Name: population and single-cell analysis of antibiotic persistence in escherichia coli
Uploaded: 2023-03-24T13:50:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli at JoVE.com

העבודה במעבדת ואן מלדרן נתמכת על ידי פעולות ARC 2018-2023, Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS CDR J.0182.21F). T.O. נתמך על ידי מלגת ULB. T.S. נתמכת על ידי מלגת FRIA (FNRS). J.C. נתמך על ידי מלגת פוסט-דוקטורט "chargé de recherches" (FNRS).

<ol>
	<li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitions+and+guidelines+for+research+on+antibiotic+persistence.">Definitions and guidelines for research on antibiotic persistence.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (7), 441-448 (2019).</li><li>Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+between+resistance,+tolerance+and+persistence+to+antibiotic+treatment.">Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).</li><li>Pribis, J. P., Zhai, Y., Hastings, P. J., Rosenberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+mutagenesis,+gambler+cells,+and+stealth+targeting+antibiotic-induced+evolution.">Stress-induced mutagenesis, gambler cells, and stealth targeting antibiotic-induced evolution.</a> mBio. 13 (3), 01074 (2022).</li><li>Molina-Quiroz, R. C., Lazinski, D. W., Camilli, A., Levy, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-sequencing+analysis+unveils+novel+genes+involved+in+the+generation+of+persister+cells+in+uropathogenic+Escherichia+coli.">Transposon-sequencing analysis unveils novel genes involved in the generation of persister cells in uropathogenic Escherichia coli.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6907-6910 (2016).</li><li>Cameron, D. R., Shan, Y., Zalis, E. A., Isabella, V., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+determinant+of+persister+cell+formation+in+bacterial+pathogens.">A genetic determinant of persister cell formation in bacterial pathogens.</a> Journal of Bacteriology. 200 (17), 00303-00318 (2018).</li><li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+involved+in+bacteriostatic+antibiotic-induced+persister+formation.">Identification of genes involved in bacteriostatic antibiotic-induced persister formation.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 413 (2018).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+genes+involved+in+Escherichia+coli+persistence+to+tosufloxacin.">Identification of novel genes involved in Escherichia coli persistence to tosufloxacin.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 581986 (2020).</li><li>Verstraeten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obg+and+membrane+depolarization+are+part+of+a+microbial+bet-hedging+strategy+that+leads+to+antibiotic+tolerance.">Obg and membrane depolarization are part of a microbial bet-hedging strategy that leads to antibiotic tolerance.</a> Molecular Cell. 59 (1), 9-21 (2015).</li><li>Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+persister+fractions+suggests+different+mechanisms+of+formation+among+environmental+isolates+of+E.+coli.">Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli.</a> BMC Microbiology. 13 (1), 25 (2013).</li><li>Huemer, M., Mairpady Shambat, S., Brugger, S. D., Zinkernagel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+and+persistence-Implications+for+human+health+and+treatment+perspectives.">Antibiotic resistance and persistence-Implications for human health and treatment perspectives.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51034 (2020).</li><li>Wilmaerts, D., Windels, E. M., Verstraeten, N., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+mechanisms+leading+to+persister+formation+and+awakening.">General mechanisms leading to persister formation and awakening.</a> Trends in Genetics. 35 (6), 401-411 (2019).</li><li>Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ploidy+is+an+important+determinant+of+fluoroquinolone+persister+survival.">Ploidy is an important determinant of fluoroquinolone persister survival.</a> Current Biology. 31 (10), 2039-2050 (2021).</li><li>Lemma, A. S., Soto-Echevarria, N., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoroquinolone+persistence+in+Escherichia+coli+requires+DNA+repair+despite+differing+between+starving+populations.">Fluoroquinolone persistence in Escherichia coli requires DNA repair despite differing between starving populations.</a> Microorganisms. 10 (2), 286 (2022).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li><li>Morawska, L. P., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+tolerance+in+environmentally+stressed+Bacillus+subtilis:+Physical+barriers+and+induction+of+a+viable+but+nonculturable+state.">Antibiotic tolerance in environmentally stressed Bacillus subtilis: Physical barriers and induction of a viable but nonculturable state.</a> microLife. 3, (2022).</li><li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+persisters+enabled+by+a+&#223;-lactam-induced+filamentation+method+reveals+their+stochastic+single-cell+awakening.">Enrichment of persisters enabled by a &#223;-lactam-induced filamentation method reveals their stochastic single-cell awakening.</a> Communications Biology. 2 (1), 426 (2019).</li><li>Leygeber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+microbial+population+heterogeneity-Expanding+the+toolbox+of+microfluidic+single-cell+cultivations.">Analyzing microbial population heterogeneity-Expanding the toolbox of microfluidic single-cell cultivations.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (23), 4569-4588 (2019).</li><li>Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Escherichia+coli+growth+rate+to+osmotic+shock.">Response of Escherichia coli growth rate to osmotic shock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7807-7812 (2014).</li><li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starvation+induces+shrinkage+of+the+bacterial+cytoplasm.">Starvation induces shrinkage of the bacterial cytoplasm.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (24), 2104686118 (2021).</li><li>Goode, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+Escherichia+coli+cells+have+a+lower+intracellular+pH+than+susceptible+cells+but+maintain+their+pH+in+response+to+antibiotic+treatment.">Persister Escherichia coli cells have a lower intracellular pH than susceptible cells but maintain their pH in response to antibiotic treatment.</a> mBio. 12 (4), 00909-00921 (2021).</li><li>Manuse, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persisters+are+a+stochastically+formed+subpopulation+of+low-energy+cells.">Bacterial persisters are a stochastically formed subpopulation of low-energy cells.</a> PLoS Biology. 19 (4), 3001194 (2021).</li><li>Fisher, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+imaging+of+E.+coli+nucleoid+organization+and+dynamics+in+living+cells.">Four-dimensional imaging of E. coli nucleoid organization and dynamics in living cells.</a> Cell. 153 (4), 882-895 (2013).</li><li>Cabral, D., Wurster, J., Belenky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+persistence+as+a+metabolic+adaptation:+Stress,+metabolism,+the+host,+and+new+directions.">Antibiotic persistence as a metabolic adaptation: Stress, metabolism, the host, and new directions.</a> Pharmaceuticals. 11 (1), 14 (2018).</li><li>Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar+and+broth+dilution+methods+to+determine+the+minimal+inhibitory+concentration+(MIC)+of+antimicrobial+substances.">Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.</a> Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).</li><li>Goormaghtigh, F., Van Melderen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+and+characterization+of+Escherichia+coli+persister+cells+to+ofloxacin+in+exponential+cultures.">Single-cell imaging and characterization of Escherichia coli persister cells to ofloxacin in exponential cultures.</a> Science Advances. 5 (6), (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicrobeJ,+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis.">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nature Microbiology. 1 (7), 16077 (2016).</li><li>Odsbu, I., Skarstad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+compaction+in+the+early+part+of+the+SOS+response+is+dependent+on+RecN+and+RecA.">DNA compaction in the early part of the SOS response is dependent on RecN and RecA.</a> Microbiology. 160 (5), 872-882 (2014).</li><li>Pham, T. D. M., Ziora, Z. M., Blaskovich, M. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quinolone+antibiotics.">Quinolone antibiotics.</a> MedChemComm. 10 (10), 1719-1739 (2019).</li><li>Drlica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quinolones:+Action+and+resistance+updated.">Quinolones: Action and resistance updated.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 9 (11), 981-998 (2009).</li><li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+antibiotics+kill+bacteria:+From+targets+to+networks.">How antibiotics kill bacteria: From targets to networks.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 423-435 (2010).</li><li>Reyes-Lamothe, R., Sherratt, D. J., Leake, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+and+architecture+of+active+DNA+replication+machinery+in+Escherichia+coli.">Stoichiometry and architecture of active DNA replication machinery in Escherichia coli.</a> Science. 328 (5977), 498-501 (2010).</li><li>Lesterlin, C., Ball, G., Schermelleh, L., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA+bundles+mediate+homology+pairing+between+distant+sisters+during+DNA+break+repair.">RecA bundles mediate homology pairing between distant sisters during DNA break repair.</a> Nature. 506 (7487), 249-253 (2014).</li><li>Alexeeva, S., Gadella, T. W. J., Verheul, J., Verhoeven, G. S., Den Blaauwen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+interactions+of+early+and+late+assembling+division+proteins+in+Escherichia+coli+cells+resolved+by+FRET:+Bacterial+division+studied+by+spectral+FRET.">Direct interactions of early and late assembling division proteins in Escherichia coli cells resolved by FRET: Bacterial division studied by spectral FRET.</a> Molecular Microbiology. 77 (2), 384-398 (2010).</li><li>Miesenb&#246;ck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Yaginuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+ATP+concentrations+in+a+single+bacterial+cell+population+revealed+by+quantitative+single-cell+imaging.">Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging.</a> Scientific Reports. 4, 6522 (2014).</li><li>Ermakova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+genetically+encoded+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide.">Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nature Communications. 5, 5222 (2014).</li><li>Kapuscinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAPI:+A+DNA-specific+fluorescent+probe.">DAPI: A DNA-specific fluorescent probe.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

הפרוטוקול המוצג במאמר זה מאפשר ניתוח של פנוטיפ ההתמדה שנצפה בתגובה לטיפול אנטיביוטי באוכלוסייה וברמת התא הבודד. הניסויים בוצעו עם זן E. coli MG1655, אשר גדל בתווך מוגדר כימית (MOPS גליצרול 0.4%). מבחני הרג בזמן וניסויים במיקרוסקופ בוצעו על תרביות פאזה מעריכית. השתמשנו ב-OFX, פלואורוקינולון, בריכוז של 5 מיקרוגרם·מ"ל−1 כדי לחשוף את התאים המתמידים. הגישות המתוארות כאן יכולות להיות מיושמות על אנטיביוטיקה חיידקית אחרת, כגון β-lactams, aminoglycosides, או תרכובות מיקרוביאליות31. בהתאם לכך, ניתן להשתמש בזני חיידקים אחרים, מדיה או תנאי גידול. ניטור איחוי פלואורסצנטי שונה במערך דומה לזה המתואר כאן יכול להיות שימושי למעקב אחר תהליכים תאיים כגון שכפול דנ"א32, תיקון דנ"א25,33 וחלוקת תאים34 לפני, במהלך ואחרי הטיפול האנטיביוטי. באופן דומה, ניתן לנצל כתבים פלואורסצנטיים כדי לחקור היבטים שונים של פיזיולוגיה של התא, כגון רמות pH 35, ATP36 או ROS37. לחלופין לאיחוי פלואורסצנטי, ניתן ליישם גם צבעים כימיים. לדוגמה, היתוך hupA-mCherry יכול להיות מוחלף על ידי 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), צבע פלואורסצנטי שמכתים DNA38. עם זאת, יש להימנע מביצוע מיקרוסקופ בהילוך מהיר בשילוב עם צבעים פלואורסצנטיים כאלה, מכיוון שטכניקות צביעה אלה יכולות להפריע לדינמיקה של מחזור התא במהלך ניסויים בהילוך מהיר. לחלופין, ניסויים כאלה יכולים להיות מוחלפים על ידי ניתוח מסלול זמן של הדמיית בזק בנקודות זמן רלוונטיות.
בעוד שכתבים פלואורסצנטיים כאלה מועילים, אין להזניח את כמות המידע שניתן לחלץ באמצעות ניתוח תמונות עם ניגודיות פאזה. כאן, עקבנו אחר התפתחות אורך התא לאורך שלבי הגדילה, הטיפול ב-OFX וההתאוששות. פרמטרים אחרים המבוססים על תמונות עם ניגודיות פאזה, כגון רוחב התא, עוצמת ניגודיות הפאזה והעקמומיות של תאי החיידקים, יכולים גם הם להיות מופקים בקלות באמצעות תוכנה מתאימה, כגון MicrobeJ27.
לסיכום, ההליך המתואר כאן יכול להיות מיושם על תנאים אחרים ומיני חיידקים כדי לנטר תגובות תאיות לסביבות משתנות או גורמי עקה18,19. על ידי שימוש בכתבים פלואורסצנטיים אחרים (כתבי תמלול ותרגום, צבע כימי) בשילוב עם ניתוח אוכלוסייה, כגון ציטומטריית זרימה / FACS, ניתן להתייחס לשאלות מעניינות במסגרת רב-ממדית.

פרוטוקול זה נועד לנתח את פנוטיפ ההתמדה החיידקית בתגובה לטיפול אנטיביוטי ספציפי ברמת התא הבודד והאוכלוסייה. התמדה מתארת את היכולת של תת-אוכלוסיות קטנות בתוך אוכלוסייה איזוגנית לסבול מינונים גבוהים של אנטיביוטיקה חיידקית (פלואורוקינולונים, אמינוגליקוזידים, β-לקטמים וכו '), כאשר הריכוז המעכב המינימלי (MIC) של מה שמכונה תאים מתמידים זהה לזה של רוב האוכלוסייה. דינמיקת הרג ביפאזית, כאשר מודדים הישרדות חיידקים לאורך זמן בנוכחות אנטיביוטיקה, חושפת את נוכחותם של תאים עמידים לתרופות באופן חולף, עם חיסול מהיר ראשוני של התאים שאינם מתמידים, ואחריו קצב הרג איטי בהרבה של התאים המתמידים. עם הסרת אנטיביוטיקה, תאים אלה יוצרים אוכלוסייה זהה גנטית המציגה דינמיקת הרג דומה כאשר מטופלים באותה אנטיביוטיקה 1,2. בניגוד להתמדה, עמידות לאנטיביוטיקה מוגדרת ברמת האוכלוסייה והיא בדרך כלל תוצאה של מוטציות דה נובו או העברה גנטית אופקית של פלסמיד3 המעניק עמידות. בעוד שהמוטציות האחראיות לעמידות ממוקמות לרוב ביעד התרופה או באזורים הפרו-מוטוריים של משאבות השטף של התרופה, גנים המשנים את תדירות ההתמדה שזוהו על ידי גישות ניתוח מוטציות רחבות גנום וממוקדות הוכיחו את עצמם כרבים ומגוונים 2,3,4,5,6,7,8 . לכן, סביר להניח שתאי חיידקים יכולים להיכנס למצב המתמיד דרך מסלולים מרובים 9,10,11, ויש צורך בגישות לחקור את תופעת ההתמדה ברמת התא הבודד כדי לאפיין את הפיזיולוגיה של תאים מתמידים אלה.
הפיתוח האחרון של כלים מיקרופלואידים המשמשים בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי סלל את הדרך לאפיון פנוטיפ ההתמדה והדגיש את תפקידם של תהליכים תאיים מרכזיים, כגון שכפול כרומוזומים12, תיקון DNA 13 וחלוקת תאים14, ביצירת תאים מתמידים. במאמר זה, אנו מתארים גישה משולבת המשלבת בדיקות מיקרוביולוגיה קלאסיות עם הדמיה חיה של תא בודד כדי לאפיין תאים מתמידים שנוצרו בתרביות Escherichia coli הגדלות באופן אקספוננציאלי וטופלו במינון גבוה של אופלוקסצין. הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות מיושם כדי לחקור את תופעת ההתמדה האנטיביוטית במינים חיידקיים אחרים, כגון Bacillus subtilis15, או מצבים (למשל, התמדה אנטיביוטית לאחר טיפול β-lactam 16) וניתן בקלות לשנות אותו כדי לחקור את התופעות הרבות הקשורות להטרוגניות פנוטיפית17,18,19 . יתר על כן, ניתן לשלב את המערך המתואר במאמר זה עם כתבים פלואורסצנטיים אחרים כדי לחקור פרמטרים תאיים שונים בעלי עניין, כגון רמות תוך-תאיות של pH20 או ATP21 ברמת התא הבודד, אשר עשויים להפיק תובנות חדשות על תופעת ההתמדה האנטיביוטית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axio Observer</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2.2H2O&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02382.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX Microfluidic System&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CAX2-S0000&#160;</td>
			<td>Microfluidic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX2 FG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ONIX2 1.0.1&#160;</td>
			<td>Microfluidic software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX2 Manifold Basic&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CAX2-MBC20</td>
			<td>Manifold system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2.6H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02539.0100</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4.5H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02790.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td>Carbon source for MOPS glucose 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+)</td>
			<td></td>
			<td>BE10</td>
			<td>wt reference strain, lab strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) hupA-mCherry::FRT-kan-FRT</td>
			<td></td>
			<td>BE16</td>
			<td>HU-mCherry fusion integrated via P1 transduction at the native locus, lab strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4.7H2O&#160;</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>24244.232</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://fiji.sc/&#160;</td>
			<td>Image software; Schindelin et al. if used in publication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>56815</td>
			<td>Carbon source for MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR&#174; multiwell culture plate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M8812-100EA</td>
			<td>24-well clear flat bottom 2ml volume culture plate for automated plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768-1KG</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 digital camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td>Digital Image Acqusition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05099.1000</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05029.1000</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05153.0500</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Broth agar medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22700041</td>
			<td>Growth medium for plating assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Broth medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12780029</td>
			<td>Growth medium for MIC determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H2O&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05832.1000</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td>Dilution solution for bacterial survival assay used at 10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicrobeJ&#160;</td>
			<td>Imagej/Fiji plugin</td>
			<td>https://www.microbej.com/</td>
			<td>Microscopy image analysis plugin. Ducret et al.for in publication; Detection settings: For bacteria : Area (&#956;m2): 0,1-max; Length (&#956;m): 0,5-max; Width (&#956;m): 0,6-max; Range (&#956;m): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Plates CellASIC ONIX</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B04A-03-5PK&#160;</td>
			<td>Plate for microfluidic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2.4H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05927.0100</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, Free Acid ULTROL&#174; Grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>475898-500GM</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>SIgma-Aldrich</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)6Mo7O24.4H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01180.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01145.0500</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ofloxacin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>82419-36-1</td>
			<td>Fluoroquinolone antibiotic used to treat the bacterial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4, 1x</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Dilution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENESYS 10S UV-Visible Spectrophotometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>&#160;840-208200</td>
			<td>UV-Visible Spectrophotometer, Single/Six Cell Holder with PrinterMeasurement of optical density OD600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftMax Pro</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microplate reader software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-[Tris(hydroxym&#233;thyl)-m&#233;thyl]-glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08602.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss&#174; immersion Oil 518F</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Immersion oil to increase resolution of microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen3.2 Pro</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscopic image acquisition and processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4.7H2O&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08883.0500</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

population and single-cell analysis of antibiotic persistence in escherichia coli

התמדה אנטיביוטית מתייחסת ליכולת של תת-אוכלוסיות חיידקים קטנות לסבול באופן זמני מינונים גבוהים של אנטיביוטיקה קוטלת חיידקים. לאחר טיפול אנטיביוטי קוטל חיידקים, רוב אוכלוסיית החיידקים מומתת במהירות. השלב המהיר הראשון של ההרג מלווה בירידה משמעותית בקצב ההרג ככל שהתאים המתמידים נשארים בני קיימא. באופן קלאסי, התמדה נקבעת ברמת האוכלוסייה על ידי בדיקות זמן/הרג המבוצעות עם מינונים גבוהים של אנטיביוטיקה ועבור זמני חשיפה מוגדרים. בעוד ששיטה זו מספקת מידע על רמת התאים המתמידים ועל קינטיקה ההורגת, היא אינה משקפת את ההטרוגניות הפנימית בין תאים העומדת בבסיס תופעת ההתמדה. הפרוטוקול המתואר כאן משלב מבחני זמן/הרג קלאסיים עם אנליזה של תא בודד באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בזמן אמת. על ידי שימוש בכתבים פלואורסצנטיים מתאימים, הדמיה מיקרוסקופית של תאים חיים יכולה לספק מידע לגבי השפעות האנטיביוטיקה על תהליכים תאיים, כגון שכפול כרומוזומים והפרדתם, התארכות תאים וחלוקת תאים. שילוב של אוכלוסייה ואנליזה של תא בודד מאפשר אפיון מולקולרי ותאי של פנוטיפ ההתמדה.

Watch this Scientific Journal Video about Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli at JoVE.com

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

התמדה אנטיביוטית מתארת את היכולת של תת-אוכלוסיות קטנות בתוך אוכלוסייה איזוגנית רגישה לסבול באופן זמני מינונים גבוהים של אנטיביוטיקה קוטלת חיידקים. הפרוטוקול הנוכחי משלב גישות לאפיון פנוטיפ ההתמדה האנטיביוטית ברמה המולקולרית והתאית לאחר חשיפת Escherichia coli למינונים קטלניים של אופלוקסצין.

ניתוח אוכלוסייה ותא בודד של התמדה אנטיביוטית ב- Escherichia coli

Antibiotic persistence refers to the capacity of small bacterial subpopulations to transiently tolerate high doses of bactericidal antibiotics. Upon ...

הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה אינטגרטיבית המשלבת בדיקות מיקרוביולוגיה קלאסיות עם הדמיה חיה של תא בודד כדי לאפיין תאים מתמידים של Escherichia coli לאחר טיפול גבוה באופלוקסצין. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא לנתח את תופעת ההתמדה ברמת האוכלוסייה והתא הבודד. שילוב של אוכלוסייה ואנליזה של תא בודד מאפשר אפיון מולקולרי ותאי של פנוטיפ ההתמדה.כדי להתחיל, פזרו את זן החיידקים המעניין ממלאי גליצרול קפוא על צלחת אגר LB, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה לתקופה של 15 עד 19 שעות כדי להשיג מושבות בודדות. יש לחסן מושבה מבודדת בצינור זכוכית המכיל חמישה מיליליטר של מדיום גידול MOPS בתוספת 0.4% גלוקוז, ובמידת הצורך להוסיף אנטיביוטיקה סלקטיבית למדיום. הניחו את הצינור באינקובטור רועד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-180 סל"ד למשך הלילה.למחרת, צנטריפוגה מיליליטר אחד של תרבית ב 2, 300 גרם במשך שלוש דקות כדי pellet את התאים, בעדינות resuspend את הגלולה עם אותו נפח של PBS. מדוד את ה-OD ב-600 ננומטר, וחשב את הנפח הדרוש ל-OD600 התחלתי של 0.01 בנפח סופי של שני מיליליטר. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של MOPS גליצרול 0.4% בינוני לתוך באר של צלחת שקופה, 24 בארות, וחסן עם נפח תרבית לילה מחושב.הכנס את הצלחת בעלת 24 הקידוחים לקורא מיקרו-צלחות אוטומטי כדי לפקח על OD600 למשך 24 שעות. הגדר את קורא המיקרו-לוחות למדוד את OD600 כל 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ועם סיבוב מסלול גבוה של 140 סל"ד. ממיסים 100 מיליליטר של אגר LB, וממלאים את הבקבוק ב 55 מעלות צלזיוס כדי למנוע התמצקות.הכינו שש צלוחיות זכוכית קטנות, ופיפטה חמישה מיליליטר של מדיום אגר LB נוזלי לכל בקבוק באמצעות פיפטה סטרילית. קח 10 מיקרוליטר של חמישה מיליגרם למיליליטר של תמיסת מלאי ofloxacin, ודלל 90 מיקרוליטר של מים טהורים במיוחד. הוסף נפחים הולכים וגדלים של ofloxacin מדולל לכל אחת משש צלוחיות זכוכית המכילות LB אגר בינוני כדי לקבל ריכוז סופי של אפס עד 0.1 מיקרוגרם למיליליטר של ofloxacin.מערבבים את התמיסה על ידי סיבוב הצלוחיות מספר פעמים, ויוצקים את מצע האגר LB שהוסיף אנטיביוטיקה לצלחת תרבית בת שש בארות. מניחים לאגר להתקרר עד להתמצקות, ומייבשים את הצלחת לפני השימוש. לדלל תרבית חיידקים בן לילה לצפיפות תאים סופית של פי 10 עד 7 CFU למיליליטר עם PBS.הבחינו בשני מיקרוליטרים של תרבית מדוללת על כל באר של צלחת שש בארות מיובשת. תנו לכתמים להתייבש לפני שתכניסו את הצלחת לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות למשך הלילה. למחרת, לבדוק באיזה ריכוז ofloxacin הצמיחה של מושבות חיידקים מעוכב.יוצקים כ-25 מיליליטר של אגר LB מוכן לתוך צלחת פטרי. לאחר מכן הוסיפו חמישה עד שמונה חרוזי זכוכית סטריליים לכל צלחת מוצקה ומיובשת. הפוך ותייג את הצלחות.לאחר מכן, הכינו צינורות זכוכית דילול סדרתי פי עשרה המכילים 900 מיקרוליטר של תמיסת מגנזיום סולפט 0.01 טוחנת. בצינור זכוכית, מדללים תרבית לילה בתווך טרי ומותאם טמפרטורה ל-OD600 סופי של כ-0.001, ומאפשרים לתרבית לגדול בן לילה באינקובטור. למחרת, כאשר OD600 מגיע 0.3, להעביר 100 מיקרוליטר של התרבות לדילול על פי נתוני הבדיקה נקודתית.לבצע דילול סדרתי פי עשרה של תרבית החיידקים. ואז צלחת 100 מיקרוליטר של התרבות מדולל על לוחות אגר LB מוכן. מוסיפים את הריכוז הרצוי של אופלוקסצין לתרבית החיידקים, וממשיכים לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תוך כדי רעידה.בנקודות הזמן הרלוונטיות, משכו 100 מיקרוליטר של התרבית, ודללו את התרבית בהתאם לנתוני הבדיקה הנקודתית. צלחת 100 מיקרוליטר של התרבות המדוללת על צלחות אגר LB. למחרת, ספרו את מושבות הלוחות המודגרים בלילה בשני הדילולים הגבוהים ביותר שעבורם ניתן לזהות מושבות.חשב את יחס ההישרדות על ידי נרמול CFU למיליליטר בכל נקודת זמן ב- CFU למיליליטר ב- T0, והתווה את בסיס היומן 10 ערך מנורמל כפונקציה של זמן. הסר את תמיסת השימור מכל באר של הצלחת המיקרופלואידית, והחלף אותה במדיום תרבית טרי. אטמו את הצלחת המיקרופלואידית עם מערכת הסעפת על ידי לחיצה על כפתור האטימה או באמצעות התוכנה המיקרופלואידית.לאחר מכן, בממשק התוכנה microfluidic, בצע רצף ראשוני ראשון על ידי לחיצה על Run Liquid Priming Sequence. יש לדגור על הצלחת בארון מבוקר תרמוסטטית של המיקרוסקופ בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות לפני תחילת ההדמיה במיקרוסקופיה. לאחר מכן התחל רצף הפעלה נוזלי שני לפני תחילת הניסוי.אטם את הצלחת המיקרופלואידית על ידי לחיצה על Unseal Plate בממשק התוכנה המיקרופלואידית. החליפו את התווך בבארות ב-200 מיקרוליטר מדיום טרי, אנטיביוטיקה המכילה מדיום טרי, ודגימת תרבית מדוללת 0.01 OD בתווך הטרי. לאחר איטום הצלחת המיקרופלואידית כפי שהודגם קודם, הניחו את הצלחת על מטרת המיקרוסקופ בתוך ארון המיקרוסקופ.בתוכנה microfluidic, לחץ על Run Cell Loading Sequence כדי לאפשר טעינה של התאים לתוך הצלחת microfluidic. הגדר מיקוד אופטימלי באמצעות מצב האור המשודר, ובחר מספר אזורי עניין שבהם ניתן לצפות במספר תאים מתאים של עד 300 תאים לכל שדה. בתוכנה המיקרופלואידית, ערוך את Run a Custom Sequence כדי לתכנת את הזרקת התווך הטרי ב-6.9 קילופסקל למשך שש שעות לבארות אחת ושתיים, לאחר מכן התווך המכיל אנטיביוטיקה ב-6.9 קילופסקל או שש שעות לבאר שלוש, ולבסוף התווך הטרי ב-6.9 קילופסקל למשך 24 שעות לבארות ארבע וחמש.בצע הדמיה מיקרוסקופית במצב קיטועי זמן עם פריים אחד כל 15 דקות באמצעות האור המשודר ומקור אור העירור עבור כתב הפלואורסצנט, והתחל את התוכנית המיקרופלואידית. פתח את תוכנת ImageJ או Fiji במחשב וגרור את התמונות במיקרוסקופ עם קיטועי זמן של hyperstack לסרגל הטעינה של פיג'י. השתמשו ב'תמונה', ולאחר מכן 'צבע', ולאחר מכן 'צור ללא הפרדות צבע' כדי להתיך את הערוצים השונים של ערימת ההיפר-ערימה.השתמשו ב'תמונה', 'צבע' ולאחר מכן 'סדרו ערוצים' אם הערוצים אינם תואמים לצבע הרצוי. פתחו את תוסף MicrobeJ וזהו את תאי החיידקים באמצעות ממשק העריכה הידני. מחק את התאים שזוהו באופן אוטומטי ושרטט באופן ידני את התאים המתמידים בעלי תחומי העניין מסגרת אחר מסגרת.לאחר הזיהוי, השתמש בסמל התוצאה בממשק העריכה הידני של MicrobeJ כדי ליצור טבלת ResultJ. השתמש בטבלת ResultJ כדי לקבל תובנות לגבי פרמטרים שונים המעניינים את ניתוח התא הבודד ושמור את קובץ ResultJ. ה-MIC של אופלוקסצין עבור שני הזנים נקבע כ-0.06 מיקרוגרם למיליליטר, מה שמצביע על כך שהיתוך hupA-mCherry לא השפיע על הרגישות של אופלוקסצין בהשוואה לזן איזוגני מסוג בר.הבדיקה הספוטית הראתה שיבוטים מבודדים בדילול מתאים לאורך זמן, לדוגמה, 10 לדילול החמישי השלילי בזמן אפס. במבחן ההרג בזמן נצפתה עקומה ביפאזית טיפוסית שבה המדרון הראשון משקף את ההרג המהיר של האוכלוסייה הלא מתמידה. השלב השני הראה קצב הרג איטי יותר, וחשף את נוכחותם של תאים מתמידים עמידים לתרופות.יש לציין שעקומת הזמן-הרג מראה כי חלבון ההיתוך hupA-mCherry לא השפיע על קינטיקה של הרג זמן. בניסוי המיקרופלואיד, שלב הגידול הראשון מצביע על כך שהתאים היו בני קיימא והתחלקו לפני הטיפול באופלוקסצין. לאחר שלב גדילה ראשון זה, חלוקת התאים נחסמה ברגע שהאנטיביוטיקה הגיעה לתאים.לאחר טיפול באופלוקסצין, על זילוח עם מדיום טרי, הרוב המכריע של התאים לא הצליחו לחדש את הצמיחה. לעומת זאת, תת-אוכלוסייה קטנה יכולה להתארך ולייצר תאים נימיים, המוגדרים כתאים המתמידים. חוט הלהט המתמיד המתחלק יצר תאי בת מרובים, שרובם החלו לגדול ולהתחלק בדומה לתאים לא מטופלים.העלייה באורך התא הייתה בקורלציה עם עלייה בעוצמה הפלואורסצנטית הכוללת של mCherry, המשקפת הפעלה מחדש של השכפול ועלייה בשפע הנוקלאואידים. כאשר משתמשים בזן המכיל כתב תוך-תאי לחקר התמדה, חשוב שנוכחותו של המדווח לא תפריע לצמיחה, מיקרופון והרג בהשוואה לזן פראי. ההליך המתואר כאן יכול להיות מיושם על תנאים אחרים ומיני חיידקים כדי לנטר תגובות תאיות לסביבות משתנות או לעקה.על ידי שימוש בכתבים פלואורסצנטיים אחרים במערך זהה, ניתן לחקור תובנות חדשות על הפיזיולוגיה של תאים מתמידים.

Research

JoVE Journal

Biology

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Assay למדידת פעילות Escherichia coli ועין מתנהלת ליזין Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

ראפיד פרוטוקול להכנת Electrocompetent<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; ו<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

איתור של שידור חי<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; O157: H7 תאים על ידי PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

טיהור ללא chromatographic של פוליפפטידים דמויי אלסטין רקומביננטי וFusions עם פפטידים וחלבונים מן<em&gt; חיידקי Escherichia</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

תועלת רבה פנים של Co-ביטוי חלבון ב<em&gt; Coli Escherichia</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

שיטת תיוג תעתיקים בתאים בודדים Escherichia coli לניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...