Populations- og enkeltcelleanalyse af antibiotikapersistens i Escherichia coli

Protokollen beskrevet her giver en integrativ metode, der kombinerer klassiske mikrobiologiske assays med enkeltcelle levende billeddannelse for at karakterisere Escherichia coli persisterceller efter høj ofloxacinbehandling. Den største fordel ved denne teknik er at analysere persistensfænomen på populations- og enkeltcelleniveau. Kombination af populations- og enkeltcelleanalyse muliggør molekylær og cellulær karakterisering af persistensfænotypen.

Til at begynde med skal du stribe bakteriestammen af interesse fra en frossen glycerolbestand på en LB-agarplade og inkubere ved 37 grader Celsius natten over i en periode på 15 til 19 timer for at opnå enkeltkolonier. Inokulere en isoleret koloni i et glasrør indeholdende fem ml MOPS-vækstmedium suppleret med 0,4% glucose, og tilsæt om nødvendigt et selektivt antibiotikum i mediet. Placer røret i en rystende inkubator ved 37 grader Celsius og 180 o / min natten over.

Den følgende dag centrifugeres en milliliter kultur ved 2.300 g i tre minutter for at pelletere cellerne, og forsigtigt resuspendere pelleten med samme volumen PBS. Mål OD ved 600 nanometer, og beregn det nødvendige volumen for en indledende OD600 på 0,01 i et endeligt volumen på to milliliter. Derefter tilsættes to milliliter MOPS-glycerol 0,4%medium i en brønd med gennemsigtig bund, 24-brøndplade og podes med det beregnede kulturvolumen natten over.

Placer pladen med 24 brønde i en automatiseret mikropladelæser for at overvåge OD600 i 24 timer. Indstil mikropladelæseren til at måle OD600 hvert 15. minut ved en temperatur på 37 grader Celsius og med en høj orbitalrotation på 140 o / min. Smelt 100 ml LB-agar, og opbevar kolben ved 55 grader Celsius for at undgå størkning.

Der fremstilles seks små glaskolber, og der pipetteres fem ml flydende LB-agarmedium i hver kolbe med en steril pipette. Tag 10 mikroliter af de fem milligram pr. milliliter loxacinstamopløsning, og fortynd i 90 mikroliter ultrarent vand. Tilsæt stigende mængder af det fortyndede ofloxacin til hver af de seks glaskolber, der indeholder LB-agarmedium, for at få en endelig koncentration på nul til 0,1 mikrogram pr. milliliter ofloxacin.

Bland opløsningen ved at dreje kolberne flere gange, og hæld det antibiotikatilsatte LB-agarmedie i en kulturplade med seks brønde. Lad agaren køle af, indtil den størkner, og tør pladen inden brug. Fortynd en bakteriekultur natten over til en endelig celletæthed på en gange 10 til den syvende CFU pr. milliliter med PBS.

Spot to mikroliter fortyndet kultur på hver brønd i den tørrede plade med seks brønde. Lad pletterne tørre, før du lægger pladen i en inkubator ved 37 grader Celsius natten over. Den næste dag skal du kontrollere, hvilken ofloxacinkoncentration væksten af bakteriekolonier hæmmes.

Hæld ca. 25 ml af den tilberedte LB-agar i en petriskål. Derefter tilsættes fem til otte sterile glasperler til hver størknet og tørret plade. Vend og mærk pladerne.

Derefter fremstilles ti gange serielle fortyndingsglasrør indeholdende 900 mikroliter 0,01-molær magnesiumsulfatopløsning. I et glasrør fortyndes en natkultur i frisk og temperaturjusteret medium til en endelig OD600 på ca. 0,001, og lad kulturen vokse natten over i en inkubator. Den følgende dag, når OD600 når 0,3, overføres 100 mikroliter af kulturen til fortynding i henhold til spotanalysedataene.

Udfør en ti gange seriel fortynding af bakteriekulturen. Derefter plades 100 mikroliter af den fortyndede kultur på de fremstillede LB-agarplader. Tilsæt den ønskede koncentration af ofloxacin i bakteriekulturen, og fortsæt med at inkubere ved 37 grader Celsius under omrystning.

På relevante tidspunkter trækkes 100 mikroliter af kulturen ud, og kulturen fortyndes tilsvarende til spotanalysedataene. Plade 100 mikroliter af den fortyndede kultur på LB-agarpladerne. Den næste dag tælles kolonierne af de natten over inkuberede plader ved de to højeste fortyndinger, for hvilke kolonier kan detekteres.

Beregn overlevelsesforholdet ved at normalisere CFU'en pr. milliliter på hvert tidspunkt ved CFU pr. milliliter ved T0, og plot logbasen 10 normaliseret værdi som en funktion af tiden. Fjern konserveringsopløsningen fra hver brønd i den mikrofluidiske plade, og erstat den med frisk kulturmedium. Forsegl den mikrofluidiske plade med manifoldsystemet ved at klikke på knappen Seal eller gennem den mikrofluidiske software.

Udfør derefter en første primingsekvens på den mikrofluidiske softwaregrænseflade ved at klikke på Kør flydende primingsekvens. Pladen inkuberes i et termostatstyret mikroskopisk kabinet ved 37 grader Celsius i mindst to timer, før mikroskopibilleddannelsen påbegyndes. Start derefter en anden Run Liquid Priming Sequence, før eksperimentet påbegyndes.

Forsegl den mikrofluidiske plade ved at klikke på Fjern forseglingsplade på den mikrofluidiske softwaregrænseflade. Udskift substratet i brøndene med 200 mikroliter frisk medium, antibiotikum indeholdende frisk medium og 0,01 OD fortyndet kulturprøve i det friske medium. Efter forsegling af den mikrofluidiske plade som vist før, skal pladen placeres på mikroskopmålet inde i mikroskopskabet.

I den mikrofluidiske software skal du klikke på Kør celleindlæsningssekvens for at tillade indlæsning af cellerne i den mikrofluidiske plade. Indstil et optimalt fokus ved hjælp af den transmitterede lystilstand, og vælg flere interesseområder, hvor et passende celleantal på op til 300 celler pr. felt kan observeres. På den mikrofluidiske software skal du redigere Kør en brugerdefineret sekvens for at programmere injektionen af frisk medium ved 6,9 kilopascal i seks timer til hul et og to, efterfulgt af mediet indeholdende antibiotika ved 6,9 kilopascal eller seks timer til brønd tre og endelig det friske medium ved 6,9 kilopascal i 24 timer til brønd fire og fem.

Udfør mikroskopibilleddannelse i time-lapse-tilstand med en ramme hvert 15. minut ved hjælp af transmitteret lys og excitationslyskilden til den fluorescerende reporter, og start det mikrofluidiske program. Åbn ImageJ- eller Fiji-softwaren på computeren, og træk hyperstack-time-lapse-mikroskopibillederne til Fiji-indlæsningsbjælken. Brug Billede efterfulgt af Farve og derefter Opret sammensætning for at sammensmelte de forskellige kanaler i hyperstakken.

Brug Billede, Farve og derefter Arranger kanaler, hvis kanalerne ikke svarer til den ønskede farve. Åbn MicrobeJ-pluginet, og registrer bakteriecellerne ved hjælp af den manuelle redigeringsgrænseflade. Slet de automatisk registrerede celler, og opret manuelt en disposition for de vedvarende celler af interesse billede for billede.

Efter registrering skal du bruge ikonet Resultat i MicrobeJ's manuelle redigeringsgrænseflade til at generere en ResultJ-tabel. Brug tabellen ResultJ til at få indsigt i forskellige parametre af interesse for enkeltcelleanalysen, og gem filen ResultJ. MIC for ofloxacin for begge stammer blev bestemt til at være 0,06 mikrogram pr. milliliter, hvilket indikerer, at hupA-mCherry-fusionen ikke påvirkede ofloxacins følsomhed sammenlignet med den isogene vildtypestamme.

Spotanalysen viste isolerede kloner ved passende fortyndinger over tid, for eksempel 10 til den negative femte fortynding ved tid nul. I tidsdrabsanalysen blev der observeret en typisk bifasisk kurve, hvor den første hældning afspejler den hurtige drab af den ikke-persisterende befolkning. Den anden fase viste en langsommere drabsrate, hvilket afslørede tilstedeværelsen af lægemiddeltolerante persisterende celler.

Især viser time-kill-kurven, at hupA-mCherry-fusionsproteinet ikke påvirkede time-kill-kinetikken. I det mikrofluidiske eksperiment indikerer den første vækstfase, at cellerne var levedygtige og delte sig før ofloxacinbehandlingen. Efter denne første vækstfase blev celledeling blokeret, så snart antibiotika nåede cellerne.

Efter ofloxacinbehandling, ved perfusion med frisk medium, var langt størstedelen af cellerne ikke i stand til at genoptage væksten. I modsætning hertil kunne en lille delpopulation forlænge og generere filamentøse celler, der defineres som persistercellerne. Det delende persisterende filament genererede flere datterceller, hvoraf de fleste begyndte at vokse og dele sig på samme måde som ubehandlede celler.

Stigningen i cellelængde korrelerede med en stigning i den samlede mCherry-fluorescensintensitet, hvilket afspejler replikationsgenstart og en stigning i nukleoidoverflod. Når man bruger en stamme, der indeholder en intracellulær reporter til at studere persistens, er det kejserligt, at tilstedeværelsen af reporteren ikke forstyrrer vækst, MIC og drab sammenlignet med en vildtypestamme. Proceduren beskrevet her kan anvendes på andre forhold og bakteriearter for at overvåge cellulære reaktioner på skiftende miljøer eller belastninger.

Ved at bruge andre fluorescerende reportere i en identisk opsætning kan ny indsigt i persistercellers fysiologi undersøges.