Name: population and single-cell analysis of antibiotic persistence in escherichia coli
Uploaded: 2023-03-24T13:50:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli at JoVE.com

Arbejdet i Van Melderen-laboratoriet støttes af ARC-aktionerne 2018-2023, Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS CDR J.0182.21F). T.O. støttes af et ULB-stipendium. T.S. støttes af et FRIA-stipendium (FNRS). J.C. støttes af et postdoktoralt stipendium "chargé de recherches" (FNRS).

<ol>
	<li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitions+and+guidelines+for+research+on+antibiotic+persistence.">Definitions and guidelines for research on antibiotic persistence.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (7), 441-448 (2019).</li><li>Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+between+resistance,+tolerance+and+persistence+to+antibiotic+treatment.">Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).</li><li>Pribis, J. P., Zhai, Y., Hastings, P. J., Rosenberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+mutagenesis,+gambler+cells,+and+stealth+targeting+antibiotic-induced+evolution.">Stress-induced mutagenesis, gambler cells, and stealth targeting antibiotic-induced evolution.</a> mBio. 13 (3), 01074 (2022).</li><li>Molina-Quiroz, R. C., Lazinski, D. W., Camilli, A., Levy, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-sequencing+analysis+unveils+novel+genes+involved+in+the+generation+of+persister+cells+in+uropathogenic+Escherichia+coli.">Transposon-sequencing analysis unveils novel genes involved in the generation of persister cells in uropathogenic Escherichia coli.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6907-6910 (2016).</li><li>Cameron, D. R., Shan, Y., Zalis, E. A., Isabella, V., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+determinant+of+persister+cell+formation+in+bacterial+pathogens.">A genetic determinant of persister cell formation in bacterial pathogens.</a> Journal of Bacteriology. 200 (17), 00303-00318 (2018).</li><li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+involved+in+bacteriostatic+antibiotic-induced+persister+formation.">Identification of genes involved in bacteriostatic antibiotic-induced persister formation.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 413 (2018).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+genes+involved+in+Escherichia+coli+persistence+to+tosufloxacin.">Identification of novel genes involved in Escherichia coli persistence to tosufloxacin.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 581986 (2020).</li><li>Verstraeten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obg+and+membrane+depolarization+are+part+of+a+microbial+bet-hedging+strategy+that+leads+to+antibiotic+tolerance.">Obg and membrane depolarization are part of a microbial bet-hedging strategy that leads to antibiotic tolerance.</a> Molecular Cell. 59 (1), 9-21 (2015).</li><li>Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+persister+fractions+suggests+different+mechanisms+of+formation+among+environmental+isolates+of+E.+coli.">Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli.</a> BMC Microbiology. 13 (1), 25 (2013).</li><li>Huemer, M., Mairpady Shambat, S., Brugger, S. D., Zinkernagel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+and+persistence-Implications+for+human+health+and+treatment+perspectives.">Antibiotic resistance and persistence-Implications for human health and treatment perspectives.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51034 (2020).</li><li>Wilmaerts, D., Windels, E. M., Verstraeten, N., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+mechanisms+leading+to+persister+formation+and+awakening.">General mechanisms leading to persister formation and awakening.</a> Trends in Genetics. 35 (6), 401-411 (2019).</li><li>Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ploidy+is+an+important+determinant+of+fluoroquinolone+persister+survival.">Ploidy is an important determinant of fluoroquinolone persister survival.</a> Current Biology. 31 (10), 2039-2050 (2021).</li><li>Lemma, A. S., Soto-Echevarria, N., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoroquinolone+persistence+in+Escherichia+coli+requires+DNA+repair+despite+differing+between+starving+populations.">Fluoroquinolone persistence in Escherichia coli requires DNA repair despite differing between starving populations.</a> Microorganisms. 10 (2), 286 (2022).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li><li>Morawska, L. P., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+tolerance+in+environmentally+stressed+Bacillus+subtilis:+Physical+barriers+and+induction+of+a+viable+but+nonculturable+state.">Antibiotic tolerance in environmentally stressed Bacillus subtilis: Physical barriers and induction of a viable but nonculturable state.</a> microLife. 3, (2022).</li><li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+persisters+enabled+by+a+&#223;-lactam-induced+filamentation+method+reveals+their+stochastic+single-cell+awakening.">Enrichment of persisters enabled by a &#223;-lactam-induced filamentation method reveals their stochastic single-cell awakening.</a> Communications Biology. 2 (1), 426 (2019).</li><li>Leygeber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+microbial+population+heterogeneity-Expanding+the+toolbox+of+microfluidic+single-cell+cultivations.">Analyzing microbial population heterogeneity-Expanding the toolbox of microfluidic single-cell cultivations.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (23), 4569-4588 (2019).</li><li>Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Escherichia+coli+growth+rate+to+osmotic+shock.">Response of Escherichia coli growth rate to osmotic shock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7807-7812 (2014).</li><li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starvation+induces+shrinkage+of+the+bacterial+cytoplasm.">Starvation induces shrinkage of the bacterial cytoplasm.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (24), 2104686118 (2021).</li><li>Goode, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+Escherichia+coli+cells+have+a+lower+intracellular+pH+than+susceptible+cells+but+maintain+their+pH+in+response+to+antibiotic+treatment.">Persister Escherichia coli cells have a lower intracellular pH than susceptible cells but maintain their pH in response to antibiotic treatment.</a> mBio. 12 (4), 00909-00921 (2021).</li><li>Manuse, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persisters+are+a+stochastically+formed+subpopulation+of+low-energy+cells.">Bacterial persisters are a stochastically formed subpopulation of low-energy cells.</a> PLoS Biology. 19 (4), 3001194 (2021).</li><li>Fisher, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+imaging+of+E.+coli+nucleoid+organization+and+dynamics+in+living+cells.">Four-dimensional imaging of E. coli nucleoid organization and dynamics in living cells.</a> Cell. 153 (4), 882-895 (2013).</li><li>Cabral, D., Wurster, J., Belenky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+persistence+as+a+metabolic+adaptation:+Stress,+metabolism,+the+host,+and+new+directions.">Antibiotic persistence as a metabolic adaptation: Stress, metabolism, the host, and new directions.</a> Pharmaceuticals. 11 (1), 14 (2018).</li><li>Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar+and+broth+dilution+methods+to+determine+the+minimal+inhibitory+concentration+(MIC)+of+antimicrobial+substances.">Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.</a> Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).</li><li>Goormaghtigh, F., Van Melderen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+and+characterization+of+Escherichia+coli+persister+cells+to+ofloxacin+in+exponential+cultures.">Single-cell imaging and characterization of Escherichia coli persister cells to ofloxacin in exponential cultures.</a> Science Advances. 5 (6), (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicrobeJ,+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis.">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nature Microbiology. 1 (7), 16077 (2016).</li><li>Odsbu, I., Skarstad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+compaction+in+the+early+part+of+the+SOS+response+is+dependent+on+RecN+and+RecA.">DNA compaction in the early part of the SOS response is dependent on RecN and RecA.</a> Microbiology. 160 (5), 872-882 (2014).</li><li>Pham, T. D. M., Ziora, Z. M., Blaskovich, M. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quinolone+antibiotics.">Quinolone antibiotics.</a> MedChemComm. 10 (10), 1719-1739 (2019).</li><li>Drlica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quinolones:+Action+and+resistance+updated.">Quinolones: Action and resistance updated.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 9 (11), 981-998 (2009).</li><li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+antibiotics+kill+bacteria:+From+targets+to+networks.">How antibiotics kill bacteria: From targets to networks.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 423-435 (2010).</li><li>Reyes-Lamothe, R., Sherratt, D. J., Leake, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+and+architecture+of+active+DNA+replication+machinery+in+Escherichia+coli.">Stoichiometry and architecture of active DNA replication machinery in Escherichia coli.</a> Science. 328 (5977), 498-501 (2010).</li><li>Lesterlin, C., Ball, G., Schermelleh, L., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA+bundles+mediate+homology+pairing+between+distant+sisters+during+DNA+break+repair.">RecA bundles mediate homology pairing between distant sisters during DNA break repair.</a> Nature. 506 (7487), 249-253 (2014).</li><li>Alexeeva, S., Gadella, T. W. J., Verheul, J., Verhoeven, G. S., Den Blaauwen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+interactions+of+early+and+late+assembling+division+proteins+in+Escherichia+coli+cells+resolved+by+FRET:+Bacterial+division+studied+by+spectral+FRET.">Direct interactions of early and late assembling division proteins in Escherichia coli cells resolved by FRET: Bacterial division studied by spectral FRET.</a> Molecular Microbiology. 77 (2), 384-398 (2010).</li><li>Miesenb&#246;ck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Yaginuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+ATP+concentrations+in+a+single+bacterial+cell+population+revealed+by+quantitative+single-cell+imaging.">Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging.</a> Scientific Reports. 4, 6522 (2014).</li><li>Ermakova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+genetically+encoded+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide.">Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nature Communications. 5, 5222 (2014).</li><li>Kapuscinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAPI:+A+DNA-specific+fluorescent+probe.">DAPI: A DNA-specific fluorescent probe.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Protokollen præsenteret i dette papir tillader analyse af persistensfænotypen observeret som reaktion på antibiotikabehandling på populations- og enkeltcelleniveau. Forsøgene blev udført med E. coli MG1655-stammen, som blev dyrket i et kemisk defineret medium (MOPS-glycerol 0,4%). Time-kill assays og mikroskopi eksperimenter blev udført på eksponentielle fase kulturer. Vi brugte OFX, en fluorquinolon, i en koncentration på 5 μg·ml-1 til at afsløre de persisterende celler. De her beskrevne fremgangsmåder kan anvendes på andre bakteriedræbende antibiotika, såsom β-lactamer, aminoglycosider eller antimikrobielle forbindelser31. Følgelig kan andre bakteriestammer, medier eller vækstbetingelser anvendes. Overvågning af forskellige fluorescerende fusioner i en lignende opsætning som den, der er beskrevet her, kan være nyttig til at følge cellulære processer såsom DNA-replikation 32, DNA-reparation25,33 og celledeling34 før, under og efter antibiotikabehandlingen. På samme måde kan fluorescerende reportere udnyttes til at undersøge forskellige aspekter af cellefysiologi, såsom intracellulære pH 35-, ATP36- eller ROS37-niveauer. Alternativt til fluorescerende fusioner kan kemiske farvestoffer også anvendes. For eksempel kunne hupA-mCherry-fusionen erstattes af 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI), et fluorescerende farvestof, der pletter DNA38. Udførelse af time-lapse-mikroskopi kombineret med sådanne fluorescerende farvestoffer bør dog undgås, da disse farvningsteknikker kan forstyrre cellecyklusdynamikken under time-lapse-eksperimenter. Alternativt kan sådanne eksperimenter erstattes af tidsforløbsanalyser af snap-shot-billeddannelse på relevante tidspunkter.
Mens sådanne fluorescerende journalister er nyttige, bør mængden af information, der kan ekstraheres gennem analyse af fasekontrastbilleder, ikke overses. Her overvågede vi cellelængdeudviklingen gennem vækst-, OFX-behandlings- og genopretningsstadierne. Andre parametre baseret på fasekontrastbilleder, såsom cellebredde, fasekontrastintensitet og krumninger af bakteriecellerne, kan også ekstraheres med lethed ved hjælp af passende software, såsom MicrobeJ27.
Sammenfattende kan proceduren beskrevet her anvendes på andre tilstande og bakteriearter til overvågning af cellulære reaktioner på skiftende miljøer eller stressorer18,19. Ved at bruge andre fluorescerende reportere (transkriptionelle og translationelle reportere, kemisk farvestof) i kombination med en populationsanalyse, såsom flowcytometri / FACS, kan interessante spørgsmål behandles i en multiskala ramme.

Denne protokol har til formål at analysere den bakterielle persistensfænotype som reaktion på specifik antibiotikabehandling på enkeltcelle- og populationsniveau. Persistens beskriver kapaciteten hos små subpopulationer inden for en isogen population til at udholde høje doser bakteriedræbende antibiotika (fluorquinoloner, aminoglycosider, β-lactamer osv.), Hvor den minimale hæmmende koncentration (MIC) af de såkaldte persisterceller er identisk med størstedelen af befolkningen. Bifasisk drabsdynamik, når man måler bakteriel overlevelse over tid i nærvær af et antibiotikum, afslører tilstedeværelsen af forbigående lægemiddeltolerante celler med en indledende hurtig udryddelse af de ikke-persisterende celler efterfulgt af en meget langsommere drabshastighed for de persisterende celler. Ved fjernelse af antibiotika giver disse celler anledning til en genetisk identisk population, der udviser lignende dræbende dynamik, når de behandles med det samme antibiotikum 1,2. I modsætning til persistens defineres antibiotikaresistens på populationsniveau og er generelt en konsekvens af enten de novo-mutationer eller horisontal genoverførsel af et resistensgivende plasmid3. Mens de mutationer, der er ansvarlige for resistens, for det meste er placeret i lægemidlets mål eller i de promotoriske regioner af lægemiddeludstrømningspumperne, har gener, der ændrer persistensfrekvensen identificeret ved genomdækkende og målrettede mutantanalysemetoder, vist sig at være talrige og forskelligartede 2,3,4,5,6,7,8 . Derfor er det sandsynligt, at bakterieceller kan komme ind i persistertilstanden gennem flere veje 9,10,11, og tilgange til at undersøge persistensfænomenet på enkeltcelleniveau er nødvendige for at karakterisere fysiologien af disse persisterende celler.
Den nylige udvikling af mikrofluidiske værktøjer, der anvendes i kombination med fluorescensmikroskopi, har banet vejen for karakteriseringen af persistensfænotypen og fremhævet rollen som centrale cellulære processer, såsom kromosomreplikation12, DNA-reparation 13 og celledeling14, i persisterende celledannelse. I dette papir beskriver vi en integreret tilgang, der kombinerer klassiske mikrobiologiske assays med enkeltcelle levende billeddannelse for at karakterisere persisterende celler genereret i eksponentielt voksende Escherichia coli-kulturer behandlet med en høj dosis ofloxacin. Protokollen beskrevet her kan anvendes til at studere fænomenet antibiotikapersistens hos andre bakteriearter, såsom Bacillus subtilis15, eller tilstande (f.eks. antibiotikapersistens efter β-lactambehandling 16) og kan let ændres til at undersøge de mange fænomener, der involverer fænotypisk heterogenitet17,18,19 . Desuden kan opsætningen beskrevet i dette papir kombineres med andre fluorescerende reportere for at undersøge forskellige cellulære parametre af interesse, såsom intracellulære niveauer af pH20 eller ATP21 på enkeltcelleniveau, hvilket potentielt kan producere ny indsigt i antibiotikapersistensfænomenet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axio Observer</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2.2H2O&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02382.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX Microfluidic System&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CAX2-S0000&#160;</td>
			<td>Microfluidic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX2 FG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ONIX2 1.0.1&#160;</td>
			<td>Microfluidic software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX2 Manifold Basic&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CAX2-MBC20</td>
			<td>Manifold system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2.6H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02539.0100</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4.5H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02790.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td>Carbon source for MOPS glucose 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+)</td>
			<td></td>
			<td>BE10</td>
			<td>wt reference strain, lab strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) hupA-mCherry::FRT-kan-FRT</td>
			<td></td>
			<td>BE16</td>
			<td>HU-mCherry fusion integrated via P1 transduction at the native locus, lab strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4.7H2O&#160;</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>24244.232</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://fiji.sc/&#160;</td>
			<td>Image software; Schindelin et al. if used in publication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>56815</td>
			<td>Carbon source for MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR&#174; multiwell culture plate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M8812-100EA</td>
			<td>24-well clear flat bottom 2ml volume culture plate for automated plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768-1KG</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 digital camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td>Digital Image Acqusition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05099.1000</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05029.1000</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05153.0500</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Broth agar medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22700041</td>
			<td>Growth medium for plating assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Broth medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12780029</td>
			<td>Growth medium for MIC determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H2O&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05832.1000</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td>Dilution solution for bacterial survival assay used at 10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicrobeJ&#160;</td>
			<td>Imagej/Fiji plugin</td>
			<td>https://www.microbej.com/</td>
			<td>Microscopy image analysis plugin. Ducret et al.for in publication; Detection settings: For bacteria : Area (&#956;m2): 0,1-max; Length (&#956;m): 0,5-max; Width (&#956;m): 0,6-max; Range (&#956;m): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Plates CellASIC ONIX</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B04A-03-5PK&#160;</td>
			<td>Plate for microfluidic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2.4H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05927.0100</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, Free Acid ULTROL&#174; Grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>475898-500GM</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>SIgma-Aldrich</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)6Mo7O24.4H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01180.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01145.0500</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ofloxacin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>82419-36-1</td>
			<td>Fluoroquinolone antibiotic used to treat the bacterial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4, 1x</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Dilution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENESYS 10S UV-Visible Spectrophotometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>&#160;840-208200</td>
			<td>UV-Visible Spectrophotometer, Single/Six Cell Holder with PrinterMeasurement of optical density OD600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftMax Pro</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microplate reader software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-[Tris(hydroxym&#233;thyl)-m&#233;thyl]-glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08602.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss&#174; immersion Oil 518F</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Immersion oil to increase resolution of microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen3.2 Pro</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscopic image acquisition and processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4.7H2O&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08883.0500</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

population and single-cell analysis of antibiotic persistence in escherichia coli

Antibiotisk persistens refererer til kapaciteten hos små bakterielle subpopulationer til forbigående at tolerere høje doser bakteriedræbende antibiotika. Ved bakteriedræbende antibiotikabehandling dræbes størstedelen af bakteriepopulationen hurtigt. Denne første hurtige fase af drab efterfølges af et betydeligt fald i drabshastigheden, da de vedvarende celler forbliver levedygtige. Klassisk bestemmes persistens på populationsniveau ved tids-/drabsassays udført med høje doser antibiotika og for definerede eksponeringstider. Mens denne metode giver information om niveauet af persisterende celler og den dræbende kinetik, afspejler den ikke den iboende celle-til-celle-heterogenitet, der ligger til grund for persistensfænomenet. Den her beskrevne protokol kombinerer klassiske tids-/drabsanalyser med enkeltcelleanalyse ved hjælp af fluorescensmikroskopi i realtid. Ved at bruge passende fluorescerende reportere kan mikroskopibilleddannelse af levende celler give information om virkningerne af antibiotika på cellulære processer, såsom kromosomreplikation og adskillelse, celleforlængelse og celledeling. Kombination af populations- og enkeltcelleanalyse muliggør molekylær og cellulær karakterisering af persistensfænotypen.

Watch this Scientific Journal Video about Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli at JoVE.com

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

Antibiotisk persistens beskriver små subpopulationers evne inden for en følsom isogen population til forbigående at tolerere høje doser bakteriedræbende antibiotika. Denne protokol kombinerer tilgange til at karakterisere antibiotisk persistensfænotype på molekylært og cellulært niveau efter udsættelse af Escherichia coli for dødelige doser ofloxacin.

Populations- og enkeltcelleanalyse af antibiotikapersistens i Escherichia coli

Antibiotic persistence refers to the capacity of small bacterial subpopulations to transiently tolerate high doses of bactericidal antibiotics. Upon ...

Protokollen beskrevet her giver en integrativ metode, der kombinerer klassiske mikrobiologiske assays med enkeltcelle levende billeddannelse for at karakterisere Escherichia coli persisterceller efter høj ofloxacinbehandling. Den største fordel ved denne teknik er at analysere persistensfænomen på populations- og enkeltcelleniveau. Kombination af populations- og enkeltcelleanalyse muliggør molekylær og cellulær karakterisering af persistensfænotypen.Til at begynde med skal du stribe bakteriestammen af interesse fra en frossen glycerolbestand på en LB-agarplade og inkubere ved 37 grader Celsius natten over i en periode på 15 til 19 timer for at opnå enkeltkolonier. Inokulere en isoleret koloni i et glasrør indeholdende fem ml MOPS-vækstmedium suppleret med 0,4% glucose, og tilsæt om nødvendigt et selektivt antibiotikum i mediet. Placer røret i en rystende inkubator ved 37 grader Celsius og 180 o / min natten over.Den følgende dag centrifugeres en milliliter kultur ved 2.300 g i tre minutter for at pelletere cellerne, og forsigtigt resuspendere pelleten med samme volumen PBS. Mål OD ved 600 nanometer, og beregn det nødvendige volumen for en indledende OD600 på 0,01 i et endeligt volumen på to milliliter. Derefter tilsættes to milliliter MOPS-glycerol 0,4%medium i en brønd med gennemsigtig bund, 24-brøndplade og podes med det beregnede kulturvolumen natten over.Placer pladen med 24 brønde i en automatiseret mikropladelæser for at overvåge OD600 i 24 timer. Indstil mikropladelæseren til at måle OD600 hvert 15. minut ved en temperatur på 37 grader Celsius og med en høj orbitalrotation på 140 o / min. Smelt 100 ml LB-agar, og opbevar kolben ved 55 grader Celsius for at undgå størkning.Der fremstilles seks små glaskolber, og der pipetteres fem ml flydende LB-agarmedium i hver kolbe med en steril pipette. Tag 10 mikroliter af de fem milligram pr. milliliter loxacinstamopløsning, og fortynd i 90 mikroliter ultrarent vand. Tilsæt stigende mængder af det fortyndede ofloxacin til hver af de seks glaskolber, der indeholder LB-agarmedium, for at få en endelig koncentration på nul til 0,1 mikrogram pr. milliliter ofloxacin.Bland opløsningen ved at dreje kolberne flere gange, og hæld det antibiotikatilsatte LB-agarmedie i en kulturplade med seks brønde. Lad agaren køle af, indtil den størkner, og tør pladen inden brug. Fortynd en bakteriekultur natten over til en endelig celletæthed på en gange 10 til den syvende CFU pr. milliliter med PBS.Spot to mikroliter fortyndet kultur på hver brønd i den tørrede plade med seks brønde. Lad pletterne tørre, før du lægger pladen i en inkubator ved 37 grader Celsius natten over. Den næste dag skal du kontrollere, hvilken ofloxacinkoncentration væksten af bakteriekolonier hæmmes.Hæld ca. 25 ml af den tilberedte LB-agar i en petriskål. Derefter tilsættes fem til otte sterile glasperler til hver størknet og tørret plade. Vend og mærk pladerne.Derefter fremstilles ti gange serielle fortyndingsglasrør indeholdende 900 mikroliter 0,01-molær magnesiumsulfatopløsning. I et glasrør fortyndes en natkultur i frisk og temperaturjusteret medium til en endelig OD600 på ca. 0,001, og lad kulturen vokse natten over i en inkubator. Den følgende dag, når OD600 når 0,3, overføres 100 mikroliter af kulturen til fortynding i henhold til spotanalysedataene.Udfør en ti gange seriel fortynding af bakteriekulturen. Derefter plades 100 mikroliter af den fortyndede kultur på de fremstillede LB-agarplader. Tilsæt den ønskede koncentration af ofloxacin i bakteriekulturen, og fortsæt med at inkubere ved 37 grader Celsius under omrystning.På relevante tidspunkter trækkes 100 mikroliter af kulturen ud, og kulturen fortyndes tilsvarende til spotanalysedataene. Plade 100 mikroliter af den fortyndede kultur på LB-agarpladerne. Den næste dag tælles kolonierne af de natten over inkuberede plader ved de to højeste fortyndinger, for hvilke kolonier kan detekteres.Beregn overlevelsesforholdet ved at normalisere CFU'en pr. milliliter på hvert tidspunkt ved CFU pr. milliliter ved T0, og plot logbasen 10 normaliseret værdi som en funktion af tiden. Fjern konserveringsopløsningen fra hver brønd i den mikrofluidiske plade, og erstat den med frisk kulturmedium. Forsegl den mikrofluidiske plade med manifoldsystemet ved at klikke på knappen Seal eller gennem den mikrofluidiske software.Udfør derefter en første primingsekvens på den mikrofluidiske softwaregrænseflade ved at klikke på Kør flydende primingsekvens. Pladen inkuberes i et termostatstyret mikroskopisk kabinet ved 37 grader Celsius i mindst to timer, før mikroskopibilleddannelsen påbegyndes. Start derefter en anden Run Liquid Priming Sequence, før eksperimentet påbegyndes.Forsegl den mikrofluidiske plade ved at klikke på Fjern forseglingsplade på den mikrofluidiske softwaregrænseflade. Udskift substratet i brøndene med 200 mikroliter frisk medium, antibiotikum indeholdende frisk medium og 0,01 OD fortyndet kulturprøve i det friske medium. Efter forsegling af den mikrofluidiske plade som vist før, skal pladen placeres på mikroskopmålet inde i mikroskopskabet.I den mikrofluidiske software skal du klikke på Kør celleindlæsningssekvens for at tillade indlæsning af cellerne i den mikrofluidiske plade. Indstil et optimalt fokus ved hjælp af den transmitterede lystilstand, og vælg flere interesseområder, hvor et passende celleantal på op til 300 celler pr. felt kan observeres. På den mikrofluidiske software skal du redigere Kør en brugerdefineret sekvens for at programmere injektionen af frisk medium ved 6,9 kilopascal i seks timer til hul et og to, efterfulgt af mediet indeholdende antibiotika ved 6,9 kilopascal eller seks timer til brønd tre og endelig det friske medium ved 6,9 kilopascal i 24 timer til brønd fire og fem.Udfør mikroskopibilleddannelse i time-lapse-tilstand med en ramme hvert 15. minut ved hjælp af transmitteret lys og excitationslyskilden til den fluorescerende reporter, og start det mikrofluidiske program. Åbn ImageJ- eller Fiji-softwaren på computeren, og træk hyperstack-time-lapse-mikroskopibillederne til Fiji-indlæsningsbjælken. Brug Billede efterfulgt af Farve og derefter Opret sammensætning for at sammensmelte de forskellige kanaler i hyperstakken.Brug Billede, Farve og derefter Arranger kanaler, hvis kanalerne ikke svarer til den ønskede farve. Åbn MicrobeJ-pluginet, og registrer bakteriecellerne ved hjælp af den manuelle redigeringsgrænseflade. Slet de automatisk registrerede celler, og opret manuelt en disposition for de vedvarende celler af interesse billede for billede.Efter registrering skal du bruge ikonet Resultat i MicrobeJ's manuelle redigeringsgrænseflade til at generere en ResultJ-tabel. Brug tabellen ResultJ til at få indsigt i forskellige parametre af interesse for enkeltcelleanalysen, og gem filen ResultJ. MIC for ofloxacin for begge stammer blev bestemt til at være 0,06 mikrogram pr. milliliter, hvilket indikerer, at hupA-mCherry-fusionen ikke påvirkede ofloxacins følsomhed sammenlignet med den isogene vildtypestamme.Spotanalysen viste isolerede kloner ved passende fortyndinger over tid, for eksempel 10 til den negative femte fortynding ved tid nul. I tidsdrabsanalysen blev der observeret en typisk bifasisk kurve, hvor den første hældning afspejler den hurtige drab af den ikke-persisterende befolkning. Den anden fase viste en langsommere drabsrate, hvilket afslørede tilstedeværelsen af lægemiddeltolerante persisterende celler.Især viser time-kill-kurven, at hupA-mCherry-fusionsproteinet ikke påvirkede time-kill-kinetikken. I det mikrofluidiske eksperiment indikerer den første vækstfase, at cellerne var levedygtige og delte sig før ofloxacinbehandlingen. Efter denne første vækstfase blev celledeling blokeret, så snart antibiotika nåede cellerne.Efter ofloxacinbehandling, ved perfusion med frisk medium, var langt størstedelen af cellerne ikke i stand til at genoptage væksten. I modsætning hertil kunne en lille delpopulation forlænge og generere filamentøse celler, der defineres som persistercellerne. Det delende persisterende filament genererede flere datterceller, hvoraf de fleste begyndte at vokse og dele sig på samme måde som ubehandlede celler.Stigningen i cellelængde korrelerede med en stigning i den samlede mCherry-fluorescensintensitet, hvilket afspejler replikationsgenstart og en stigning i nukleoidoverflod. Når man bruger en stamme, der indeholder en intracellulær reporter til at studere persistens, er det kejserligt, at tilstedeværelsen af reporteren ikke forstyrrer vækst, MIC og drab sammenlignet med en vildtypestamme. Proceduren beskrevet her kan anvendes på andre forhold og bakteriearter for at overvåge cellulære reaktioner på skiftende miljøer eller belastninger.Ved at bruge andre fluorescerende reportere i en identisk opsætning kan ny indsigt i persistercellers fysiologi undersøges.

Research

JoVE Journal

Biology

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Kortlægning Bakterielle Funktionelle Networks og spredningsveje i<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Hjælp Syntetiske Genetiske Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identifikation af protein-komplekser i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hjælp Sekventiel Peptide Affinitetsrensning i kombination med Tandem massespektrometri

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Hurtig Protokol for Udarbejdelse af elektrokompetente<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Og<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection Live<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 celler ved PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Ikke-kromatografisk oprensning af rekombinant elastin-lignende polypeptider og deres fusioner med peptider og proteiner fra<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grønt fluorescerende protein-baserede Expression Screening membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Den mangesidede Fordele ved Protein Co-ekspression i<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

Metode for mærkning udskrifter i individuelle Escherichia coli celler for enkelt-molekyle fluorescens In Situ hybridisering eksperimenter

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...