长的细胞（OD600 nm = 0.3）。虚线表示第一个“快速”（红色）杀伤阶段和第二个“慢速”（蓝色）杀伤阶段，对应于敏感和持续亚群（分别通过 T0 和 T2 之间以及 T3 和 T6 之间的线性回归获得）。误差线表示生物一式三份的标准偏差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64550/64550fig4v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64550/64550fig5v2.jpg"> 图 5：使用微流体工具的 OFX 持久性和死细胞的代表性图像。 代表性显微镜图像显示了使用 hupA-mCherry 菌株进行的微流体实验的相关时间点（灰色相差，红色HU-mCherry信号）。表达标记的 hupA-mCherry 的细胞在微流控板中生长（此处为4小时），然后进行OFX攻击（5μg·mL−1）。在OFX存在下6小时后，将细胞注入新鲜培养基，使持久性细胞恢复。在OFX处理期间和OFX去除后的持久细胞及其后代细胞分别以绿色和蓝色突出显示。每个面板上都标明了相应的时间点。比例尺 = 5 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64550/64550fig5v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64550/64550fig6v2.jpg"> 图6：持续细胞和死细胞长度的显微镜延时分析。 死细胞（红色，n = 109）和持久细胞（灰色，n = 13）的细胞长度分析。OFX处理的开始（5 μg·mL−1）用红色虚线（5 h）表示，OFX去除用蓝色虚线表示。插图对应于添加 OFX 之前的生长阶段。实验一式三份进行。阴影和虚线表示死细胞群的标准偏差（n = 109）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64550/64550fig6v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64550/64550fig7v2.jpg"> 图7：OFX代表性持久性的显微镜延时分析。 （A）在OFX去除后8.5小时（微流控实验开始后18.5小时，包括4小时生长，6小时5μg·mL-1 OFX处理和8.5小时OFX去除后恢复）由丝分裂产生的代表性OFX持久性及其子细胞的Kymograph。一帧对应 15 分钟。比例尺 = 5 μm。 （B） 由 A 中的持久 kymograph 生成的掩模。受监视的持久单元格用蓝色轮廓表示，子单元格以不同的颜色突出显示。（C）从B生成的持久细胞谱系的示意图。颜色编码与 B 相同。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64550/64550fig7v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64550/64550fig8v2.jpg"> 图8：代表性持久细胞和死细胞的细胞长度和mCherry荧光分析。 在微流体延时实验中分析代表性持久性（黑色和红色实线）和代表性死细胞（黑色和红色虚线）的细胞长度（左轴）和总HU-mCherry荧光强度（右轴，以任意单位显示）。OFX处理的开始（5 μg·mL−1）用红色虚线表示，OFX去除用蓝色虚线表示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64550/64550fig8v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
视频1： 大肠杆菌 HU-mCherry细胞在氧氟沙星治疗之前，期间和之后的微流体视频。 微流体延时成像显示HU-mCherry细胞。将细胞在MOPS甘油0.4%中生长4小时。OFX处理6 h（5 μg·mL−1）后，将无抗生素培养基灌注到微流控板中，使持久细胞恢复。比例尺 = 5 μm。指示时间（以分钟为单位）。生长和恢复阶段用“MOPS-Gly”表示。0.4%“和”OFX 5 μg/mL“的 OFX 处理。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64550/Video1.mov" target="_blank">请点击此处下载此视频。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">10x 拖把</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>储备液</td>
			<td>1 L 10x MOPS 的储备溶液体积</td>
			<td>10x MOPS基座的最终浓度</td>
		</tr><tr><td>拖把酸</td>
			<td>1 M（使用 KOH 调节至 pH 7.4）</td>
			<td>400毫升</td>
			<td>0，4 米</td>
		</tr><tr><td>三辛</td>
			<td>1 M（使用 KOH 调节至 pH 7.4）</td>
			<td>40毫升</td>
			<td>0.04 米</td>
		</tr><tr><td>二氧化铁4.7H2O</td>
			<td>0.01 米</td>
			<td>10毫升</td>
			<td>0.0001 米</td>
		</tr><tr><td>NH4厘升</td>
			<td>1，9 米</td>
			<td>50毫升</td>
			<td>0.095 米</td>
		</tr><tr><td>K2SO4 </td>
			<td>0.276 米</td>
			<td>10毫升</td>
			<td>0.00276 米</td>
		</tr><tr><td>氯化钙 2.2H2 O</td>
			<td>0.0005 米</td>
			<td>10毫升</td>
			<td>0.000005 米</td>
		</tr><tr><td>氯化镁 2.6H2O</td>
			<td>0.528 米</td>
			<td>10毫升</td>
			<td>0.00528 米</td>
		</tr><tr><td>氯化钠</td>
			<td>直接添加 29.2 克</td>
			<td></td>
			<td>0，5 米</td>
		</tr><tr><td>蒸馏水</td>
			<td></td>
			<td>460毫升</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>微量营养素1000x（见表2）</td>
			<td></td>
			<td>10毫升</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>表 1：10x MOPS 的组成。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">微量营养素 1000x</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>微量营养素浓度 1000x 储备液</td>
			<td>10x MOPS基座的最终浓度</td>
		</tr><tr><td>（NH4）6Mo7O24.4H2O</td>
			<td>0.000003 米</td>
			<td>0.00000003 米</td>
		</tr><tr><td>H 3BO3 </td>
			<td>0.0004 米</td>
			<td>0.000004 米</td>
		</tr><tr><td>氯化钴 2.6H2 O</td>
			<td>0.00003 米</td>
			<td>0.0000003 米</td>
		</tr><tr><td>铜4.5H 2O</td>
			<td>0.00001 米</td>
			<td>0.0000001 米</td>
		</tr><tr><td>氯化锰 2.4H2 O</td>
			<td>0.00008 米</td>
			<td>0.0000008 米</td>
		</tr><tr><td>锌硫醚.7H2O</td>
			<td>0.00001 米</td>
			<td>0.0000001米</td>
		</tr></tbody></table>表 2：1，000x 微量营养素的组成。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">MOPS 葡萄糖 0.4% 或 MOPS 甘油 0.4%</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>储备液</td>
			<td>1 L MOPS 葡萄糖 0.4 % 或 MOPS 甘油 0.4 % 的体积</td>
			<td>最终浓度为 MOPS 葡萄糖 0.4% 或 MOPS 甘油 0.4%</td>
		</tr><tr><td>10x 拖把</td>
			<td>见表1</td>
			<td>100毫升</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>K2HPO4</td>
			<td>0.132 米</td>
			<td>10毫升</td>
			<td>0.00132 米</td>
		</tr><tr><td>葡萄糖（对于 MOPS 葡萄糖 0.4%）</td>
			<td>20%（20 g在 100 mL 蒸馏水中）</td>
			<td>20毫升</td>
			<td>0.40%</td>
		</tr><tr><td>甘油（用于MOPS甘油0.4%）</td>
			<td>≤99%</td>
			<td>4毫升</td>
			<td>0.40%</td>
		</tr><tr><td>蒸馏水</td>
			<td></td>
			<td>0.4% MOPS 葡萄糖为 870 mL，0.4% MOPS 甘油为 886 mL</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>表3：0.4%MOPS葡萄糖和0.4%MOPS甘油的组成。

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Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

抗生素持久性描述了敏感等基因人群中的小亚群暂时耐受高剂量杀菌抗生素的能力。本协议结合了在将 大肠杆菌 暴露于致死剂量的氧氟沙星后在分子和细胞水平上表征抗生素持久性表型的方法。

大肠杆菌抗生素持久性的群体和单细胞分析

Antibiotic persistence refers to the capacity of small bacterial subpopulations to transiently tolerate high doses of bactericidal antibiotics. Upon ...

此处描述的方案提供了一种综合方法，将经典微生物学测定与单细胞活体成像相结合，以表征高氧氟沙星处理后大肠杆菌持久性细胞。该技术的主要优点是在群体和单细胞水平上分析持久性现象。结合群体和单细胞分析可以对持久性表型进行分子和细胞表征。首先，从LB琼脂平板上的冷冻甘油原液中划线感兴趣的细菌菌株，并在37摄氏度下孵育过夜15至19小时以获得单个菌落。在含有5毫升补充有0.4%葡萄糖的MOPS生长培养基的玻璃管中接种分离的菌落，如果需要，将选择性抗生素添加到培养基中。将试管置于37摄氏度和180rpm的振荡培养箱中过夜。第二天，将一毫升培养物以2， 300g离心三分钟以沉淀细胞，并用相同体积的PBS轻轻重悬沉淀。测量 600 纳米处的 OD，并计算初始 OD 600 在 2 毫升的最终体积中为 0.01 所需的体积。接下来，将两毫升MOPS甘油0.4%培养基加入透明底部24孔板的孔中，并接种计算的过夜培养体积。将 24 孔板放入自动酶标仪中以监测 OD 600 24 小时。将酶标仪设置为在 37 摄氏度的温度和 140 rpm 的高轨道旋转下每 15 分钟测量一次 OD 600。融化 100 毫升 LB 琼脂，并将烧瓶储存在 55 摄氏度以避免凝固。准备六个小玻璃烧瓶，并使用无菌移液管将五毫升液体LB琼脂培养基移入每个烧瓶中。取每毫升5毫克的氧氟沙星储备溶液10微升，用90微升超纯水稀释。向含有LB琼脂培养基的六个玻璃烧瓶中加入增加体积的稀释氧氟沙星，以获得每毫升氧氟沙星0至0.1微克的最终浓度。通过旋转烧瓶数次混合溶液，并将添加抗生素的LB琼脂培养基倒入六孔培养板中。让琼脂冷却直至凝固，并在使用前将板干燥。用PBS将过夜细菌培养物稀释至最终细胞密度为每毫升10至7CFU的1倍。将两微升稀释的培养物点到干燥的六孔板的每个孔上。让斑点干燥，然后将板放入 37 摄氏度的培养箱中过夜。第二天，检查氧氟沙星浓度下抑制细菌菌落的生长。将约25毫升准备好的LB琼脂倒入培养皿中。然后在每个固化和干燥的板上加入五到八个无菌玻璃珠。倒置并标记板。接下来，制备含有900微升0.01摩尔硫酸镁溶液的十倍系列稀释玻璃管。在玻璃管中，在新鲜和温度调节的培养基中稀释过夜培养物至最终OD 600约0.001，并使培养物在培养箱中生长过夜。第二天，当OD 600达到0.3时，根据点测定数据转移100微升培养物进行稀释。对细菌培养物进行十倍的连续稀释。然后将100微升稀释的培养物铺在制备的LB琼脂平板上。将所需浓度的氧氟沙星加入细菌培养物中，并在振荡的同时继续在37摄氏度下孵育。在相关时间点，提取100微升培养物，并根据现场测定数据稀释培养物。在LB琼脂平板上平板上平板100微升稀释培养物。第二天，将过夜孵育板的菌落计数为可以检测到菌落的两个最高稀释度。通过在 T0 处对每个时间点的 CFU 每毫升 CFU 进行归一化来计算存活率，并将对数基数 10 归一化值绘制为时间的函数。从微流体板的每个孔中取出保存溶液，并用新鲜培养基代替。通过单击“密封”按钮或通过微流体软件，用歧管系统密封微流体板。接下来，在微流体软件界面上，通过单击运行液体启动序列来执行第一个启动序列。在开始显微镜成像之前，将板在显微镜的恒温控制柜中以37摄氏度孵育至少两个小时。然后在开始实验之前开始第二个运行液体启动序列。通过单击微流体软件界面上的“解封板”来密封微流体板。用200微升新鲜培养基，含有抗生素的新鲜培养基和新鲜培养基中的0.01OD稀释培养样品替换孔中的培养基。如前所示密封微流控板后，将板放在显微镜柜内的显微镜物镜上。在微流控软件中，单击“运行细胞加载序列”以允许将细胞加载到微流控板中。使用透射光模式设置最佳焦点，并选择几个感兴趣的区域，在这些区域，每个视场最多可以观察到 300 个像元的适当像元数。在微流控软件上，编辑运行自定义序列以编程将新鲜培养基以 6.9 千帕卡的速度注入一号和二号井 6 小时，然后以 6.9 千帕卡或 6 小时向三号井注入含有抗生素的培养基，最后以 6.9 千帕的新鲜培养基向四号和五号井注射 24 小时。使用透射光和荧光报告基因的激发光源在延时模式下以每15分钟一帧进行显微镜成像，并启动微流体程序。在计算机上打开 ImageJ 或斐济软件，然后将超堆栈延时显微镜图像拖到斐济加载栏中。使用“图像”，然后使用“颜色”，然后使用“合成”来融合超堆栈的不同通道。使用“图像”、“颜色”，如果通道与所需颜色不对应，请使用“排列通道”。打开 MicrobeJ 插件，使用手动编辑界面检测细菌细胞。删除自动检测到的单元格，并逐帧手动勾勒感兴趣的持久单元格。检测后，使用 MicrobeJ 手动编辑界面中的 Result 图标生成 ResultJ 表。使用 ResultJ 表深入了解单细胞分析的不同感兴趣参数，并保存 ResultJ 文件。确定两种菌株的氧氟沙星MIC为0.06 μg/毫升，表明与同基因野生型菌株相比，hupA-mCherry融合不影响氧氟沙星的敏感性。斑点测定显示分离的克隆随时间的适当稀释度，例如，在时间零处为10至负第五稀释。在定时杀灭测定中，观察到典型的双相曲线，其中第一个斜率反映了非持久性种群的快速杀灭。第二阶段显示出较慢的杀伤率，揭示了耐药持久性细胞的存在。值得注意的是，时间杀灭曲线显示hupA-mCherry融合蛋白不影响定时杀动力学。在微流体实验中，第一个生长阶段表明细胞在氧氟沙星处理之前是有活力和分裂的。在第一个生长阶段之后，一旦抗生素到达细胞，细胞分裂就会被阻断。氧氟沙星处理后，用新鲜培养基灌注，绝大多数细胞无法恢复生长。相比之下，一个小亚群可以伸长并产生丝状细胞，这些细胞被定义为持久性细胞。分裂的持久性细丝产生多个子细胞，其中大多数开始生长和分裂，类似于未处理的细胞。细胞长度的增加与总mCherry荧光强度的增加相关，这反映了复制重启和类核丰度的增加。当使用含有细胞内报告基因的菌株来研究持久性时，与野生型菌株相比，报告基因的存在不会干扰生长、MIC和杀伤。这里描述的程序可以应用于其他条件和细菌种类，以监测细胞对环境或压力变化的反应。通过在相同的设置中使用其他荧光报告基因，可以探测到对持久细胞生理学的新见解。

Research

JoVE Journal

Biology

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

用于测量的活性测定大肠埃希氏菌诱导赖氨酸Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

科研

生物学

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

真菌内切葡聚糖酶的活性高通量筛选大肠埃希氏菌</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

测绘细菌功能的网络和途径<em&gt;大肠杆菌</em使用合成基因阵列

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

蛋白复合物的鉴定<em&gt;大肠杆菌</em使用顺序肽亲和纯化技术相结合串联质谱法

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

对于电感受的制备快速协议<em&gt;大肠杆菌</em&gt;和<em&gt;霍乱弧菌</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

检测现场的<em&gt;大肠杆菌</em&gt; O157：H7细胞的PMA-qPCR的

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

重组弹性蛋白样多肽及其融合物与从肽和蛋白质非色谱纯化<em&gt;大肠杆菌</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

膜蛋白的绿色荧光蛋白为基础的表达筛选<em&gt;大肠杆菌</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

蛋白质的共表达了多方面的好处<em&gt;大肠杆菌</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

单分子荧光原位杂交实验中单个大肠埃希菌细胞的转录标记方法

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...