एस्चेरिचिया कोलाई में एंटीबायोटिक दृढ़ता की जनसंख्या और एकल-कोशिका विश्लेषण

यहां वर्णित प्रोटोकॉल उच्च ओफ्लॉक्सिन उपचार के बाद एस्चेरिचिया कोलाई परसिस्टर कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए एकल-कोशिका लाइव इमेजिंग के साथ शास्त्रीय माइक्रोबायोलॉजी परख के संयोजन की एक एकीकृत विधि प्रदान करता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ जनसंख्या और एकल-कोशिका स्तर पर दृढ़ता की घटना का विश्लेषण करना है। जनसंख्या और एकल-कोशिका विश्लेषण का संयोजन दृढ़ता फेनोटाइप के आणविक और सेलुलर लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है।

शुरू करने के लिए, एलबी एगर प्लेट पर जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक से रुचि के जीवाणु तनाव को लकीरें, और एकल कॉलोनियों को प्राप्त करने के लिए 15 से 19 घंटे की अवधि के लिए रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एक ग्लास ट्यूब में एक पृथक कॉलोनी को टीका लगाएं जिसमें 0.4% ग्लूकोज के साथ पूरक एमओपीएस विकास माध्यम के पांच मिलीलीटर होते हैं, और यदि आवश्यक हो, तो माध्यम में एक चयनात्मक एंटीबायोटिक जोड़ें। ट्यूब को एक हिलने वाले इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और रात भर 180 आरपीएम पर रखें।

अगले दिन, कोशिकाओं को छर्रों को छर्रों के लिए तीन मिनट के लिए 2,300 ग्राम पर एक मिलीलीटर कल्चर सेंट्रीफ्यूज करें, और धीरे से पीबीएस की समान मात्रा के साथ गोली को फिर से निलंबित करें। 600 नैनोमीटर पर ओडी को मापें, और दो मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में 0.01 के प्रारंभिक ओडी 600 के लिए आवश्यक मात्रा की गणना करें। इसके बाद, दो मिलीलीटर एमओपीएस ग्लिसरॉल 0.4% मध्यम को पारदर्शी-तल, 24-वेल प्लेट के कुएं में जोड़ें, और रात भर की संस्कृति मात्रा के साथ टीका लगाएं।

24 घंटे के लिए OD600 की निगरानी करने के लिए 24-वेल प्लेट को एक स्वचालित माइक्रोप्लेट रीडर में रखें। 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर और 140 आरपीएम के उच्च कक्षीय रोटेशन के साथ हर 15 मिनट में ओडी 600 को मापने के लिए माइक्रोप्लेट रीडर सेट करें। एलबी एगर के 100 मिलीलीटर पिघलाएं, और जमने से बचने के लिए फ्लास्क को 55 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक करें।

छह छोटे ग्लास फ्लास्क तैयार करें, और बाँझ पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक फ्लास्क में पांच मिलीलीटर तरल एलबी एगर माध्यम तैयार करें। पांच मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर के 10 माइक्रोलीटर को लोक्सासिन स्टॉक समाधान लें, और अल्ट्राप्योर पानी के 90 माइक्रोलीटर में पतला करें। एलबी एगर माध्यम युक्त छह ग्लास फ्लास्क में से प्रत्येक में पतला ओफ्लोक्सासिन की बढ़ती मात्रा जोड़ें ताकि शून्य से 0.1 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर ओफ्लोक्सासिन की अंतिम एकाग्रता प्राप्त हो सके।

फ्लास्क को कई बार घुमाकर घोल को मिलाएं, और एंटीबायोटिक-एडेड एलबी एगर मीडिया को छह-वेल कल्चर प्लेट में डालें। आगर को जमने तक ठंडा होने दें, और उपयोग करने से पहले प्लेट को सुखाएं। पीबीएस के साथ प्रति मिलीलीटर प्रति मिलीलीटर एक गुना 10 से सातवें सीएफयू के अंतिम सेल घनत्व के लिए रात भर की जीवाणु संस्कृति को पतला करें।

सूखे छह-वेल प्लेट के हर कुएं पर पतला संस्कृति के दो माइक्रोलीटर पाएं। प्लेट को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखने से पहले धब्बों को सूखने दें। अगले दिन, जांचें कि किस ऑफलोक्सासिन एकाग्रता पर बैक्टीरिया कॉलोनियों की वृद्धि बाधित है।

तैयार एलबी एगर के लगभग 25 मिलीलीटर को पेट्री डिश में डालें। फिर प्रत्येक ठोस और सूखे प्लेट में पांच से आठ बाँझ ग्लास मोती जोड़ें। प्लेटों को इनवर्ट और लेबल करें।

इसके बाद, 0.01-मोलर मैग्नीशियम सल्फेट समाधान के 900 माइक्रोलीटर युक्त दस गुना सीरियल तनुकरण ग्लास ट्यूब तैयार करें। एक ग्लास ट्यूब में, ताजा और तापमान-समायोजित माध्यम में रात भर की संस्कृति को लगभग 0.001 के अंतिम OD600 तक पतला करें, और संस्कृति को एक इनक्यूबेटर में रात भर बढ़ने की अनुमति दें। अगले दिन, जब OD600 0.3 तक पहुंच जाता है, तो स्पॉट परख डेटा के अनुसार कमजोर पड़ने के लिए संस्कृति के 100 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करें।

बैक्टीरियल कल्चर का दस गुना सीरियल कमजोर पड़ना करें। फिर तैयार एलबी एगर प्लेटों पर पतला संस्कृति के 100 माइक्रोलीटर प्लेट करें। बैक्टीरियल कल्चर में ओफ्लोक्सासिन की वांछित एकाग्रता जोड़ें, और हिलाते समय 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करना जारी रखें।

प्रासंगिक समय बिंदुओं पर, संस्कृति के 100 माइक्रोलीटर वापस लें, और स्पॉट परख डेटा के अनुसार संस्कृति को पतला करें। एलबी एगर प्लेटों पर पतला संस्कृति के प्लेट 100 माइक्रोलीटर। अगले दिन, रात भर इनक्यूबेट की गई प्लेटों की कॉलोनियों को दो उच्चतम कमजोर पड़ने पर गिनें जिनके लिए कॉलोनियों का पता लगाया जा सकता है।

T0 पर CFU प्रति मिलीलीटर पर प्रत्येक समय बिंदु पर CFU प्रति मिलीलीटर सामान्यीकृत करके उत्तरजीविता अनुपात की गणना करें, और लॉग बेस 10 सामान्यीकृत मान को समय के फ़ंक्शन के रूप में प्लॉट करें। माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट के हर कुएं से संरक्षण समाधान को हटा दें, और इसे ताजा संस्कृति माध्यम से बदलें। सील बटन पर क्लिक करके या माइक्रोफ्लुइडिक सॉफ्टवेयर के माध्यम से कई गुना सिस्टम के साथ माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट को सील करें।

इसके बाद, माइक्रोफ्लुइडिक सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस पर, रन लिक्विड प्राइमिंग सीक्वेंस पर क्लिक करके पहला प्राइमिंग अनुक्रम करें। माइक्रोस्कोपी इमेजिंग शुरू करने से पहले कम से कम दो घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर माइक्रोस्कोप के थर्मोस्टेटिक रूप से नियंत्रित कैबिनेट में प्लेट को इनक्यूबेट करें। फिर प्रयोग शुरू करने से पहले एक दूसरा रन लिक्विड प्राइमिंग सीक्वेंस शुरू करें।

माइक्रोफ्लुइडिक सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस पर अनसील प्लेट पर क्लिक करके माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट को सील करें। कुओं में माध्यम को ताजा माध्यम के 200 माइक्रोलीटर, ताजा माध्यम युक्त एंटीबायोटिक और ताजा माध्यम में 0.01 ओडी पतला संस्कृति नमूने के साथ बदलें। माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट को सील करने के बाद, जैसा कि पहले दिखाया गया है, प्लेट को माइक्रोस्कोप कैबिनेट के अंदर माइक्रोस्कोप उद्देश्य पर रखें।

माइक्रोफ्लुइडिक सॉफ्टवेयर में, माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट में कोशिकाओं को लोड करने की अनुमति देने के लिए रन सेल लोडिंग अनुक्रम पर क्लिक करें। प्रेषित प्रकाश मोड का उपयोग करके एक इष्टतम फ़ोकस सेट करें, और रुचि के कई क्षेत्रों का चयन करें जहां प्रति क्षेत्र 300 कोशिकाओं तक की उपयुक्त सेल संख्या देखी जा सकती है। माइक्रोफ्लुइडिक सॉफ्टवेयर पर, एक और दो कुओं में छह घंटे के लिए 6.9 किलोपास्कल पर ताजा माध्यम के इंजेक्शन को प्रोग्राम करने के लिए एक कस्टम अनुक्रम को संपादित करें, इसके बाद 6.9 किलोपास्कल या छह घंटे से तीन तक एंटीबायोटिक युक्त माध्यम, और अंत में ताजा माध्यम 24 घंटे के लिए 6.9 किलोपास्कल पर चार और पांच कुओं में।

फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के लिए संचारित प्रकाश और उत्तेजना प्रकाश स्रोत का उपयोग करके हर 15 मिनट में एक फ्रेम के साथ टाइम-लैप्स मोड में माइक्रोस्कोपी इमेजिंग करें, और माइक्रोफ्लुइडिक प्रोग्राम शुरू करें। कंप्यूटर पर ImageJ या Fiji सॉफ़्टवेयर खोलें, और हाइपरस्टैक टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी छवियों को फिजी लोडिंग बार में खींचें। छवि का उपयोग करें, उसके बाद रंग, और फिर हाइपरस्टैक के विभिन्न चैनलों को फ्यूज करने के लिए कम्पोजिट बनाएं।

छवि, रंग का उपयोग करें, और फिर चैनल व्यवस्थित करें यदि चैनल वांछित रंग के अनुरूप नहीं हैं। MicrobeJ प्लगइन खोलें, और मैन्युअल संपादन इंटरफ़ेस का उपयोग करके जीवाणु कोशिकाओं का पता लगाएं। स्वचालित रूप से पता लगाए गए कक्षों को हटाएँ, और मैन्युअल रूप से फ्रेम द्वारा रुचि फ़्रेम के परसिस्टर कक्षों को रेखांकित करें.

पता लगाने के बाद, एक परिणामजे तालिका उत्पन्न करने के लिए MicrobeJ मैन्युअल संपादन इंटरफ़ेस में परिणाम आइकन का उपयोग करें। एकल-कक्ष विश्लेषण की रुचि के विभिन्न मापदंडों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए परिणामJ तालिका का उपयोग करें, और परिणामJ फ़ाइल सहेजें. दोनों उपभेदों के लिए ओफ्लोक्सासिन का एमआईसी 0.06 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर निर्धारित किया गया था, यह दर्शाता है कि हूपा-एमचेरी संलयन ने इसोजेनिक जंगली-प्रकार के तनाव की तुलना में ओफ्लोक्सासिन की संवेदनशीलता को प्रभावित नहीं किया।

स्पॉट परख ने समय के साथ उपयुक्त तनुकरण पर अलग-अलग क्लोन दिखाए, उदाहरण के लिए, समय शून्य पर नकारात्मक पांचवें कमजोर पड़ने के लिए 10। टाइम-किल परख में, एक विशिष्ट द्विध्रुवीय वक्र देखा गया था जहां पहला ढलान गैर-परसिस्टर आबादी की तेजी से हत्या को दर्शाता है। दूसरे चरण में धीमी हत्या दर दिखाई दी, जिससे दवा-सहिष्णु परसिस्टर कोशिकाओं की उपस्थिति का पता चला।

विशेष रूप से, टाइम-किल वक्र से पता चलता है कि एचयूपीए-एमचेरी फ्यूजन प्रोटीन ने टाइम-किल कैनेटीक्स को प्रभावित नहीं किया। माइक्रोफ्लुइडिक प्रयोग में, पहला विकास चरण इंगित करता है कि कोशिकाएं व्यवहार्य थीं और ओफ्लॉक्सासिन उपचार से पहले विभाजित थीं। इस पहले विकास चरण के बाद, जैसे ही एंटीबायोटिक कोशिकाओं तक पहुंचा, कोशिका विभाजन अवरुद्ध हो गया।

ओफ्लोक्सासिन उपचार के बाद, ताजा माध्यम के साथ छिड़काव पर, अधिकांश कोशिकाएं विकास को फिर से शुरू करने में असमर्थ थीं। इसके विपरीत, एक छोटी उप-जनसंख्या फिलामेंटस कोशिकाओं को लम्बा और उत्पन्न कर सकती है, जिन्हें परसिस्टर कोशिकाओं के रूप में परिभाषित किया गया है। विभाजित परसिस्टर फिलामेंट ने कई बेटी कोशिकाओं को उत्पन्न किया, जिनमें से अधिकांश अनुपचारित कोशिकाओं के समान बढ़ने और विभाजित होने लगे।

सेल की लंबाई में वृद्धि कुल एमचेरी फ्लोरेसेंस तीव्रता में वृद्धि के साथ सहसंबद्ध है, जो प्रतिकृति पुनरारंभ और न्यूक्लियोइड बहुतायत में वृद्धि को दर्शाती है। दृढ़ता का अध्ययन करने के लिए इंट्रासेल्युलर रिपोर्टर युक्त तनाव का उपयोग करते समय, यह शाही है कि रिपोर्टर की उपस्थिति जंगली प्रकार के तनाव की तुलना में विकास, एमआईसी और हत्या में हस्तक्षेप नहीं करती है। यहां वर्णित प्रक्रिया को बदलते वातावरण या तनाव के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए अन्य स्थितियों और बैक्टीरिया प्रजातियों पर लागू किया जा सकता है।

एक समान सेटअप में अन्य फ्लोरोसेंट संवाददाताओं का उपयोग करके, परसिस्टर कोशिकाओं के शरीर विज्ञान में नई अंतर्दृष्टि की जांच की जा सकती है।