Name: population and single-cell analysis of antibiotic persistence in escherichia coli
Uploaded: 2023-03-24T13:50:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli at JoVE.com

Het werk in het Van Melderen lab wordt ondersteund door de ARC acties 2018-2023, het Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS CDR J.0182.21F). T.O. wordt ondersteund door een ULB-fellowship. T.S. wordt ondersteund door een FRIA fellowship (FNRS). J.C. wordt ondersteund door een postdoctoraal mandaat "chargé de recherches" (FNRS).

<ol>
	<li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitions+and+guidelines+for+research+on+antibiotic+persistence.">Definitions and guidelines for research on antibiotic persistence.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (7), 441-448 (2019).</li><li>Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+between+resistance,+tolerance+and+persistence+to+antibiotic+treatment.">Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).</li><li>Pribis, J. P., Zhai, Y., Hastings, P. J., Rosenberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+mutagenesis,+gambler+cells,+and+stealth+targeting+antibiotic-induced+evolution.">Stress-induced mutagenesis, gambler cells, and stealth targeting antibiotic-induced evolution.</a> mBio. 13 (3), 01074 (2022).</li><li>Molina-Quiroz, R. C., Lazinski, D. W., Camilli, A., Levy, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-sequencing+analysis+unveils+novel+genes+involved+in+the+generation+of+persister+cells+in+uropathogenic+Escherichia+coli.">Transposon-sequencing analysis unveils novel genes involved in the generation of persister cells in uropathogenic Escherichia coli.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6907-6910 (2016).</li><li>Cameron, D. R., Shan, Y., Zalis, E. A., Isabella, V., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+determinant+of+persister+cell+formation+in+bacterial+pathogens.">A genetic determinant of persister cell formation in bacterial pathogens.</a> Journal of Bacteriology. 200 (17), 00303-00318 (2018).</li><li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+involved+in+bacteriostatic+antibiotic-induced+persister+formation.">Identification of genes involved in bacteriostatic antibiotic-induced persister formation.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 413 (2018).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+genes+involved+in+Escherichia+coli+persistence+to+tosufloxacin.">Identification of novel genes involved in Escherichia coli persistence to tosufloxacin.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 581986 (2020).</li><li>Verstraeten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obg+and+membrane+depolarization+are+part+of+a+microbial+bet-hedging+strategy+that+leads+to+antibiotic+tolerance.">Obg and membrane depolarization are part of a microbial bet-hedging strategy that leads to antibiotic tolerance.</a> Molecular Cell. 59 (1), 9-21 (2015).</li><li>Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+persister+fractions+suggests+different+mechanisms+of+formation+among+environmental+isolates+of+E.+coli.">Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli.</a> BMC Microbiology. 13 (1), 25 (2013).</li><li>Huemer, M., Mairpady Shambat, S., Brugger, S. D., Zinkernagel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+and+persistence-Implications+for+human+health+and+treatment+perspectives.">Antibiotic resistance and persistence-Implications for human health and treatment perspectives.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51034 (2020).</li><li>Wilmaerts, D., Windels, E. M., Verstraeten, N., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+mechanisms+leading+to+persister+formation+and+awakening.">General mechanisms leading to persister formation and awakening.</a> Trends in Genetics. 35 (6), 401-411 (2019).</li><li>Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ploidy+is+an+important+determinant+of+fluoroquinolone+persister+survival.">Ploidy is an important determinant of fluoroquinolone persister survival.</a> Current Biology. 31 (10), 2039-2050 (2021).</li><li>Lemma, A. S., Soto-Echevarria, N., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoroquinolone+persistence+in+Escherichia+coli+requires+DNA+repair+despite+differing+between+starving+populations.">Fluoroquinolone persistence in Escherichia coli requires DNA repair despite differing between starving populations.</a> Microorganisms. 10 (2), 286 (2022).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li><li>Morawska, L. P., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+tolerance+in+environmentally+stressed+Bacillus+subtilis:+Physical+barriers+and+induction+of+a+viable+but+nonculturable+state.">Antibiotic tolerance in environmentally stressed Bacillus subtilis: Physical barriers and induction of a viable but nonculturable state.</a> microLife. 3, (2022).</li><li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+persisters+enabled+by+a+&#223;-lactam-induced+filamentation+method+reveals+their+stochastic+single-cell+awakening.">Enrichment of persisters enabled by a &#223;-lactam-induced filamentation method reveals their stochastic single-cell awakening.</a> Communications Biology. 2 (1), 426 (2019).</li><li>Leygeber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+microbial+population+heterogeneity-Expanding+the+toolbox+of+microfluidic+single-cell+cultivations.">Analyzing microbial population heterogeneity-Expanding the toolbox of microfluidic single-cell cultivations.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (23), 4569-4588 (2019).</li><li>Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Escherichia+coli+growth+rate+to+osmotic+shock.">Response of Escherichia coli growth rate to osmotic shock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7807-7812 (2014).</li><li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starvation+induces+shrinkage+of+the+bacterial+cytoplasm.">Starvation induces shrinkage of the bacterial cytoplasm.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (24), 2104686118 (2021).</li><li>Goode, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+Escherichia+coli+cells+have+a+lower+intracellular+pH+than+susceptible+cells+but+maintain+their+pH+in+response+to+antibiotic+treatment.">Persister Escherichia coli cells have a lower intracellular pH than susceptible cells but maintain their pH in response to antibiotic treatment.</a> mBio. 12 (4), 00909-00921 (2021).</li><li>Manuse, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persisters+are+a+stochastically+formed+subpopulation+of+low-energy+cells.">Bacterial persisters are a stochastically formed subpopulation of low-energy cells.</a> PLoS Biology. 19 (4), 3001194 (2021).</li><li>Fisher, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+imaging+of+E.+coli+nucleoid+organization+and+dynamics+in+living+cells.">Four-dimensional imaging of E. coli nucleoid organization and dynamics in living cells.</a> Cell. 153 (4), 882-895 (2013).</li><li>Cabral, D., Wurster, J., Belenky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+persistence+as+a+metabolic+adaptation:+Stress,+metabolism,+the+host,+and+new+directions.">Antibiotic persistence as a metabolic adaptation: Stress, metabolism, the host, and new directions.</a> Pharmaceuticals. 11 (1), 14 (2018).</li><li>Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar+and+broth+dilution+methods+to+determine+the+minimal+inhibitory+concentration+(MIC)+of+antimicrobial+substances.">Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.</a> Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).</li><li>Goormaghtigh, F., Van Melderen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+and+characterization+of+Escherichia+coli+persister+cells+to+ofloxacin+in+exponential+cultures.">Single-cell imaging and characterization of Escherichia coli persister cells to ofloxacin in exponential cultures.</a> Science Advances. 5 (6), (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicrobeJ,+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis.">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nature Microbiology. 1 (7), 16077 (2016).</li><li>Odsbu, I., Skarstad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+compaction+in+the+early+part+of+the+SOS+response+is+dependent+on+RecN+and+RecA.">DNA compaction in the early part of the SOS response is dependent on RecN and RecA.</a> Microbiology. 160 (5), 872-882 (2014).</li><li>Pham, T. D. M., Ziora, Z. M., Blaskovich, M. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quinolone+antibiotics.">Quinolone antibiotics.</a> MedChemComm. 10 (10), 1719-1739 (2019).</li><li>Drlica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quinolones:+Action+and+resistance+updated.">Quinolones: Action and resistance updated.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 9 (11), 981-998 (2009).</li><li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+antibiotics+kill+bacteria:+From+targets+to+networks.">How antibiotics kill bacteria: From targets to networks.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 423-435 (2010).</li><li>Reyes-Lamothe, R., Sherratt, D. J., Leake, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+and+architecture+of+active+DNA+replication+machinery+in+Escherichia+coli.">Stoichiometry and architecture of active DNA replication machinery in Escherichia coli.</a> Science. 328 (5977), 498-501 (2010).</li><li>Lesterlin, C., Ball, G., Schermelleh, L., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA+bundles+mediate+homology+pairing+between+distant+sisters+during+DNA+break+repair.">RecA bundles mediate homology pairing between distant sisters during DNA break repair.</a> Nature. 506 (7487), 249-253 (2014).</li><li>Alexeeva, S., Gadella, T. W. J., Verheul, J., Verhoeven, G. S., Den Blaauwen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+interactions+of+early+and+late+assembling+division+proteins+in+Escherichia+coli+cells+resolved+by+FRET:+Bacterial+division+studied+by+spectral+FRET.">Direct interactions of early and late assembling division proteins in Escherichia coli cells resolved by FRET: Bacterial division studied by spectral FRET.</a> Molecular Microbiology. 77 (2), 384-398 (2010).</li><li>Miesenb&#246;ck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Yaginuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+ATP+concentrations+in+a+single+bacterial+cell+population+revealed+by+quantitative+single-cell+imaging.">Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging.</a> Scientific Reports. 4, 6522 (2014).</li><li>Ermakova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+genetically+encoded+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide.">Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nature Communications. 5, 5222 (2014).</li><li>Kapuscinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAPI:+A+DNA-specific+fluorescent+probe.">DAPI: A DNA-specific fluorescent probe.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).</li></ol>

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Het protocol dat in dit artikel wordt gepresenteerd, maakt de analyse mogelijk van het persistentiefenotype dat wordt waargenomen als reactie op antibioticabehandeling op populatie- en eencellig niveau. De experimenten werden uitgevoerd met de E. coli MG1655-stam, die werd gekweekt in een chemisch gedefinieerd medium (MOPS-glycerol 0,4%). Time-kill assays en microscopie-experimenten werden uitgevoerd op exponentiële faseculturen. We gebruikten OFX, een fluoroquinolon, in een concentratie van 5 μg·ml−1 om de persistercellen te onthullen. De hier beschreven benaderingen kunnen worden toegepast op andere bacteriedodende antibiotica, zoals β-lactams, aminoglycosiden of antimicrobiële verbindingen31. Dienovereenkomstig kunnen andere bacteriestammen, media of groeiomstandigheden worden gebruikt. Het monitoren van verschillende fluorescerende fusies in een vergelijkbare opstelling als die hier wordt beschreven, kan nuttig zijn voor het volgen van cellulaire processen zoals DNA-replicatie32, DNA-reparatie25,33 en celdeling34 voor, tijdens en na de antibioticabehandeling. Op dezelfde manier kunnen fluorescerende reporters worden gebruikt om verschillende aspecten van celfysiologie te onderzoeken, zoals intracellulaire pH 35, ATP36 of ROS37-niveaus. Als alternatief voor fluorescerende fusies kunnen ook chemische kleurstoffen worden toegepast. De hupA-mCherry-fusie kan bijvoorbeeld worden vervangen door 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI), een fluorescerende kleurstof die DNA38 kleurt. Het uitvoeren van time-lapse microscopie in combinatie met dergelijke fluorescerende kleurstoffen moet echter worden vermeden, omdat deze kleuringstechnieken de dynamiek van de celcyclus tijdens time-lapse-experimenten kunnen verstoren. Als alternatief kunnen dergelijke experimenten worden vervangen door tijdsloopanalyses van snap-shot imaging op relevante tijdstippen.
Hoewel dergelijke fluorescerende verslaggevers nuttig zijn, mag de hoeveelheid informatie die kan worden geëxtraheerd door de analyse van fasecontrastbeelden niet worden verwaarloosd. Hier volgden we de evolutie van de cellengte gedurende de groei, OFX-behandeling en herstelfasen. Andere parameters op basis van fasecontrastbeelden, zoals celbreedte, fasecontrastintensiteit en krommingen van de bacteriële cellen, kunnen ook gemakkelijk worden geëxtraheerd met behulp van geschikte software, zoals MicrobeJ27.
Samenvattend kan de hier beschreven procedure worden toegepast op andere aandoeningen en bacteriesoorten om cellulaire reacties op veranderende omgevingen of stressoren te controleren18,19. Door gebruik te maken van andere fluorescerende reporters (transcriptionele en translationele reporters, chemische kleurstof) in combinatie met een populatieanalyse, zoals flowcytometrie/FACS, kunnen interessante vragen in een multi-scale framework worden aangepakt.

Dit protocol is bedoeld om het bacteriële persistentiefenotype te analyseren als reactie op specifieke antibioticabehandeling op eencellig en populatieniveau. Persistentie beschrijft het vermogen van kleine subpopulaties binnen een isogene populatie om hoge doses bacteriedodende antibiotica (fluoroquinolonen, aminoglycosiden, β-lactams, enz.) te doorstaan, waarbij de minimale remmende concentratie (MIC) van de zogenaamde persistercellen identiek is aan die van het grootste deel van de populatie. Bifasische dodingsdynamiek, bij het meten van bacteriële overleving in de loop van de tijd in de aanwezigheid van een antibioticum, onthult de aanwezigheid van tijdelijk drugtolerante cellen, met een initiële snelle uitroeiing van de niet-persisterende cellen, gevolgd door een veel langzamere dodingssnelheid van de persistercellen. Na verwijdering van antibiotica geven deze cellen aanleiding tot een genetisch identieke populatie die een vergelijkbare dodingsdynamiek vertoont wanneer ze met hetzelfde antibioticumworden behandeld 1,2. In tegenstelling tot persistentie wordt antibioticaresistentie gedefinieerd op populatieniveau en is het over het algemeen een gevolg van de novo mutaties of de horizontale genoverdracht van een resistentieverlenend plasmide3. Hoewel de mutaties die verantwoordelijk zijn voor resistentie zich meestal bevinden in het doelwit van het geneesmiddel of in de promotorgebieden van de effluxpompen van het geneesmiddel, hebben genen die de persistentiefrequentie veranderen die is geïdentificeerd door genoombrede en gerichte mutantanalysebenaderingen bewezen talrijk en divers te zijn 2,3,4,5,6,7,8 . Daarom is het waarschijnlijk dat bacteriële cellen de persistertoestand kunnen binnendringen via meerdere routes 9,10,11, en benaderingen om het persistentiefenomeen op eencellig niveau te onderzoeken zijn nodig om de fysiologie van deze persistercellen te karakteriseren.
De recente ontwikkeling van microfluïdische hulpmiddelen die worden gebruikt in combinatie met fluorescentiemicroscopie heeft de weg vrijgemaakt voor de karakterisering van het persistentiefenotype en de rol van belangrijke cellulaire processen, zoals chromosoomreplicatie12, DNA-reparatie 13 en celdeling14, in persistercelvorming benadrukt. In dit artikel beschrijven we een geïntegreerde aanpak die klassieke microbiologische assays combineert met single-cell live imaging om persistercellen te karakteriseren die worden gegenereerd in exponentieel groeiende Escherichia coli-culturen die worden behandeld met een hoge dosis ofloxacine. Het hier beschreven protocol kan worden toegepast om het antibioticumpersistentiefenomeen bij andere bacteriesoorten te bestuderen, zoals Bacillus subtilis15, of aandoeningen (bijv. Antibioticapersistentie na β-lactambehandeling 16) en kan gemakkelijk worden aangepast om de vele verschijnselen met fenotypische heterogeniteit17,18,19 te onderzoeken . Bovendien kan de opstelling die in dit artikel wordt beschreven, worden gecombineerd met andere fluorescerende reporters om verschillende cellulaire parameters van belang te onderzoeken, zoals intracellulaire niveaus van pH20 of ATP21 op eencellig niveau, wat mogelijk nieuwe inzichten kan opleveren in het fenomeen van antibioticapersistentie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axio Observer</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2.2H2O&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02382.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX Microfluidic System&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CAX2-S0000&#160;</td>
			<td>Microfluidic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX2 FG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ONIX2 1.0.1&#160;</td>
			<td>Microfluidic software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX2 Manifold Basic&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CAX2-MBC20</td>
			<td>Manifold system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2.6H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02539.0100</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4.5H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02790.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td>Carbon source for MOPS glucose 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+)</td>
			<td></td>
			<td>BE10</td>
			<td>wt reference strain, lab strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) hupA-mCherry::FRT-kan-FRT</td>
			<td></td>
			<td>BE16</td>
			<td>HU-mCherry fusion integrated via P1 transduction at the native locus, lab strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4.7H2O&#160;</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>24244.232</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://fiji.sc/&#160;</td>
			<td>Image software; Schindelin et al. if used in publication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>56815</td>
			<td>Carbon source for MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR&#174; multiwell culture plate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M8812-100EA</td>
			<td>24-well clear flat bottom 2ml volume culture plate for automated plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768-1KG</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 digital camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td>Digital Image Acqusition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05099.1000</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05029.1000</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05153.0500</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Broth agar medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22700041</td>
			<td>Growth medium for plating assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Broth medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12780029</td>
			<td>Growth medium for MIC determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H2O&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05832.1000</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td>Dilution solution for bacterial survival assay used at 10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicrobeJ&#160;</td>
			<td>Imagej/Fiji plugin</td>
			<td>https://www.microbej.com/</td>
			<td>Microscopy image analysis plugin. Ducret et al.for in publication; Detection settings: For bacteria : Area (&#956;m2): 0,1-max; Length (&#956;m): 0,5-max; Width (&#956;m): 0,6-max; Range (&#956;m): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Plates CellASIC ONIX</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B04A-03-5PK&#160;</td>
			<td>Plate for microfluidic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2.4H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05927.0100</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, Free Acid ULTROL&#174; Grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>475898-500GM</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>SIgma-Aldrich</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)6Mo7O24.4H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01180.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01145.0500</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ofloxacin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>82419-36-1</td>
			<td>Fluoroquinolone antibiotic used to treat the bacterial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4, 1x</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Dilution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENESYS 10S UV-Visible Spectrophotometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>&#160;840-208200</td>
			<td>UV-Visible Spectrophotometer, Single/Six Cell Holder with PrinterMeasurement of optical density OD600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftMax Pro</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microplate reader software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-[Tris(hydroxym&#233;thyl)-m&#233;thyl]-glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08602.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss&#174; immersion Oil 518F</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Immersion oil to increase resolution of microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen3.2 Pro</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscopic image acquisition and processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4.7H2O&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08883.0500</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

population and single-cell analysis of antibiotic persistence in escherichia coli

Antibioticapersistentie verwijst naar het vermogen van kleine bacteriële subpopulaties om tijdelijk hoge doses bacteriedodende antibiotica te verdragen. Bij bacteriedodende antibioticabehandeling wordt het grootste deel van de bacteriepopulatie snel gedood. Deze eerste snelle fase van het doden wordt gevolgd door een aanzienlijke afname van de snelheid van het doden omdat de persistercellen levensvatbaar blijven. Klassiek wordt de persistentie op populatieniveau bepaald door time/kill-tests uitgevoerd met hoge doses antibiotica en voor gedefinieerde blootstellingstijden. Hoewel deze methode informatie geeft over het niveau van persistercellen en de dodende kinetiek, weerspiegelt deze niet de intrinsieke cel-tot-cel heterogeniteit die ten grondslag ligt aan het persistentiefenomeen. Het hier beschreven protocol combineert klassieke time/kill assays met single-cell analyse met behulp van real-time fluorescentiemicroscopie. Door geschikte fluorescerende reporters te gebruiken, kan de microscopiebeeldvorming van levende cellen informatie verschaffen over de effecten van het antibioticum op cellulaire processen, zoals chromosoomreplicatie en -segregatie, celverlenging en celdeling. Het combineren van populatie- en eencellige analyse maakt de moleculaire en cellulaire karakterisering van het persistentiefenotype mogelijk.

Watch this Scientific Journal Video about Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli at JoVE.com

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

Antibioticapersistentie beschrijft het vermogen van kleine subpopulaties binnen een gevoelige isogene populatie om tijdelijk hoge doses bacteriedodende antibiotica te verdragen. Het huidige protocol combineert benaderingen om het fenotype van antibioticapersistentie op moleculair en cellulair niveau te karakteriseren na blootstelling van Escherichia coli aan dodelijke doses ofloxacine.

Populatie- en eencellige analyse van antibioticapersistentie in Escherichia coli

Antibiotic persistence refers to the capacity of small bacterial subpopulations to transiently tolerate high doses of bactericidal antibiotics. Upon ...

Het hier beschreven protocol biedt een integratieve methode die klassieke microbiologische assays combineert met single-cell live imaging om Escherichia coli persistercellen te karakteriseren na behandeling met een hoog ofloxacinegehalte. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het analyseren van persistentiefenomeen op populatie- en eencellig niveau. Het combineren van populatie- en eencellige analyse maakt de moleculaire en cellulaire karakterisering van het persistentiefenotype mogelijk.Om te beginnen, streep de bacteriestam van belang van een bevroren glycerolvoorraad op een LB-agarplaat en incuber 's nachts bij 37 graden Celsius gedurende een periode van 15 tot 19 uur om enkele kolonies te verkrijgen. Ent een geïsoleerde kolonie in een glazen buis met vijf milliliter MOPS-groeimedium aangevuld met 0,4% glucose en voeg, indien nodig, een selectief antibioticum toe aan het medium. Plaats de buis in een schuddende incubator bij 37 graden Celsius en 180 tpm 's nachts.Centrifugeer de volgende dag een milliliter cultuur van 2.300 g gedurende drie minuten om de cellen te pelleteren en resuspensie van de pellet voorzichtig met hetzelfde volume PBS. Meet de OD op 600 nanometer en bereken het volume dat nodig is voor een initiële OD600 van 0,01 in een eindvolume van twee milliliter. Voeg vervolgens twee milliliter MOPS-glycerol 0,4% medium toe aan een put met een transparante bodem, 24-putplaat en ent met het berekende nachtelijke kweekvolume.Plaats de 24-putplaat in een geautomatiseerde microplaatlezer om de OD600 gedurende 24 uur te bewaken. Stel de microplaatlezer in om de OD600 elke 15 minuten te meten bij een temperatuur van 37 graden Celsius en met een hoge omlooprotatie van 140 tpm. Smelt 100 milliliter LB-agar en bewaar de kolf op 55 graden Celsius om stolling te voorkomen.Bereid zes kleine glazen kolven en pipetteer vijf milliliter vloeibaar LB-agarmedium in elke kolf met behulp van een steriele pipet. Neem 10 microliter van de vijf milligram per milliliter loxacine stockoplossing en verdun in 90 microliter ultrapuur water. Voeg toenemende volumes van de verdunde ofloxacine toe aan elk van de zes glazen kolven met LB-agarmedium om een eindconcentratie van nul tot 0,1 microgram per milliliter ofloxacine te krijgen.Meng de oplossing door de kolven meerdere keren te draaien en giet de met antibiotica toegevoegde LB-agarmedia in een kweekplaat met zes putten. Laat de agar afkoelen tot het stolt en droog de plaat voor gebruik. Verdun een nachtelijke bacteriecultuur tot een uiteindelijke celdichtheid van één maal 10 tot de zevende CFU per milliliter met PBS.Spot twee microliter verdund cultuur op elk putje van de gedroogde zesputplaat. Laat de vlekken drogen voordat je de plaat een nacht in een couveuse bij 37 graden Celsius plaatst. Controleer de volgende dag bij welke ofloxacineconcentratie de groei van bacteriekolonies wordt geremd.Giet ongeveer 25 milliliter van de bereide LB-agar in een petrischaal. Voeg vervolgens vijf tot acht steriele glaskralen toe aan elke gestolde en gedroogde plaat. Keer de platen om en label ze.Bereid vervolgens tienvoudige seriële verdunningsglasbuizen voor die 900 microliter 0,01-molaire magnesiumsulfaatoplossing bevatten. Verdun in een glazen buis een nachtcultuur in vers en temperatuuraangepast medium tot een uiteindelijke OD600 van ongeveer 0,001 en laat de cultuur 's nachts in een incubator groeien. De volgende dag, wanneer de OD600 0,3 bereikt, brengt u 100 microliter van de cultuur over voor verdunning volgens de spottestgegevens.Voer een tienvoudige seriële verdunning van de bacteriecultuur uit. Plaat vervolgens 100 microliter van de verdunde cultuur op de bereide LB-agarplaten. Voeg de gewenste concentratie ofloxacine toe aan de bacteriecultuur en blijf tijdens het schudden incuberen bij 37 graden Celsius.Trek op relevante tijdstippen 100 microliter van de cultuur op en verdun de cultuur dienovereenkomstig met de spottestgegevens. Plaat 100 microliter van de verdunde cultuur op de LB agar platen. Tel de volgende dag de kolonies van de 's nachts geïncubeerde platen bij de twee hoogste verdunningen waarvoor kolonies kunnen worden gedetecteerd.Bereken de overlevingsratio door de CFU per milliliter op elk tijdstip op de CFU per milliliter bij T0 te normaliseren en plot de log base 10 genormaliseerde waarde als functie van de tijd. Verwijder de conserveringsoplossing uit elk putje van de microfluïdische plaat en vervang deze door vers kweekmedium. Sluit de microfluïdische plaat af met het spruitstuksysteem door op de sealknop te klikken of via de microfluïdische software.Voer vervolgens op de microfluïdische software-interface een eerste priming-sequentie uit door op Run Liquid Priming Sequence te klikken. Incubeer de plaat in een thermostatisch geregelde kast van de microscoop bij 37 graden Celsius gedurende minimaal twee uur voordat u begint met de microscopie. Start vervolgens een tweede Run Liquid Priming Sequence voordat u met het experiment begint.Sluit de microfluïdische plaat af door op Unseal Plate op de microfluïdische software-interface te klikken. Vervang het medium in de putjes door 200 microliter vers medium, antibioticum bevattend vers medium en 0,01 OD verdund cultuurmonster in het verse medium. Na het afdichten van de microfluïdische plaat zoals eerder gedemonstreerd, plaatst u de plaat op het microscoopobjectief in de microscoopkast.Klik in de microfluïdische software op de Run Cell Loading Sequence om het laden van de cellen in de microfluïdische plaat mogelijk te maken. Stel een optimale focus in met behulp van de doorgelaten lichtmodus en selecteer verschillende interessante gebieden waar een geschikt celaantal van maximaal 300 cellen per veld kan worden waargenomen. Bewerk in de microfluïdische software de Run a Custom Sequence om de injectie van vers medium bij 6,9 kilopascal gedurende zes uur te programmeren naar putjes één en twee, gevolgd door het medium met antibioticum bij 6,9 kilopascal of zes uur naar goed drie, en ten slotte het verse medium met 6,9 kilopascal gedurende 24 uur naar putjes vier en vijf.Voer microscopiebeelden uit in time-lapse-modus met één frame om de 15 minuten met behulp van doorgelaten licht en de excitatielichtbron voor de fluorescerende reporter en start het microfluïdische programma. Open de ImageJ- of Fiji-software op de computer en sleep de hyperstack time-lapse-microscopieafbeeldingen naar de Fiji-laadbalk. Gebruik Afbeelding, gevolgd door Kleur en vervolgens Samengesteld maken om de verschillende kanalen van de hyperstack samen te voegen.Gebruik Afbeelding, Kleur en vervolgens Kanalen rangschikken als de kanalen niet overeenkomen met de gewenste kleur. Open de MicrobeJ-plug-in en detecteer de bacteriële cellen met behulp van de handmatige bewerkingsinterface. Verwijder de automatisch gedetecteerde cellen en schets de persistercellen handmatig frame voor frame.Gebruik na detectie het pictogram Resultaat in de handmatige bewerkingsinterface van MicrobeJ om een ResultJ-tabel te genereren. Gebruik de tabel ResultJ om inzicht te krijgen in de verschillende parameters van de eencellige analyse en sla het ResultJ-bestand op. De MIC van ofloxacine voor beide stammen werd vastgesteld op 0,06 microgram per milliliter, wat aangeeft dat de hupA-mCherry-fusie de gevoeligheid van ofloxacine niet beïnvloedde in vergelijking met de isogene wild-type stam.De spottest toonde geïsoleerde klonen met geschikte verdunningen in de loop van de tijd, bijvoorbeeld 10 tot de negatieve vijfde verdunning op tijdstip nul. In de time-kill assay werd een typische bifasische curve waargenomen waarbij de eerste helling de snelle dood van de niet-persisterende populatie weerspiegelt. De tweede fase toonde een langzamer dodingspercentage, wat de aanwezigheid van drugstolerante persistercellen onthulde.Met name de time-kill curve laat zien dat het hupA-mCherry fusie-eiwit de time-kill kinetiek niet beïnvloedde. In het microfluïdische experiment geeft de eerste groeifase aan dat cellen levensvatbaar waren en zich deelden vóór de behandeling met ofloxacine. Na deze eerste groeifase werd de celdeling geblokkeerd zodra het antibioticum de cellen bereikte.Na behandeling met ofloxacine, na perfusie met vers medium, was de overgrote meerderheid van de cellen niet in staat om de groei te hervatten. Daarentegen kan een kleine subpopulatie uitrekken en filamenteuze cellen genereren, die worden gedefinieerd als de persistercellen. Het delende persisterfilament genereerde meerdere dochtercellen, waarvan de meeste op dezelfde manier begonnen te groeien en delen als onbehandelde cellen.De toename van de cellengte correleerde met een toename van de totale mCherry-fluorescentie-intensiteit, die de replicatieherstart en een toename van de nucleoïde-abundantie weerspiegelt. Bij het gebruik van een stam met een intracellulaire reporter om persistentie te bestuderen, is het imperend dat de aanwezigheid van de reporter de groei, MIC en het doden niet verstoort in vergelijking met een wildtype stam. De hier beschreven procedure kan worden toegepast op andere aandoeningen en bacteriesoorten om cellulaire reacties op veranderende omgevingen of stress te controleren.Door andere fluorescerende reporters in een identieke opstelling te gebruiken, kunnen nieuwe inzichten in de fysiologie van persistercellen worden onderzocht.

Research

JoVE Journal

Biology

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Een test voor het meten van de activiteit van de Escherichia coli Induceerbare Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening van Fungal endoglucanase activiteit in Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Het in kaart brengen Bacteriële Functionele Netwerken en Wegen in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Gebruik van synthetische Genetische Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identificatie van eiwit complexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Met Sequential Peptide Affinity Purification in combinatie met tandem massaspectrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid protocol voor de bereiding van Elektrocompetente<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detectie van Levende<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 cellen door PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Niet-chromatografische zuivering van recombinant elastine-achtige polypeptiden en hun Fusies met peptiden en eiwitten van<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

De veelzijdige voordelen van Protein Co-expressie in<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

Methode voor het labelen van afschriften in individuele Escherichia coli cellen voor Single-molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie experimenten

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...